用于檢測(cè)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tet M）的LAMP試劑盒及其專(zhuān)用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中基因的分子生物學(xué)檢測(cè)，特別是設(shè)及一種用于檢測(cè)艱 難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)的LAMP試劑盒及其專(zhuān)用引物與檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 艱難梭菌（Clostridiumdifficile,Cd)是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽抱桿菌，部分產(chǎn) 毒菌株通過(guò)分泌毒素A、毒素BW及二元毒素引起抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至致死性偽 膜性腸炎，統(tǒng)稱(chēng)為艱難梭菌感染（Clostridiumdifficileinfection,CDI)。在醫(yī)院獲得感 染性腹瀉所明確的病原體中，W艱難梭菌最為常見(jiàn)；在抗生素相關(guān)性腹瀉病因中，艱難梭菌 亦占15% -25% ;而偽膜性腸炎則幾乎100%由艱難梭菌所致。目前，CDI的一線(xiàn)治療藥物 是甲硝挫和/或萬(wàn)古霉素，大量研究發(fā)現(xiàn)：甲硝挫療效降低并出現(xiàn)耐藥菌株，萬(wàn)古霉素敏感 性降低，導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉（Clostridiumdifficileassociateddisease,CDAD) 耐藥率高、復(fù)發(fā)率高、難治率高、死亡率高、醫(yī)療費(fèi)用高。艱難梭菌流行株對(duì)多種抗菌藥物 均有耐藥性，而大量抗菌藥物不合理使用是導(dǎo)致CDI最主要的危險(xiǎn)因素。廣州李永強(qiáng)等報(bào) 道艱難梭菌多重耐藥情況普遍，Ξ重及W上耐藥株占80% (李永強(qiáng)，憂(yōu)玉強(qiáng)，楊銀梅.臨 床分離艱難梭菌的耐藥性分析[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010, 19(10) :922-925);英國(guó) Mutlu等報(bào)道艱難梭菌的某些型別菌株雙重及Ξ重耐藥率高達(dá)52. 6% -95. 4% (Mutlu，E. andA.J.Wroe,etal. (2007)."Molecularcharacterizationandantimicrobial susceptibilitypatternsofClostridiumdifficilestrainsisolatedfrom hospitalsinsouth-eastScotland."JMedMicrobiol56(Pt7):921-9.)。艱難梭菌尤 其對(duì)四環(huán)素類(lèi)、林可霉素類(lèi)、哇諾酬類(lèi)、利福霉素類(lèi)及一線(xiàn)藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)。
[0003] 四環(huán)素是一種廣譜抗菌藥物，包括天然品金霉素、±霉素、地美環(huán)素等，W及半合 成品多西環(huán)素、米諾環(huán)素等，由于它高效、低毒、價(jià)廉而廣泛用于動(dòng)物及人類(lèi)臨床疾病的防 治中。四環(huán)素對(duì)細(xì)菌的耐藥機(jī)制包括：主動(dòng)外排、核糖體保護(hù)、產(chǎn)生滅活酶及一種未明機(jī) 審IJ。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因多位于接合質(zhì)粒或接合轉(zhuǎn)座子上。四環(huán)素對(duì)革蘭陰性菌 的耐藥機(jī)制W主動(dòng)外排為主，主要與tetA、tetB和tetC等基因有關(guān)；而四環(huán)素對(duì)革蘭 陽(yáng)性菌的耐藥機(jī)制則W核糖體保護(hù)為主，主要與tetW、tetK、tet^tetΜ和tet0等 基因有關(guān)。四環(huán)素類(lèi)抗生素與艱難梭菌的核糖體結(jié)合，阻止氨基酷t(yī)RNA進(jìn)入核糖體A位 而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮抑菌、殺菌作用。艱難梭菌對(duì)四環(huán)素的主要耐藥基因?yàn)?tetM，而tetΜ為核糖體保護(hù)蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中，保護(hù)核糖體免受四環(huán)素類(lèi)藥物的作 用，具有核糖體依賴(lài)的=憐酸鳥(niǎo)巧（GT巧水解酶活性，使四環(huán)素和核糖體結(jié)合能力減弱，從 而產(chǎn)生耐藥。大量國(guó)內(nèi)外研究表明，艱難梭菌對(duì)四環(huán)素耐藥率較高。上海黃海輝等報(bào)道 110株艱難梭菌中對(duì)四環(huán)素的耐藥率為62. 7%，tetΜ基因檢出率為97. 1 %化uang，H.and A.Weintraub,etal. (2010)."Antimicrobialsusceptibilityandheteroresistance inChineseClostridiumdifficilestrains."Anaerobe16 (6):633-5.);意大利 Spigaglia等報(bào)道90株艱難梭菌中對(duì)tetΜ基因檢出率為21. 1% (Spigaglia,P.and F.Barbanti,etal. (2006)."Newvariantsofthetet(M)geneinClostridiumdiffici leclinicalisolatesharbouringTn916-likeelements."JAntimicrobChemother 57化）：1205-9.)。綜上所述，國(guó)內(nèi)艱難梭菌對(duì)四環(huán)素耐藥率和tetM基因檢出率普遍較高， 故在臨床使用四環(huán)素類(lèi)藥物時(shí)，應(yīng)注意對(duì)患者密切觀(guān)察和監(jiān)測(cè)，一旦出現(xiàn)腹瀉，應(yīng)及時(shí)檢測(cè) 艱難梭菌及其毒素，并作出相應(yīng)處理，W防出現(xiàn)嚴(yán)重的偽膜性腸炎。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)最常用PCR檢測(cè)tetΜ基因，但因?qū)嶒?yàn)設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、速度慢， 擴(kuò)增完成后需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯影等一些繁瑣步驟，不適合基層醫(yī)院及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè) 的應(yīng)用。因此，尋找快速、特異、敏感檢測(cè)艱難梭菌中的四環(huán)素耐藥基因（tetΜ)有利于控 制CDI危險(xiǎn)因素，指導(dǎo)臨床診療。 陽(yáng)0化]隨著分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，T.Notomi發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)一環(huán)介導(dǎo) 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP),該技術(shù)針對(duì)祀基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在恒溫化3-67Γ) 的條件下，利用高活性鏈置換DNA聚合酶度StDNA聚合酶），使得鏈置換DNA合成在不 停地自我循環(huán)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物一白色的焦憐酸儀沉淀產(chǎn)生，從而 實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的快速檢測(cè)（NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediated isothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000 ;28(12) :63.)。該方法檢測(cè) 時(shí)間短（30-60min)，無(wú)需特殊儀器，操作簡(jiǎn)便，配合相應(yīng)顯色試劑還能實(shí)現(xiàn)肉眼判別結(jié)果。 LAMP方法目前已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床診斷流行細(xì)菌或病毒的定性和定量檢測(cè)、胎兒性別鑒定 等，成為常用的臨床快速檢驗(yàn)方法之一。但是迄今為止，市場(chǎng)上還未見(jiàn)用于檢測(cè)艱難梭菌的 四環(huán)素耐藥基因（tetM)的LAMP試劑盒及其專(zhuān)用引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了用于對(duì)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物， W實(shí)現(xiàn)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)的批量檢測(cè)，提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)的LAMP引物，是 根據(jù)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)(GenBank:AB054984. 1)的特異性保守祀序列設(shè) 計(jì)的，用W定性檢測(cè)肌肉、血液、糞便等樣品中的艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)，所述 LAMP引物由五條引物組成，包括外引物tetM-F3和tetM-B3、內(nèi)引物tetM-FIP和tet M-BIP化及環(huán)引物tetM-LB的組合；所述艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetΜ)的特異性保 守祀序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
[000引具體來(lái)講，所述用于對(duì)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)進(jìn)行LAMP檢測(cè)的五條 引物的核巧酸序列如序列表中沈QIDN0:2(tetM-F3)、沈QIDN0:3(tetM-B3)、沈QID N0:4(tetM-FIP)、沈QIDN0:5(tetM-BI巧和沈QIDN0:6(tetM-LB)所示。
[0009] 所述的LAMP引物，為外引物tetM-F3和tetM-B3、內(nèi)引物tetM-FIP和tetM-BIP 及環(huán)引物tetM-LB按摩爾比1 :8 :3的組合物。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于對(duì)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetΜ)進(jìn)行 LAMP檢測(cè)的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述用于對(duì)艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)進(jìn) 行LAMP檢測(cè)的引物。
[0012] 具體來(lái)講，所述試劑盒包括W下用于23μΙ反應(yīng)體系（不含模板）的試劑： MixUire 20. 9yL(主要成分包括：2mM Tris·肥1(抑8. 8)0. 7yL，10mM KC1 3. 8yL， 10mM(NH4)2S〇4 3.8yL，0.1%Tween20 0.4yL，0.8M甜菜堿化etaine)0.3yL，8mM MgS〇4 3 μ L, 1. 4mM dNTP each 0. 5 μ L，8U Bst DM polymerase 1 μ L，（1地2〇7. 4 μ L)，引物加 入量分別為：①50mM引物tet M-F3 0. 1化，使終濃度為5pmol;②50mM引物tet M-B3 0. 1 μ L，使終濃度為5pmol;③50mM引物tet M-FIP 0. 8 μ L，使終濃度為40pmol;④50mM 引物tet M-BIP 0. 8 μ L，使終濃度為40pmol⑥50mM引物tet M-LB 0. 3 μ L，使終濃度為 ISpmol。
[0013] 為方便檢測(cè)，所述試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為含四 環(huán)素耐藥基因（tetM)的艱難梭菌基因組DNA，所述陰性對(duì)照為不含DNA的LAMP擴(kuò)增體系 (如雙蒸水、去離子水）。
[0014] 上述LAMP引物或試劑盒在艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)的LAMP檢測(cè)中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供上述LAMP引物或試劑盒在艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基 因（tetM)的LAMP檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0016] 該應(yīng)用設(shè)及艱難梭菌的四環(huán)素耐藥基因（tetM)的LAMP檢測(cè)，可包括W下步驟：
[0017] 1)W待