一種生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體及其提取物在制備抗幽門螺桿菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"（正文中的 引號表示對菌絲體的特指）及其提取物在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門螺桿菌，Helicobacterpylori，簡稱Hp，是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋 形彎曲的細(xì)菌。長2. 5~4.0ym，寬0.5~LOym。在胃粘膜上皮細(xì)胞表面常呈典型的螺 旋狀或弧形。在固體培養(yǎng)基上生長時，除典型的形態(tài)外，有時可出現(xiàn)桿狀或圓球狀。幽門螺 桿菌是微需氧菌，環(huán)境氧要求5~8%，在大氣或絕對厭氧環(huán)境下不能生長。（CHEMTR0N)幽 門螺桿菌檢測試劑為目前國內(nèi)使用最廣泛的幽門螺桿菌檢測工具。
[0003] 1994年，世界衛(wèi)生組織將幽門螺桿菌列為第一類高危致惡變因子，幽門螺桿菌具 有極強(qiáng)的傳染性，人是幽門螺桿菌的唯一傳染源。家庭成員中的感染者一經(jīng)確診，就必須主 動接受正規(guī)的抗菌治療，徹底清除傳染源以達(dá)到防治目的，只有先查出是否感染幽門螺桿 菌，再進(jìn)行有效的根治，才能徹底治愈反復(fù)發(fā)作的老胃病并防止惡變。美國國立衛(wèi)生研宄院 (NIH)提出大多數(shù)常見的胃炎疾病均由幽門螺桿菌所造成，在治療過程應(yīng)加入抗生素。2005 年10月3日，瑞典卡羅林斯卡研宄院宣布，2005年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予這兩位科 學(xué)家以表彰他們發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌以及這種細(xì)菌在胃炎和胃潰瘍等疾病中的作用。
[0004] 青蒿（Artemisiacarvifolia) -年生草本。莖直立，上部多分枝，具縱棱線。葉 子互生，莖中部的葉子二回羽狀分裂，線形小裂片。夏季開花，頭狀花序半球形，多數(shù)，成圓 錐狀，花管狀，外面為雌花，內(nèi)層為兩性花。含揮發(fā)油，也含艾蒿堿（abrotanine，C21H22N20) 及苦味素等。入藥，但非中藥"青蒿"之正品。據(jù)報道，本種有清熱、涼血、退蒸、解暑、祛風(fēng)、 止癢之效，作陰虛潮熱的退熱劑，也止盜汗、中暑等，但本種不含"青蒿素"，無抗瘧作用。《本 草綱目》等古本草書記述的"青蒿花色淡青，淡黃色"者可能是本種；《救荒本草》與《野菜博 錄》所載"邪蒿"亦為本種。 [1]
[0005] 中藥青蒿，為菊科植物黃蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分的地上部分。花 蕾期采收，割取地上部分，切碎，曬干。古名"葭"（qin)。清熱解暑，除蒸，截瘧。用于暑邪 發(fā)熱，陰虛發(fā)熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸。是一種廉價的抗瘧疾藥。青蒿 莖圓柱形，上部分枝，長30至80厘米，直徑0. 2至0. 6厘米；表面黃綠色或棕黃色，具縱棱 線；質(zhì)略硬，易折斷，斷面中部有髓。葉互生，暗綠色或棕綠色，卷縮易碎，完整者呈三回羽狀 深裂，小裂片矩圓形或長橢圓形，兩面被短毛。氣香特異，味微苦。以色綠，葉多，香氣濃者 為佳。
[0006] 功能主治：清透虛熱，涼血除蒸，解暑，截瘧。用于暑邪發(fā)熱，陰虛發(fā)熱，夜熱早涼， 骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸。該品苦寒清熱，辛香透散，善使陰分伏熱透達(dá)外散，為陰虛 發(fā)熱要藥，此外青蒿兼有解暑，截虐之功。解暑可治外感暑熱，發(fā)熱煩渴；截虐主治瘧疾引起 的寒熱往來；涼血退虛熱，善治陰虛發(fā)熱，骨蒸勞熱，及溫?zé)岵『笃?，熱入陰分，夜熱早涼者?br>[0007] 猴頭菌絲體中的活性物質(zhì)最重要的是多糖及糖蛋白，目前國內(nèi)外對猴頭多糖的研 宄表明，猴頭菌多糖具有多種生物活性和藥理作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)溶血 素的形成，抗白細(xì)胞下降，降血糖、抗幽門螺桿菌、抗血栓、抗突變和抗衰老等。因此，猴頭 菌多糖備受人們關(guān)注，成為近年來分子生物學(xué)、醫(yī)藥、食品科學(xué)等領(lǐng)域研宄和開發(fā)應(yīng)用的熱 點(diǎn)?！逗鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》2009年版，122~123頁記載了猴頭菌培養(yǎng)物，本發(fā)明所述的猴頭 菌絲體是該標(biāo)準(zhǔn)記載的猴頭菌培養(yǎng)物。
[0008] 生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"是指利用菌絲體（包括真菌）的代謝功能，使中藥分解的 生物化學(xué)反應(yīng)過程。借鑒中醫(yī)藥組方思想，將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥作為部 分培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲體轉(zhuǎn)化，目的是產(chǎn)生新化合物、增強(qiáng)功效或者降低單一藥物不良作用。同 時中藥的特殊有效成分誘變菌絲體，促進(jìn)菌絲體新陳代謝，促進(jìn)菌絲體生物轉(zhuǎn)化。生物雙向 轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用，能夠顯著提升傳統(tǒng)中藥的臨床療效、發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥的臨床新 價值、顯著提高中藥材資源的利用率、批量創(chuàng)新中藥，從而促進(jìn)中藥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。
[0009] 據(jù)文獻(xiàn)記載，猴頭菌絲體具有抗幽門螺桿菌作用，但作用并不明顯，而青蒿主要用 于殺菌抗痢疾，未有報導(dǎo)抗幽門螺桿菌?，F(xiàn)有報道中，沒有使用中藥作為猴頭菌的培養(yǎng)基， 更沒有使用青蒿作為培養(yǎng)基來進(jìn)行生物雙向轉(zhuǎn)化文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"及其提取物。
[0011] 所述一種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"的培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0012] 麥麩65~75 ;玉米面15~25 ;谷糠5~15 ;青蒿25~150 ;水68. 75~150。
[0013] 優(yōu)選地，所述的菌絲體培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0014] 麥麩70 ;玉米面20 ;谷糠10 ;青蒿25~150 ;水68. 75~150。
[0015] 更優(yōu)選地，所述的菌絲體培養(yǎng)基包括如下重量份的組分：
[0016] 麥麩70 ;玉米面20 ;谷糠10 ;青蒿66. 67 ;水100。
[0017] 所述的一種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"是將猴頭菌接種至上述培養(yǎng)基中，在20~ 27°C條件下菌絲體轉(zhuǎn)化30~40天，取出，烘干，即得。
[0018] 所述這種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"的提取物通過如下步驟制得：
[0019] (1)將權(quán)利要求4所述的生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體進(jìn)行第一次50-90%乙醇溶液提取， 提取1~2小時，然后進(jìn)行第二次50-90%乙醇溶液提取，提取1~2小時；兩次提取中， 50-90%乙醇的重量為生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體重量的4~8倍。
[0020] (2)提取液過濾、合并，40-60 °C下減壓濃縮回收乙醇，得濃縮液，每次用濃縮液同 體積的乙酸乙酯萃取，萃取2-4次，合并萃取液，40-60°C下減壓濃縮，濃縮液在不超過60°C 條件下真空干燥或冷凍干燥。
[0021] 所述生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物能用于制備抗幽門螺桿菌藥物。
[0022] 本發(fā)明所述猴頭菌為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericiumerinaceum(Bull,exFr.) Pers.，是市售的商業(yè)化的菌種；本發(fā)明所述猴頭菌絲體是《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年 版，122~123頁記載的猴頭菌培養(yǎng)物，猴頭菌絲體為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull.exFr.)Pers.的菌絲體與其附生固體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基均為農(nóng)副產(chǎn)品） 的干燥混合物；本發(fā)明所述的生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"為猴頭菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceum(Bull.exFr. )Pers.的菌絲體與其附生含有青蒿成份固體培養(yǎng)基的干燥混合 物。
[0023] 猴頭菌絲體具有較弱抗幽門螺桿菌作用，青蒿未有明顯的抗幽門螺桿菌效果。猴 頭菌是一種藥用真菌，能很好地吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)，徹底轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，產(chǎn)生新的活性物質(zhì)及 代謝物，為此，本發(fā)明將青蒿加入到培養(yǎng)基中，猴頭菌對青蒿進(jìn)行生物雙向轉(zhuǎn)化，得到新的 菌絲體（即：生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體")，本發(fā)明對所得的生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物進(jìn)行 了體外抗幽門螺旋桿菌試驗，從圖1至圖3和表1至表2的結(jié)果可知，該生物雙向轉(zhuǎn)化"菌 絲體"提取物能顯著抑制幽門螺桿菌，具有顯著的抗幽門螺桿菌作用，因此可應(yīng)用于制備抗 幽門螺桿菌藥物。為了不影響有關(guān)活性物質(zhì)，本發(fā)明采用了低溫干燥手段（60°C條件下真 空干燥或冷凍干燥）。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實(shí)施例5中1、2、3、4、5號提取物血瓊脂中抗幽門螺桿菌效果圖；
[0025] 圖2為實(shí)施例5中6、7、8、9、10號提取物血瓊脂中抗幽門螺桿菌效果圖；
[0026] 圖3為實(shí)施例5中7、8、11號提取物及陽性藥物阿莫西林血瓊脂中抗幽門螺桿菌 效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1
[0028] -種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0029] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥麩650g、玉米面150g、谷糠50g，以及中藥材青蒿粗粉（青 蒿）250g，混勻，加入687. 5g水拌勻，既得菌絲體培養(yǎng)基，再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在20~ 27°C條件下菌絲體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30~40天，取出生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"，烘干，即得生物雙向 轉(zhuǎn)化"菌絲體"；
[0030] (2)將權(quán)利要求4所述的生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體進(jìn)行第一次50%乙醇溶液提取，提 取1小時，然后進(jìn)行第二次50%乙醇溶液提取，提取1小時；兩次提取中，50%乙醇的重量 為生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體重量的4倍。
[0031] (3)提取液過濾、合并，40°C下減壓濃縮回收乙醇，得濃縮液，每次用濃縮液同體積 的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取液，40°C下減壓濃縮，濃縮液在不超過60°C條件下真 空干燥或冷凍干燥。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] -種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0034] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥麩700g、玉米面200g、谷糠100g，以及中藥材青蒿粗粉（青 蒿）666. 7g，混勻，加入1000 g水拌勻，既得菌絲體培養(yǎng)基，再裝瓶、滅菌，接入猴頭菌，在 20~27°C條件下菌絲體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)30~40天，取出生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"，烘干，即得生物 雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"；
[0035] (2)將權(quán)利要求4所述的生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體進(jìn)行第一次75%乙醇溶液提取，提 取1. 5小時，然后進(jìn)行第二次75%乙醇溶液提取，提取1. 5小時；兩次提取中，75%乙醇的 重量為生物雙向轉(zhuǎn)化菌絲體重量的6倍。
[0036] (3)提取液過濾、合并，50°C下減壓濃縮回收乙醇，得濃縮液，每次用濃縮液同體 積的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，50°C下減壓濃縮，濃縮液在不超過60°C條件下 真空干燥或冷凍干燥。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] -種生物雙向轉(zhuǎn)化"菌絲體"提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0039] (1)取農(nóng)副產(chǎn)品麥麩750g、玉米面250g、谷糠150g，以及中藥材青蒿粗粉（青 蒿）1500g，