紐蘭格林制劑的配方的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] -般來說，本發(fā)明涉及治療心血管疾病比如心力衰竭的藥物制劑。特別地，本發(fā)明 涉及紐蘭格林藥物制劑的配方。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在美國，大約有5百萬人患有心衰，并且每年新增病人在55萬以上。目前治療心 衰的藥物主要集中于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制劑，這些血管舒張劑引起血管擴(kuò)張、降低 血壓并減少心臟負(fù)荷。雖然使用ACE抑制劑后死亡率的百分?jǐn)?shù)下降是具有統(tǒng)計學(xué)差異的， 但實(shí)際的死亡率僅平均下降3%_4%，并且還有一些潛在的副作用。其他預(yù)防或治療心衰的選 擇亦有相應(yīng)的局限。比如，心臟移植顯然比藥物治療更昂貴且更具侵入性，并且還進(jìn)一步受 有無供體心臟的限制。使用機(jī)械裝置，比如雙心室心臟起搏器，同樣具有侵入性并且比較昂 貴。因此，由于當(dāng)前治療手段的不足，人們需要有新的治療方法。
[0004] -種很有前途的新的治療手段涉及給心衰患者或有心衰風(fēng)險的患者施用紐蘭格 林(此后稱為"NRG")。NRGs屬于表皮生長因子樣（EGF-Iike)家族，是一類結(jié)構(gòu)上相似的生 長分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其異構(gòu)體。NRGs涉及一系列生物學(xué)反應(yīng)：刺 激乳腺癌細(xì)胞分化和分泌乳汁蛋白；誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成Schwann細(xì)胞；刺激骨骼肌細(xì) 胞合成乙酰膽堿受體；并且促進(jìn)心肌細(xì)胞成活和DNA合成。用紐蘭格林基因嚴(yán)重缺陷的純 合子小鼠胚胎做活體研究證明紐蘭格林對于心臟和神經(jīng)發(fā)育是必須的。
[0005] NRGs與EFG受體家族的成員結(jié)合，該受體家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一個受體在多種細(xì)胞功能中都發(fā)揮重要的作用，包括細(xì)胞生長、分化和存活。它們都 是蛋白酪氨酸激酶受體，由一個胞外配體結(jié)合域、跨膜激酶域和胞漿的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域 組成。NRG結(jié)合至ErbB3或ErbB4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域后，能夠誘導(dǎo)構(gòu)象改變從而引起ErbB3、 ErbB4和ErbB2之間形成異二聚體，或者ErbB4自身形成同源二聚體，這樣就會導(dǎo)致受體細(xì) 胞內(nèi)C-末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化。然后磷酸化的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)其他的信號蛋白結(jié)合，活 化相應(yīng)的下游AKT或ERK信號傳導(dǎo)途徑，并誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，比如刺激或抑制細(xì)胞增 殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移或細(xì)胞粘附。在這些受體中，ErbB2和ErbB4主要在心臟 表達(dá)。
[0006] 已有研究表明NRG-I的EGF類似區(qū)，約50至64個氨基酸，足以結(jié)合并活化這些受 體。以前的研究表明紐蘭格林-1 β (NRG-1 β )能以高親和力直接結(jié)合ErbB3和ErbB4。孤 兒受體ErbB2能與ErbB3或ErbB4形成異源二聚體并且其親和力比ErbB3或ErbB4同源二 聚體要高。神經(jīng)發(fā)育的研究結(jié)果提示交感神經(jīng)系統(tǒng)的形成需要完整的NRG-I β、ErbB2和 ErbB3信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。靶向破壞NRG-I β、或ErbB2或ErbB4后由于心臟發(fā)育缺陷而導(dǎo)致胚 胎致死。最近的研究也突顯了 NRG-I β、ErbB2和ErbB4在心血管發(fā)育以及維持成年正常心 臟功能方面具有重要作用。研究表明NRG-I β能增強(qiáng)成年心肌細(xì)胞的肌小節(jié)的組織結(jié)構(gòu)。 短期施用一種重組的NRG-I β EGF類似區(qū)能顯著改善或防止不同心衰動物模型的心肌功能 的惡化。這些效應(yīng)使得NRG-I有望成為一種治療多種普通疾病導(dǎo)致的心衰的廣譜治療物或 先導(dǎo)化合物。通常，蛋白質(zhì)類藥物制劑的給藥方式為靜脈注射。然而眾所周知，一些活性蛋 白存在著穩(wěn)定性差的問題。因此，開發(fā)一種穩(wěn)定的紐蘭格林藥物制劑是非常必要的。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明所提供的一種紐蘭格林的藥物配方包含：（a)紐蘭格林多肽；（b) -種緩沖 齊Ll，使所述配方pH值為3-7。在一些實(shí)施例中，紐蘭格林配方進(jìn)一步包括：（c)一種穩(wěn)定劑。 在一些實(shí)施例中，紐蘭格林還包括：（d)-種鹽。在一些實(shí)施例中，該配方為一種液體制劑。 在一些實(shí)施例中，該配方為一種凍干制劑。
[0009] 配方中所述紐蘭格林多肽選自以下物質(zhì)：a) -種包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序 列的多肽；b)-種包含紐蘭格林的EGF類似區(qū)的多肽；c)一種a)所述多肽的生物活性類似 物，片段或突變體；d) -種由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列編碼的多肽；e) -種d)所述多 肽的生物活性類似物，片段或突變體；f)一種由可在適度嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO: 1 所示多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽。在一些實(shí)施例中，紐蘭格林多肽是指包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施例中，紐蘭格林多肽的濃度范圍約為0.0 lg/ L-lg/L。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方中紐蘭格林多肽為包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的多肽且濃度約為〇. 25g/L。
[0010] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方包含一種pH緩沖劑。在所述實(shí)施例中，pH緩沖 劑的濃度范圍約為0. lmM-500mM。緩沖劑選自檸檬酸鹽，磷酸鹽，醋酸鹽，組氨酸，甘氨酸，碳 酸氫鹽，HEPES，Tris，稀鹽酸，稀氫氧化鈉溶液或以上物質(zhì)的組合。在一種實(shí)施例中，本發(fā)明 所述配方中的緩沖劑是磷酸鹽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方的pH值約為6.0。在一 些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方的pH值約為3. 4。
[0011] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方包含一種穩(wěn)定劑。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，穩(wěn)定劑 的濃度范圍約為0. lg/L-200g/L。在另外的實(shí)施例中，穩(wěn)定劑選自甘露醇，山梨醇，木糖醇， 蔗糖，海藻糖，甘露糖，麥芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纖維二糖，龍膽二糖，異麥芽糖，阿拉 伯糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白及或以上物質(zhì)的組合。在一些實(shí)施例中，穩(wěn)定劑指濃度 約為2g/L的人血清白蛋白。
[0012] 在另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方包含一種鹽。在一些實(shí)施例中，鹽的濃度約 為100mM-500mM。在一特定實(shí)施例中，鹽是指氯化鈉。在相關(guān)實(shí)施例中，配方中鹽的濃度約 為 150mM。
[0013] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方中的紐蘭格林多肽包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列，其中緩沖劑約為IOmM的磷酸鹽，pH值約為6. 0。
[0014] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方中所含的NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基 酸序列的多肽且濃度約為〇. 25g/L，所含的緩沖劑是濃度約為IOmM的磷酸鹽且pH值約 為6.0,所含的穩(wěn)定劑是濃度約為2g/L的人血清白蛋白，所含的鹽是氯化鈉且濃度約為 150mM〇
[0015] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方是液體藥物制劑。在進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明所 提供的紐蘭格林液體藥物制劑配方包含的紐蘭格林多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的 多肽且濃度約為0. 25g/L，所述緩沖劑約為IOmM磷酸鹽且其中所述pH約為3. 4。
[0016] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明所述配方是由上述任一配方加入賦形劑后凍干而成的凍 干藥物配方。在一些實(shí)施例中，賦形劑選自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上 物質(zhì)的組合。在一特定實(shí)施例中，賦形劑為甘露醇。在相關(guān)實(shí)施例中，約60mg的所述配方 用Iml重懸溶液重懸后賦形劑的濃度約為0. lg/L-200g/L。在一特定實(shí)施例中，約60mg的 所述配方用Iml重懸溶液重懸后甘露醇的濃度約為50g/L。
[0017] 在進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明所提供的紐蘭格林凍干藥物配方包含：（a) -種紐蘭 格林多肽；（b) -種緩沖劑；（c) 一種賦形劑。在另外一些實(shí)施例中，凍干的藥物制劑配方 進(jìn)一步包含一種穩(wěn)定劑。在另外一些實(shí)施例中，凍干的藥物制劑配方進(jìn)一步包含一種鹽。
[0018] 在一特定實(shí)施例中，本發(fā)明所述的凍干藥物制劑配方包含：（a)SEQ ID N0:2所示 氨基酸序列的多肽；(b)磷酸鹽緩沖劑；（c)賦形劑甘露醇；（d)穩(wěn)定劑人血清白蛋白和（e) 鹽氯化鈉，約60mg的所述配方用Iml重懸溶液重懸后（a)的濃度為0. 25g/L ; (b)的濃度為 IOmM且pH值約為6 ; (c)的濃度為50g/L ; (d)的濃度為2g/L ; (e)的濃度為150mM。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1 :重組人紐蘭格林（rhNRG-Ι)稀釋液和濃度為0· 25mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖
[0021] 圖 2 :pH3-10 的 SDS-PAGE 色譜圖
[0022] 圖3 :在溫度為40°C、pH3_8條件下的濃度-時間圖
[0023] 圖4 :在溫度為40°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0024] 圖5 :在溫度為50°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0025] 圖6 :在溫度為60°C、pH3_8條件下的濃度-時間圖
[0026] 圖7 :儲存在溫度為60°C、pH2. 3-4. 3條件下的濃度-時間圖
[0027] 圖8 :在pH3_8條件下的pH值-降解速率圖
[0028] 圖9 :在pH2. 3-4. 3條件下的pH值-降解速率圖
[0029] 圖10 :在pH2. 3-8條件下的pH值-降解速率圖
[0030] 圖11 :pH值-預(yù)期保質(zhì)期T (90)圖
[0031] 圖12 :pH3-8、40°C條件下