食源性草酸過(guò)多草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物模型的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種食源性草酸過(guò)多 草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 泌尿系結(jié)石是一種全球性的常見病，其中草酸鈣結(jié)石約占泌尿系結(jié)石的80%。輕 癥患者可以無(wú)任何癥狀，重癥患者可能會(huì)出現(xiàn)腎功能衰竭，危及患者的生命。近些年，由于 內(nèi)窺鏡技術(shù)的發(fā)展，對(duì)泌尿系結(jié)石的手術(shù)治療取得了一定的進(jìn)展。盡管，現(xiàn)在普遍認(rèn)為泌尿 結(jié)石的形成是遺傳、環(huán)境和代謝等綜合性的因素引起，但泌尿結(jié)石形成的機(jī)理仍不清楚。因 此，在尿石癥基礎(chǔ)與臨床研宄中，設(shè)計(jì)和建立泌尿系結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是重要的一環(huán)。
[0003] 通過(guò)建立泌尿系結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以：（1)深入了解泌尿系結(jié)石形成的過(guò)程， 研宄泌尿系結(jié)石形成機(jī)制；（2)印證或否定某一涉及泌尿系結(jié)石成因的代謝問(wèn)題：（3)篩選 抑制結(jié)石生長(zhǎng)的中西藥物并確認(rèn)其臨床藥理等。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)易于控制實(shí)驗(yàn)條件，易重復(fù)， 所以在臨床與基礎(chǔ)研宄中得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)不同的目的和需要，可以設(shè)計(jì)和建立多 種不同的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停海?)按不同結(jié)石成分而建立的泌尿系結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，包括草 酸鈣、磷酸鈣、尿酸鹽結(jié)石等；（2)據(jù)不同病因而建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，如異物模型、梗阻模 型、高鈣或高草酸模型、VitB6缺乏模型、VitD中毒誘導(dǎo)泌尿系結(jié)石形成模型等；（3)依不 同病理過(guò)程而建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，如腎鈣化模型、腎近端曲管損傷模型、尿晶體黏附模型 等。
[0004] 目前泌尿系結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，大多是在雄性大鼠上建立的，主要方法是通過(guò)給 大鼠以草酸或草酸前體，輔以其他一些誘因，如高鈣飲食、VitB6缺乏飲食、VitD飲食、異 物、大量抗生素等，以促使大鼠形成腎、膀胱結(jié)石，但是仍然存在著腎功能損害較大，成石效 果較差的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種食源性草酸過(guò)多草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建方 法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] 一種食源性草酸過(guò)多草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建方法，其特征在于：選取體重為8~ l〇Kg，犬齡為1. 5~2. 0歲的雄性小獵兔犬，用犬五聯(lián)疫苗進(jìn)行免疫，7天后利用基礎(chǔ)犬糧和 草酸進(jìn)行造模，造模期間所述草酸的添加量為基礎(chǔ)犬糧的〇. 8~I. 5wt%。
[0008] 其中，造模時(shí)間為25~30天。
[0009] 其中，所述基礎(chǔ)犬糧中含有0.50~l.Owt%的羧甲基殼聚糖。
[0010] 其中，所述基礎(chǔ)犬糧中主要營(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白< 22%，粗脂肪< 8%，粗纖維 彡3%，水分彡8%，鈣為1. 2%，灰分彡8%，磷彡Ll，W-3. 6. 9彡2. 7%，食鹽彡0. 5%，草酸 < 0· 2%〇
[0011] 其中，所述基礎(chǔ)犬糧中主要成分有雞肉粉、牛肉粉、優(yōu)質(zhì)玉米、大米、大豆餅、黑芝 麻餅、米糠、維生素、羧甲基殼聚糖、卵磷脂、牛黃酸、硫酸軟骨素，葡萄糖胺、海藻和礦物質(zhì)。
[0012] 其中，于造模期間的第OcU 15d和30天，收集犬尿液，且于4°C保存，待收集24h尿 液后，混勻，測(cè)尿比重及pH值，取5ml尿液用濃鹽酸酸化至pH為1后凍存，測(cè)尿液草酸濃度； 剩余尿液離心后取上清置冰箱保存，測(cè)尿游離鈣、尿尿素氮和尿肌酐：且在犬前肢外側(cè)靜脈 采血，分離血清，于-20°C保存?zhèn)溆?，測(cè)血鈣、血尿素氮和血肌酐。
[0013] 其中，尿液草酸使用離子色譜儀進(jìn)行測(cè)定：環(huán)境溫度為35°C，載氣為氮?dú)?，壓力?200kPa，設(shè)定泵的最高壓力為21 X 103kPa (3000psi)，實(shí)際運(yùn)行時(shí)為IL 72 X 103kPa，背景電 導(dǎo)為 28us，流速為 lml/min，進(jìn)樣體積為 IOOul;米用 Dionex I onPac AS23(4X250mm)陰 離子保護(hù)柱，IonPac AGllanalytical column(4X50mm)陰離子保護(hù)柱；洗脫液為16mmol/ L的碳酸鈉和4mmol/L的碳酸氫鈉的水溶液；先配制1000mg/L的草酸貯備液，用0. 2um微 孔濾膜過(guò)濾，用超純水稀釋成草酸濃度為16、8、4、2、1、0. 5、and 0. 25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液；樣 品經(jīng)低溫超速離心并用0. 2um微孔濾膜過(guò)濾，離心后取少許按照1 :100用超純水稀釋，過(guò) On-GuardH柱及C18預(yù)處理小柱后進(jìn)樣分析。
[0014] 其中，血清尿素測(cè)定采用脲酶連續(xù)監(jiān)測(cè)法；肌酐測(cè)定采用苦味酸法；血清和尿液 中游離鈣的測(cè)定采用核固紅法。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明所述的食源性草酸過(guò)多草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建方法具有 以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明采用食源性造模方法，提高了造模的安全性和可重現(xiàn)性，而且造模成功率 尚，效果好。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬血鈣的含量變化；
[0018] 圖2為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬血清肌酐的含量變化；
[0019] 圖3為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬血清尿素氮的含量變化；
[0020] 圖4為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬尿液草酸的含量變化；
[0021] 圖5為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬尿鈣的含量變化；
[0022] 圖6為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬尿肌酐的含量變化；
[0023] 圖7為尿石癥發(fā)生過(guò)程中犬尿尿酸氮的含量變化；
[0024] 圖8為動(dòng)物體內(nèi)草酸的代謝途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述的食源性草酸過(guò)多草酸鈣結(jié)石模型的構(gòu)建 方法做進(jìn)一步的闡述，以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、 準(zhǔn)確和深入的理解。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 1.1實(shí)驗(yàn)以及分組
[0028] 選取體重為9 ±0. 5Kg，犬齡為1. 5~2. 0歲的雄性小獵兔犬18條，，犬五聯(lián)疫苗免 疫。一周后將犬隨機(jī)分為A、B、C三組，預(yù)試期為7d，飼喂基礎(chǔ)犬糧，預(yù)試期結(jié)束后進(jìn)入試驗(yàn) 期。定時(shí)定量飼喂商品犬糧，不限水。試驗(yàn)前后所有犬環(huán)境條件、基礎(chǔ)犬糧（其營(yíng)養(yǎng)水平和 配方見表）、飼養(yǎng)管理都相同。所述基礎(chǔ)犬糧采用常用的犬糧并添加有1.0 wt %的羧甲基殼 聚糖。所述基礎(chǔ)犬糧中主要營(yíng)養(yǎng)成分中粗蛋白< 22%，粗脂肪<8%，粗纖維< 3%，水分 彡8%，鈣為L(zhǎng) 2%，灰分彡8%，磷彡Ll，W-3. 6. 9彡2. 7%，食鹽彡0· 5%，草酸彡0· 2%。A 組為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)犬糧；B組飼喂基礎(chǔ)犬糧加0. 5%的草酸（以基礎(chǔ)犬糧的重量為 基準(zhǔn)）；C組飼喂基礎(chǔ)犬糧加1 %的草酸（以基礎(chǔ)犬糧的重量為基準(zhǔn)），造模時(shí)間為30d，常 規(guī)管理。
[0029] 1. 2樣品的采集與制備
[0030] L 2. 1尿樣采集
[0031] 于試驗(yàn)第0d、15d和30天，采用自制接尿器收集犬尿液。4°C保存，待收集24h尿 液后，混勻，測(cè)尿比重及