一種含有熊果酸和環(huán)磷酰胺的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物組合物及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤及其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類生命健康，且其發(fā)病率呈逐年快速上升的趨 勢(shì)。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2000年全世界新發(fā)惡性腫瘤患者近1000萬(wàn)例，其發(fā)病 率僅次于心腦血管疾病?，F(xiàn)階段腫瘤治療手段包括外科手術(shù)治療、化學(xué)療法、放射治療等。 目前首選的治療手段為手術(shù)切除，但手術(shù)切除僅適用于少部分早期局限性腫瘤患者，且術(shù) 后常伴有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，化療是現(xiàn)階段最常用的腫瘤治療方法，常規(guī)的化療藥物如阿霉 素、順鉬、5-氟尿嘧啶等，存在毒副作用大、患者的耐受性差、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等問題。僅僅針對(duì) 單一環(huán)節(jié)的藥物或治療不可能取得理想的治療效果。即便是代表學(xué)科前沿方向的靶向治療 藥物，因其作用機(jī)制靶向性過強(qiáng)，導(dǎo)致臨床適應(yīng)人群少，且極易出現(xiàn)藥物耐藥和毒副反應(yīng)， 并未取得預(yù)期中的良好療效。因此，研發(fā)針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展多個(gè)環(huán)節(jié)的藥物或者研究多種 不同機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng)新療法成為學(xué)科發(fā)展的一個(gè)重要方向。目前，抗腫瘤藥物常 見機(jī)制包括抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡和壞死，誘導(dǎo)分化等。遺憾的是，目前常用的抗乳腺癌癌藥 物中，多數(shù)抗瘤效果單一，療效并不明顯。即使是一線藥物阿霉素、他莫昔芬等也存在著多 方面的問題。因此，研發(fā)具有高效低毒的多重抗瘤功能的新藥，或者探索多藥聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng) 新療法對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)乳腺癌的高發(fā)國(guó)度而言，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide, CP)是雙功能燒化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，其 與DNA發(fā)生交聯(lián)，抑制DNA合成，具有減低或停止細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。臨床上多用于惡性淋 巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，白血病、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等。但許多的 腫瘤患者在服用環(huán)磷酰胺后，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括惡心、嘔吐、骨髓抑制、胃痛、下瀉、脫 發(fā)、嗜睡等。
[0004] 熊果酸（Ursolic acid，UA)是一種五環(huán)三萜類化合物，其廣泛分布于枇杷葉、熊 果、山楂、白花蛇舌草等多種天然植物中，也是許多傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一，具有廣 泛的藥理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等。近些年來，UA尤以其低毒高效的特 點(diǎn)及多樣化的抗癌作用機(jī)制日益受到人們重視，顯示出較大的臨床應(yīng)用潛力和良好的應(yīng)用 前景。另一方面熊果酸具有較好的保肝抗炎功效，并可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。從而能夠克服 常規(guī)化療藥物毒性大、安全系數(shù)低的局限，在治療的同時(shí)副作用小、毒性低，顯示出較大的 臨床應(yīng)用潛力。但其抗癌活性有限，本領(lǐng)域常見的是對(duì)熊果酸的結(jié)構(gòu)改造方面，以改善其生 物利用度并提高其抗癌活性。經(jīng)修飾后的熊果酸衍生物活性有所提高，但是對(duì)正常細(xì)胞的 毒性也相應(yīng)提1?。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是在克服現(xiàn)有技術(shù)不足的前提下，提供一種能夠有效殺傷癌細(xì)胞并降 低對(duì)正常組織毒副作用的一種藥物組合物，其包含有活性成分熊果酸和環(huán)磷酰胺。
[0006] -種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于包含重量比為1-10:1的熊果酸和環(huán)磷酰 胺。
[0007] 優(yōu)選的，環(huán)磷酰胺和熊果酸的重量比為：2-5:1。
[0008] 所述抗腫瘤聯(lián)合藥物在制備抗腫瘤藥物制備中的應(yīng)用?？膳c藥學(xué)上可接受的載 體共同制成各種劑型：散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、粉針、乳劑、脂質(zhì)體、混懸劑、凝 膠劑、噴霧劑、氣霧劑、氣溶膠、粉霧劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑、栓劑、滴劑 或滴丸劑，在治療上也可通過各種給藥方式實(shí)現(xiàn)：口服給藥、注射給藥、呼吸道給藥、皮膚給 藥、粘膜給藥、腔道給藥等。
[0009] 在各種實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)重量比為1-10:1的熊果酸和環(huán)磷酰胺的聯(lián)合使用體 內(nèi)外均明顯的表現(xiàn)出比單用熊果酸或環(huán)磷酰胺更優(yōu)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。同時(shí)， 相對(duì)于單獨(dú)使用環(huán)磷酰胺，聯(lián)合用藥組對(duì)外周血的RBC、WBC、HGB以及LYMPH指標(biāo)均有所 改善，在一定程度上提升了以上指標(biāo)在血液中的含量。聯(lián)合用藥使得以上血液指標(biāo)在整個(gè) 實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均在正常范圍內(nèi)變動(dòng)，體現(xiàn)了在常規(guī)化療時(shí)聯(lián)合使用熊果酸，能產(chǎn)生"減毒增 效"的效果。兩者的混合制成的藥劑用在抗癌治療上可帶來的顯著優(yōu)點(diǎn)就在于"減毒增效"， 彌補(bǔ)單用其中某一種帶來的活性不足或是毒性高的缺陷。
【附圖說明】
[0010] 圖1熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制結(jié)果 圖2熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖抑制結(jié)果 圖3熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌細(xì)胞4T1增殖抑制結(jié)果 圖4熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)小鼠4T1惡性乳腺癌腫瘤變化情況 圖5熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)小鼠4T1惡性乳腺癌腫瘤瘤體積變化結(jié) 果 圖6熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)小鼠4T1惡性乳腺癌腫瘤抑制率的統(tǒng)計(jì) 分析結(jié)果。
[0011] 圖7熊果酸、環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用和聯(lián)合使用對(duì)給藥期間小鼠體重變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0013] 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0014] 實(shí)施例1 熊果酸和環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用以及聯(lián)合使用對(duì)乳腺癌的細(xì)胞毒性：考察了熊果酸和環(huán)磷 酰胺對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞系--MCF-7 (乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)、MDA-MB-231和4T1的細(xì)胞毒 性。
[0015] 抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞毒性來實(shí)現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT比色法測(cè)定了不同組合的藥物 對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性。
[0016] 具體步驟為：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的各細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化 后，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔IOOuL接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量控 制在5 X 104/mL，37°C，5%C02培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，加入配制好的不同濃度樣品，作用48h后每 孔加入100 μ L MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清每孔加入150 μ L DMS0,振蕩lOmin，待 完全溶解后，與酶標(biāo)免疫測(cè)定儀（Bio-Rad Model 550)測(cè)定490nm處的吸光度值。按下列 公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率= (1-處理組A值/對(duì)照組A值）X 100%， 重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)三次。所有結(jié)果應(yīng)用SPSS Statistics software version 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析。
[0017] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-3所示，組合藥物對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞系均有細(xì)胞毒性。當(dāng)熊果酸 和環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用時(shí)，結(jié)果顯示對(duì)各種乳腺癌細(xì)胞系均具有不同程度的增殖抑制作用， 并呈劑量依賴性。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，并呈協(xié)同 相加效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)分析顯示組合用藥組同單藥組相比均有結(jié)果上的顯著性差異。
[0018] 實(shí)施例2 熊果酸與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用的小鼠乳腺癌4T1腫瘤抑制試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟：采用BALB/C雌性小鼠（6-8周大)，將4T1細(xì)胞懸液（4*105 /200μ L PBS) 經(jīng)皮下注射到小鼠的乳房脂肪墊（mammary fat pad, MFP)內(nèi)。一周后將小鼠隨機(jī)分成四組 (n=7 )，對(duì)照組（生理鹽水，灌胃），UA組（100 mg/kg，灌胃），環(huán)磷酰胺（20 mg/kg，灌胃）， UA+環(huán)磷酰胺度組（UA，80mg/kg+ CP，20 mg/kg,灌胃）。持續(xù)給藥四個(gè)星期，在此期間每?jī)?天測(cè)定一次小鼠體重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（a)和短徑（b)，按公式V=aXb 2/2,換算 成腫瘤體積。在第28天，脫頸處死小鼠。解剖出腫瘤組織稱量，計(jì)算抑瘤率（TI)。TI (%) =(對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量-給藥組平均腫瘤質(zhì)量）/對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量X 100%。同時(shí)應(yīng) 用HEMAVET 950 hematology System分析小鼠外周血液的以下參數(shù)的含量：白細(xì)胞（WBC)、 血紅蛋白（HGB)、白血球（WBC)、以及淋巴細(xì)胞（LYMPH)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1)一般情況：給藥后每日觀察小鼠精神、活動(dòng)、飲食、尿液、糞便等情況，均未發(fā)現(xiàn)異常， 目艮、耳、鼻、口均未見分泌物。
[0020] 2)各組抑瘤率結(jié)果：給藥10天后取小鼠腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，各藥物治療組中的腫瘤 均縮小，具體比較見圖4。生理鹽水組中，瘤生長(zhǎng)迅速，給藥后16天，平均瘤體積達(dá)到了 Imm3 左右，處死后解剖觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟上已密布斑點(diǎn)，可見腫瘤已大面積擴(kuò)散。給藥期間，瘤 體積變化結(jié)果如圖5所示。單藥組中，熊果酸和環(huán)磷酰胺對(duì)荷小鼠乳腺癌原位腫瘤的抑瘤 率分別為為19. 70%和38. 75% (結(jié)果見圖6)，與對(duì)照組相比有顯著差異（P〈0. 01)。聯(lián)合給 藥組抑瘤率更高，達(dá)到45. 11%，與單藥組相比有顯著差異（P〈0.05)，說明聯(lián)合治療加強(qiáng)了 抑瘤的作用。同時(shí)在給藥期間，小鼠狀態(tài)良好，沒有明顯的體重變化差異（圖7)，未表現(xiàn)出明 顯的毒副作用。
[0021] 3)聯(lián)合藥物對(duì)環(huán)磷酰胺干預(yù)小鼠乳腺4T1原位移植瘤造血功能的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，荷瘤小鼠的外周血白細(xì)胞(WBC)在使用環(huán)磷酰胺后減少明顯，但單用熊果酸對(duì)其的影 響不大，而熊果酸和環(huán)磷酰胺聯(lián)用組的WBC比單用環(huán)磷酰胺有所增加，從I. 37X 107L升至 2. 13X109/L，增加了 55. 4%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 01)。
[0022] 與單用環(huán)磷酰胺組相比，聯(lián)合使用熊果酸組的紅細(xì)胞（RBC)、血紅蛋白（HGB)以 及淋巴細(xì)胞（LYMPH)的含量也明顯升高，其中RBC從7. 56*1012/L升至8. 78*1012/L，增加 16. 1%，HGB 從 112. 32 g/L 升至 130. 76 g/L，增加 16. 4%，淋巴細(xì)胞 LYMPH 從 2. 34*109/L 升 至3. 01*109/L，增加28. 6%，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P〈 0. 05)。結(jié)果匯總見表1。
[0023] 從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，熊果酸與環(huán)磷酰胺聯(lián)用，增強(qiáng)了其抗腫瘤的效果，同時(shí)對(duì)外 周血的RBC、HGB、WBC和LYMPH指標(biāo)有所改善，且上述指標(biāo)在給藥期間均在正常范圍內(nèi)波 動(dòng)，體現(xiàn)了在常規(guī)化療時(shí)聯(lián)合使用熊果酸能產(chǎn)生"減毒增效"的效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于包含重量比為1-10:1的熊果酸和環(huán)磷酰胺。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于熊果酸和環(huán)磷酰胺的重量比為： 2-5:1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于包含重量比為1-10:1的熊果酸和環(huán)磷酰胺，優(yōu)選比例為2-5:1。將熊果酸和環(huán)磷酰胺聯(lián)用治療腫瘤可以產(chǎn)生明顯的協(xié)同效應(yīng)。所述組合物既可以增強(qiáng)單組分的抗腫瘤藥效，也能降低其對(duì)正常組織的毒性，從而提高腫瘤治療的效果，在腫瘤治療領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P35-00, A61K31-56, A61K31-675
【公開號(hào)】CN104688748
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510097801
【發(fā)明人】邵敬偉, 湯喬, 李濤, 劉亞軍, 楊祥
【申請(qǐng)人】福州大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月6日