用于針對(duì)金黃色葡萄球菌的免疫的穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年8月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/695, 782的權(quán)益，其全部?jī)?nèi) 容通過(guò)引用納入本文以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及包含衍生自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的抗原的免疫 原性組合物及其在免疫中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮膚以及其他 軟組織感染的主要原因。其導(dǎo)致從輕度皮膚感染到致命性疾?。òǚ窝缀蛿⊙Y）的多 種疾病，且在美國(guó)每年與金黃色葡萄球菌相關(guān)的死亡率超過(guò)了任何其他感染性疾?。ò?HIV/AIDS)。
[0004] 目前沒(méi)有批準(zhǔn)的針對(duì)金黃色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期臨床試驗(yàn)中，與 安慰劑組相比，基于來(lái)自5型和8型細(xì)菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX?無(wú)法減少感 染。參考文獻(xiàn)1報(bào)道了來(lái)自默克公司（Merck)和因特塞爾公司（Intercell)關(guān)于"V710" 疫苗的數(shù)據(jù)，該疫苗基于單個(gè)抗原IsdB，這是一種保守的螯合鐵的細(xì)胞表面蛋白[2,3]。然 而，V710的臨床試驗(yàn)在2011年終止，其依據(jù)是觀察到V710不太可能表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 的臨床益處，且與安慰劑接受者相比，在疫苗接受者中出現(xiàn)了更高頻率的涉及總體死亡率 和多器官功能障礙的安全問(wèn)題[4]。
[0005] 參考文獻(xiàn)5公開(kāi)了各種金黃色葡萄球菌抗原及其組合，包括用作疫苗策略的 "(：〇11113〇-1"出8叉六48叉8、突變型!11&、5七&006和5七&011的混合物）和"(：〇11113〇-2"伍8叉六48叉8、 IsdA、Sta006和StaOll的混合物）。參考文獻(xiàn)6公開(kāi)了金黃色葡萄球菌多肽抗原在簡(jiǎn)單的 緩沖溶液中可能不穩(wěn)定并可通過(guò)加入穩(wěn)定化添加劑（如EDTA)來(lái)穩(wěn)定該抗原?？乖牟环€(wěn) 定是不希望的，因?yàn)椋?)這使得疫苗不能在給藥之前長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，和（2)疫苗批次之間的不 一致會(huì)影響品質(zhì)和監(jiān)管審批的要求。此外，含有這些不穩(wěn)定抗原的疫苗的生產(chǎn)會(huì)變得復(fù)雜 且涉及多個(gè)純化步驟。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是鑒定使免疫原性組合物中的金黃色葡萄 球菌多肽抗原穩(wěn)定的其他策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，避免抗原的寡聚化是提高抗原穩(wěn)定性的有效策略。多種金黃色葡萄 球菌抗原含有半胱氨酸殘基，且它們可在標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中形成寡聚體，包括由半胱氨酸殘 基之間的二硫鍵形成的共價(jià)二聚體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有這些共價(jià)二聚體的組合物可能是不 穩(wěn)定的，并且可形成聚集體或影響組合物中其他抗原（如果存在）的穩(wěn)定性。可通過(guò)取 代、修飾或去除半胱氨酸殘基從而使二硫鍵無(wú)法形成的方式防止共價(jià)二聚體的形成。有趣 的是，防止這些抗原形成共價(jià)二聚體提高了抗原穩(wěn)定性并維持了組合物的高度總體選擇性 (即相對(duì)于總體抗原存在高比例的單一同種型）和純度。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些半胱氨酸 缺陷型抗原在引發(fā)針對(duì)野生型含半胱氨酸抗原的免疫應(yīng)答上仍然有效。因此，可在免疫組 合物中包含半胱氨酸缺陷型抗原以提高抗原穩(wěn)定性。
[0007] Sta006和StaO 11抗原的成熟形式中天然具有N-末端半胱氨酸。EsxB蛋白天然含 有內(nèi)部半胱氨酸殘基。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)野生型含半胱氨酸的Sta006、Sta011、Hla和EsxAB的組 合在水性條件下沒(méi)有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。野生型含半胱氨酸的Es XAB、Sta006和StaOll可 在緩沖溶液中發(fā)生氧化還原反應(yīng)并且形成不穩(wěn)定的同二聚體或異二聚體（例如，Sta006/ StaOll等）。這些二聚體可因半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而產(chǎn)生。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)二硫鍵形 成的消除（例如，通過(guò)取代、修飾或刪除半胱氨酸殘基）使抗原之間以及抗原與其他組分之 間的干擾最小化。因此，包含在還原條件下不含任何游離巰基的EsxAB、Sta006和StaOll 的變體（因而不形成同二聚體或異二聚體）的免疫原性組合物比含有含半胱氨酸殘基（即 在還原條件下含游離巰基）的野生型抗原更穩(wěn)定。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含有不含巰基的抗原變體的 免疫原性組合物能在液體制劑中穩(wěn)定至少4周。這種免疫原性組合物也顯示具有更高的選 擇性、再現(xiàn)性、穩(wěn)定性、純度和改善的加工特點(diǎn)。因此，可以較少的純化步驟生產(chǎn)本發(fā)明的免 疫原性組合物。因此，生產(chǎn)過(guò)程更為簡(jiǎn)單和高效。
[0008] 因此，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：（i)EsxB抗 原，例如，具有與SEQ ID N0:16有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、 彡95 %、彡96 %、彡97 %、彡98 % )相同性的氨基酸序列的多肽；（ii) Sta006抗原，例如，具 有與SEQ ID NO :24有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、彡95%、彡96%、 彡97%、彡98%、彡99%、彡99. 5% )相同性的氨基酸序列的多肽；和/或（iii) StaOll 抗原，例如，具有與SEQ ID NO :28有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、 彡95%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%、彡99. 5% )相同性的氨基酸序列的多肽，前提 是這些抗原都不含任何游離巰基，并且多肽（i)至（iii)各自可引發(fā)（例如，當(dāng)給予人時(shí)） 識(shí)別相應(yīng)的野生型含半胱氨酸的抗原的抗體。例如，（i)可引發(fā)識(shí)別SEQ ID NO :2(EsxB) 的抗體，（ii)可引發(fā)識(shí)別SEQ ID N0:10(Sta006)的抗體，并且（iii)可引發(fā)識(shí)別SEQ ID NO : 11 (StaOll)的抗體。
[0009] 該免疫原性組合物還可包含Hla (優(yōu)選無(wú)毒形式，例如下文所述的Hla-H35L)。因 此，該免疫原性組合物優(yōu)選還包含：（iv) Hla的H35L突變體形式，例如包含SEQ ID NO :9,其 可引發(fā)識(shí)別SEQ ID NO :67(野生型Hla)的抗體。
[0010] 如下文所述，EsxB抗原可與EsxA組合成雜交多肽，例如，具有EsxA抗原下游的 EsxB抗原的EsxAB雜合體。這些抗原在參考文獻(xiàn)5中有詳細(xì)描述。
[0011] 因此，本發(fā)明的有用的組合物包括：（i)含氨基酸序列SEQ ID NO :59的第一多肽 (EsxAB) ; (ii)含氨基酸序列SEQ ID NO :26的第二多肽（Sta006);和/或（iii)含氨基酸 序列SEQ ID NO :32的第三多肽（StaOll);并且任選地還包括（iv)含氨基酸序列SEQ ID NO :9的第四多肽（Hla-H35L)。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，所述組合物可包含一種或多種其它多肽；在其它實(shí)施方式中， 所述組合物中的僅有多肽是上述的那些。如果所述組合物包含一種或多種其他多肽，優(yōu)選 這些多肽不含任何游離巰基。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該免疫原性組合物包含其它抗原，該抗原可以是多 肽和/或糖。例如，其還可包括一種或多種金黃色葡萄球菌莢膜糖偶聯(lián)物，例如針對(duì)血清型 5和/或血清型8菌株。在其他實(shí)施方式中，該組合物不包括其他葡萄球菌多肽抗原。在其 他實(shí)施方式中，該組合物不包括其他葡萄球菌抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物不包括 其他抗原。
[0014] 當(dāng)存在超過(guò)一種多肽時(shí)，它們可以基本相等的質(zhì)量存在，即，其各自的質(zhì)量在全部 多肽平均質(zhì)量的±5%以內(nèi)。因此，當(dāng)存在四種多肽時(shí)，它們可以a : b : c : d的質(zhì)量比 存在，其中a-d各自在0.95和1.05之間。
[0015] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的免疫原性組合物的凍干物。該凍干物可使用水性物質(zhì)重 建以提供水性的本發(fā)明的免疫原性組合物。為進(jìn)行給藥，使用合適的液體稀釋劑（例如緩 沖液、鹽水溶液、用于注射的水（WFI))重建凍干物。所述液體稀釋劑可包括佐劑，例如鋁鹽 或水包油乳液佐劑。
[0016] 本發(fā)明的組合物可以是水性形式，此時(shí)理想情況下其pH為5至8。所述組合物還 可包括佐劑，例如鋁鹽。
[0017] 金黃色葡萄球菌抗原
[0018] EsxA
[0019] "EsxA"抗原作為有用的免疫原公開(kāi)于參考文獻(xiàn)5中。其原始僅被標(biāo)注為"蛋白 質(zhì)"。在NCTC 8325菌株中，EsxA是SA0UHSC_00257且具有氨基酸序列SEQ ID NO :1 (GI : 88194063)。SEQ ID NO :1沒(méi)有半胱氨酸殘基并且不含游離巰基。本發(fā)明所用的EsxA也應(yīng) 該不含游離巰基。適用于本發(fā)明的各種形式的EsxA抗原見(jiàn)述于參考文獻(xiàn)5。有用的EsxA 抗原能夠引發(fā)識(shí)別野生型EsxA抗原（例如SEQ ID NO: 1)的抗體（例如在給予人時(shí)）。多 肽可包括如下氨基酸序列：（a)與SEQ ID NO :1有80%或更高相同性（例如，85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；且/或（b)包括SEQ ID NO: 1的至少"η"個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多）。這些EsxA蛋白包括SEQIDN0 :l的變體。（b) 的優(yōu)選片段包含來(lái)自SEQ ID NO :1的表位。其它優(yōu)選片段缺少SEQ ID NO :1的C末端的一 個(gè)或多個(gè)（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè)）氨基酸和/或N末端的一個(gè)或 多個(gè)（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個(gè)）氨基酸，而保留SEQ ID NO :1的至 少一個(gè)表位。其它片段省去一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0020] EsxA可以與下文所述的EsxB的雜交多肽的形式存在。
[0021] EsxB
[0022] "EsxB"抗原作為有用的免疫原公開(kāi)于參考文獻(xiàn)5中。在NCTC 8325菌株中，其為 SA0UHSC_00265且具有氨基酸序列SEQ ID NO :2(GI :88194070)。本發(fā)明使用不能通過(guò)二 硫鍵形成共價(jià)二聚體的EsxB形式。該多肽不含任何游離的巰基（在還原條件下）。其能 夠引發(fā)識(shí)別野生型EsxB抗原（例如SEQ ID NO :2)的抗體（例如在給予人時(shí)）。該多肽可 包含與SEQIDN0:16、19、20、21、22、23、43、44或45中任一條序列具有80%或更高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高）相同性的 氨基酸序列。其也可包含與SEQ ID勵(lì)：15、17、18、42、46或47中任一條序列具有80%或更 高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高） 相同性的上游氨基酸序列。
[0023] SEQ I