艱難梭菌抗原的制作方法
【專利說(shuō)明】艱難梭菌抗原
[0001] 本發(fā)明涉及用于艱難梭菌（Clostridiumdifficile)感染（CDI)的預(yù)防/治療/ 抑制的抗原。還提供了用于產(chǎn)生所述抗原的方法、用于產(chǎn)生結(jié)合所述抗原的抗體的方法、以 及所述抗體用于CDI的預(yù)防/治療/抑制的用途。
[0002] 目前艱難梭菌感染（⑶I)是全世界醫(yī)院的主要難題。該細(xì)菌導(dǎo)致本身表現(xiàn)為從輕 微自限性腹瀉至可能危及生命的、嚴(yán)重的結(jié)腸炎的幾種形式的醫(yī)院的、與抗生素相關(guān)的疾 病。老年患者最容易處于這些可能危及生命的疾病的風(fēng)險(xiǎn)中且⑶I事件在過(guò)去10年已顯 著增加。2010年，英國(guó)存在超過(guò)21，000例的⑶I，其中有超過(guò)2, 700例相關(guān)的死亡。每年 CDI花費(fèi)英國(guó)NationalHealthService超過(guò)￡500M。
[0003] 艱難梭菌的各種菌株可通過(guò)許多方法來(lái)分類。其中最常用的一種是聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)核糖體分型（ribotyping)，其中PCR用于擴(kuò)增艱難梭菌的16S-23SrRNA基因的基 因間隔區(qū)。反應(yīng)產(chǎn)物由此提供識(shí)別分離株的細(xì)菌核糖體型（ribotype)的特征性條帶圖譜。 毒素分型（Toxinotyping)是另一種分型方法，其中源自編碼艱難梭菌毒素的DNA的限制性 圖譜用于識(shí)別菌株毒素類型（toxinotype)。在不同菌株的毒素基因之間觀察到的限制性圖 譜的差異還表明了艱難梭菌毒素家族內(nèi)的序列變異。例如，與毒素類型III毒素B中相同 區(qū)域相比，毒素類型0毒素B的C-末端60kDa區(qū)域存在約13%序列差異。
[0004] 艱難梭菌的菌株產(chǎn)生多種毒性因子，其中以下幾種蛋白毒素值得注意：毒素A、 毒素B和，在一些菌株中與產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens)絲毫毒素（iota toxin)類似的二元毒素。毒素A是在感染的病理學(xué)中起作用并可影響腸道定殖過(guò)程的大的 蛋白細(xì)胞毒素/腸毒素。CDI的爆發(fā)已報(bào)道伴隨毒素A陰性/毒素B陽(yáng)性菌株，其表明毒素 B還能夠在疾病病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。
[0005] 編碼毒素A和毒素B(分別Mw308k和Mw269k)的基因序列是已知的-參見(jiàn)，例 如Moncrief等人（1997)Infect.Immun63:1105-1108。兩種毒素具有高度序列同源性，并 被認(rèn)為起因于基因復(fù)制。毒素還共享共同的結(jié)構(gòu)（參見(jiàn)圖1)，即N-末端葡糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu) 域、中央疏水區(qū)、四個(gè)保守的半胱氨酸、和長(zhǎng)系列的C-末端重復(fù)單元（RU)。
[0006] 毒素A和B兩者經(jīng)由多步驟機(jī)制發(fā)揮其作用機(jī)制，該多步驟機(jī)制包括結(jié)合至細(xì)胞 表面上的受體，內(nèi)化隨后易位并將效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域釋放進(jìn)細(xì)胞胞質(zhì)中，以及最終細(xì)胞內(nèi)作用。 所述的作用機(jī)制涉及Rho家族的小GTP酶的失活。在這點(diǎn)上，毒素催化葡萄糖部分（來(lái)自 UDP-葡萄糖）轉(zhuǎn)移至Rho蛋白的氨基酸殘基上。毒素A和B還包含半胱氨酸蛋白酶的形式 的第二酶的活性，其顯示在易位后在效應(yīng)器功能域釋放進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)中起作用。艱難梭菌 二元毒素通過(guò)涉及從NAD將ADP-核糖部分轉(zhuǎn)移至其靶蛋白上的機(jī)制修飾細(xì)胞肌動(dòng)蛋白。
[0007]目前用于治療艱難梭菌感染的治療方法依賴于抗生素，特別是甲硝唑和萬(wàn)古霉素 的使用。然而，在所有情況下這些抗生素是無(wú)效的并且20% -30%的患者經(jīng)歷該疾病的復(fù) 發(fā)。主要關(guān)注的是在英國(guó)出現(xiàn)的更強(qiáng)毒株，其于2002年在加拿大首次被確認(rèn)。這些菌株， 包括屬于PCR核糖體型027和毒素類型III的那些，導(dǎo)致⑶I，伴隨直接可歸因的多于先前 觀察到的3倍的死亡率。
[0008] 由于目前抗生素的效力似乎在下降，因此，特別迫切需要新的療法。
[0009] -種方法是結(jié)合毒素A和/或毒素B并中和毒素A和/或毒素B的活性的抗體的 使用。這基于不釋放這些毒素的艱難梭菌的菌株，所謂非產(chǎn)毒的菌株，不導(dǎo)致CDI的知識(shí)。 例如，可將動(dòng)物免疫，收集其血清并純化抗體用于施用至患者_(dá)這被定義為被動(dòng)免疫。在另 一個(gè)方法中，有CDI的患者或處于發(fā)展此類感染的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者可用導(dǎo)致增加循環(huán)和針 對(duì)毒素A和/或毒素B的粘膜抗體的抗原來(lái)免疫-這被定義為主動(dòng)免疫。
[0010] 對(duì)于主動(dòng)和被動(dòng)免疫兩者的關(guān)鍵需要是用其分別免疫患者或動(dòng)物的合適的抗原 的可用性。這些可包括可從其中已培養(yǎng)艱難梭菌的合適的產(chǎn)毒素菌株的培養(yǎng)基中純化的天 然毒素。該方法存在幾個(gè)缺點(diǎn)。毒素A和毒素B兩者僅以少量存在于培養(yǎng)基中，并且很難 純化而不產(chǎn)生顯著損失。因此，其既昂貴又難以獲得滿足世界范圍需要的必需量。此外，天 然毒素不穩(wěn)定并有毒。
[0011] 以上提及的問(wèn)題已導(dǎo)致存在很少可用的艱難梭菌疫苗候選物。至今，在后期開(kāi)發(fā) 的唯一CDI疫苗基于天然（即天然存在）的毒素A和B的混合物，其已通過(guò)化學(xué)修飾被廣 泛地滅活（Salnikova等人 2008,JPharmSci97:3735-3752)。
[0012] 天然毒素（及其類毒素）的一種備選用途涉及設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)并使用源自毒素A和B 的重組片段。旨在用于治療/預(yù)防艱難梭菌感染的現(xiàn)有抗原的實(shí)例包括基于毒素A或毒素 B的C-末端重復(fù)單元（RU)的肽-參見(jiàn)，例如，WO00/61762。然而，伴隨此類抗原的問(wèn)題在 于，其或是弱免疫原性（即抗原產(chǎn)生差的抗體滴度），或，當(dāng)產(chǎn)生較高的抗體滴度時(shí)，該抗體 表現(xiàn)出針對(duì)艱難梭菌細(xì)胞毒性活性的差的中和效力（即產(chǎn)生中和不足的抗體）。
[0013] 因此，本領(lǐng)域存在對(duì)能夠特定致力于艱難梭菌感染（CDI)的新疫苗/治療方法/ 療法的需要。本發(fā)明通過(guò)解決了一個(gè)或更多個(gè)以上提及的問(wèn)題而致力于該需要。
[0014] 總之，本發(fā)明提供了能夠誘導(dǎo)針對(duì)艱難梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反 應(yīng)的抗原。本發(fā)明還提供了用于制備重組抗原的方法、及其作為免疫原能夠大規(guī)模制備治 療性抗體的用途。所述抗體能夠誘導(dǎo)針對(duì)艱難梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反應(yīng)， 并因此具有預(yù)防和/或治療應(yīng)用。
[0015] 如以上提及的（參見(jiàn)，例如，WO00/61762)，在先研宄描述了基于毒素A和/或毒 素B的C-末端重復(fù)單元（RU)的疫苗制劑。所述RU片段具有差的毒素中和效應(yīng)，和/或難 以大批量制造。
[0016] 相比之下，本發(fā)明提供了不包含或包括毒素A和/或毒素B的一個(gè)或更多個(gè)（例 如，全部）的重復(fù)單元（RU)的基于毒素A和/或毒素B的艱難梭菌多肽抗原。本發(fā)明的多 肽抗原由以下組成或包含以下：來(lái)自毒素的中心區(qū)域的一個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的所 述抗原表現(xiàn)出良好的毒素中和性免疫應(yīng)答和/或容易大批量制造。
[0017]本發(fā)明人已出人意料地確定了由以下組成或包括以下的艱難梭菌抗原多肽提供 與包含一個(gè)或更多個(gè)RU的相應(yīng)艱難梭菌毒素片段相比（參照表1和2)被大大提高的保護(hù) 性（毒素中和性）免疫應(yīng)答：來(lái)自效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域和RU的區(qū)域之間的中心區(qū)域的一個(gè)或更多 個(gè)功能域（參見(jiàn)圖1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，艱難梭菌抗原多肽包含毒素B片段。
[0018] 表1和2中的數(shù)據(jù)的比較證實(shí)了本發(fā)明的多肽抗原引起比基于包括艱難梭菌毒素 的一個(gè)或更多個(gè)C-末端重復(fù)單元的相應(yīng)多肽誘導(dǎo)的毒素中和性免疫應(yīng)答有效得多的毒素 中和性免疫應(yīng)答（由指定的多肽TxB2示例）。更詳細(xì)地，18周免疫期后，由本發(fā)明的多肽 提供的毒素中和性免疫應(yīng)答比由相應(yīng)的含RU的多肽提供的毒素中和性免疫應(yīng)答高60倍更 多。因此，本發(fā)明的多肽誘導(dǎo)有效的毒素中和性免疫應(yīng)答。
[0019] 出于許多理由，這些發(fā)現(xiàn)是出人意料的。最重要地，其中動(dòng)物單獨(dú)地接種了 艱難梭菌毒素的中心結(jié)構(gòu)域片段（由殘基510-1530組成的片段，和由殘基1530-1750 組成的片段）的先前研宄報(bào)道了這些片段未能引起毒素中和性抗體的產(chǎn)生（Kink& Williams(1993)Infect.Immun. 66:2018-2025)。因此，這項(xiàng)研宄表明，殘基 510-1530 內(nèi) 的結(jié)構(gòu)域沒(méi)有貢獻(xiàn)有意義的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)決定簇。此外，進(jìn)一步的研宄已顯示了針對(duì)完 整艱難梭菌產(chǎn)生的抗體，盡管識(shí)別由全部RU區(qū)域單獨(dú)組成的片段，未能識(shí)別由基于艱難 梭菌相同毒素的殘基901-1750的中心毒素區(qū)域組成的片段（Genth等人，（2000)Infect. Immun.，68:1094-1101)。因此，這項(xiàng)研宄表明，殘基901-1750內(nèi)的結(jié)構(gòu)域沒(méi)有貢獻(xiàn)有意 義的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)決定簇。此外，雖然針對(duì)艱難梭菌毒素的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域（殘基1-543) 的抗體已顯示引起有效的免疫應(yīng)答（通過(guò)簡(jiǎn)單的酶免疫分析測(cè)量），但所述抗體沒(méi)有毒 素中和活性，顯示抗體與毒素的結(jié)合并不相應(yīng)于毒素中和（Roberts等人（2012)Infect. Immun.，80:875-882)。共同地，因此，基于位于效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域和重復(fù)區(qū)域之間的艱難梭菌毒 素的中心結(jié)構(gòu)域的重組免疫原能夠誘導(dǎo)此類有效的毒素中和性免疫應(yīng)答是非常出人意料 的。
[0020] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含以下、由以下組成、或包括以下的多肽：具有與由艱 難梭菌毒素A序列的殘基1500-1700 (例如1450-1750、或1400-1800)組成的氨基酸序列的 至少80%序列同一性的氨基酸序列，條件是該多肽不是包含艱難梭菌毒素A的氨基酸殘基 1851-2710和/或艱難梭菌毒素B的殘基1853-2366之間的一個(gè)或更多個(gè)（例如全部）RU 單元的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽缺少艱難梭菌毒素A的氨基酸殘基1851-2710 和/或艱難梭菌毒素B的殘基1853-2366的序列。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含以下、由以下組成、或包括以下的多肽：具有與由 艱難梭菌毒素A序列的殘基542-1850組成的氨基酸序列的至少80 %序列同一性的氨基酸 序列，條件是該多肽不包含艱難梭菌毒素A的殘基1851-2710和/或艱難梭菌毒素B的殘 基1853-2366之間的任何RU單元。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽缺少艱難梭菌毒素A的氨 基酸殘基1851-2710和/或艱難梭菌毒素B的殘基1853-2366的序列。
[0022] 提及艱難梭菌毒素A序列意指天然存在的艱難梭菌毒素A的氨基酸序列（還稱為 艱難梭菌毒素A參考序列）。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解此類序列的實(shí)例，并且僅用于說(shuō)明的 目的，一些更常見(jiàn)的天然存在的毒素A序列在本說(shuō)明書中而且貫穿文獻(xiàn)被確定（參見(jiàn)，例如 SEQIDN0s:l&3)。