一種桑葚提取物及其在制備肝臟細(xì)胞損傷抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種桑葚提取物及其在制備肝臟細(xì)胞損傷抑 制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑葚（Mulberry)為?？疲∕oraceae)桑屬（Morus)衆(zhòng)果類(lèi)果樹(shù)，是重要的第三代 小果類(lèi)果樹(shù)。果實(shí)未成熟時(shí)為綠色，逐漸成長(zhǎng)變?yōu)榘咨?、紅色，成熟后為紫紅色或紫黑色，味 酸甜，柔軟多汁且營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、多種氨基酸和微量元素，還含有黃酮、多酚、 花色苷等抗氧化活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫力、防止血管硬化和防癌抗癌等功能。
[0003] 如公開(kāi)號(hào)為CN 104289088 A的中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種桑葚提取物在制備降糖 藥物中的應(yīng)用。
[0004] 自由基是機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)，具有很強(qiáng)的氧化性，現(xiàn)代研宄表明，自由基 是引起人體衰老和某些慢性疾病發(fā)生的原因之一，當(dāng)人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢 時(shí)，就會(huì)轉(zhuǎn)而攻擊各種細(xì)胞器官，損害機(jī)體的組織，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)并誘發(fā)各 種疾病。
[0005] 丙烯酰胺（Acrylamide，AA)俗稱(chēng)丙毒，是一種具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性的化學(xué) 物質(zhì)，它可作為化工原料，而富含淀粉的食品在熱加工過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺。研宄表 明，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性以及致癌性，國(guó)際癌癥研宄機(jī)構(gòu)（IARC) 1994年對(duì)其 致癌性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，將丙烯酰胺列為2類(lèi)致癌物（2A)即人類(lèi)可能致癌物。張希春等通過(guò)AA 與大鼠肝切片共孵育，HPLC-MS/MS檢測(cè)AA代謝性反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)丙氧酰胺（glycidamide，GA) 的生成量，western blot分析細(xì)胞色素 P4502E1(CYP2E1)蛋白的表達(dá)。劑量組（1.0、2.0、 4. Ommol/L)隨著AA濃度的增加，肝切片代謝生成的GA也隨之增加，3種劑量組間差異顯著 (P<〇.〇5)(張希春，張敏愛(ài).丙烯酰胺肝臟代謝與細(xì)胞色素 P4502E1蛋白表達(dá)[J].現(xiàn)代 預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007, 34(5) :910-911.)
[0006] 肝臟是人體生物轉(zhuǎn)化和解毒的重要器官，是AA進(jìn)入人體后最初的代謝場(chǎng)所，能聚 集高濃度的AA，而肝臟細(xì)胞色素 P450中的CYP2E1作為一種代謝外來(lái)異物的單氧合酶，可 將AA氧化為GA，GA比AA更具細(xì)胞毒性。因此，抑制丙烯酰胺對(duì)肝臟損傷的物質(zhì)具有很大 的研宄意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開(kāi)了一種桑葚提取物，及其在制備由丙烯酰胺誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞氧化損傷 的抑制劑中的新應(yīng)用。
[0008] 一種桑葚提取物，提取步驟如下：
[0009] 桑葚鮮果依次經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，酶解液經(jīng)分離得到上清液，所述上清 液經(jīng)過(guò)濾后截留分子量大于5kDa的成分，濾出液再經(jīng)真空冷凍干燥，得到所述的桑葚提取 物；
[0010] 以質(zhì)量百分比計(jì)，所述桑葚提取物包括：
[0011] 矢車(chē)菊-3-0-葡萄糖昔（Cyanidin_3-〇-glucoside) 58%~68% ;
[0012] 矢車(chē)菊-3-0-蕓香糖苷（Cyanidin-3-〇-rutinoside) 27%~39% ;
[0013] 天竺奏-3-0-葡萄糖昔（Pelargonidin_3-〇-glucoside) 0.87%~4.44% ;
[0014] 天竺葵-3-0-蕓香糖苷（Pelargonidin-3-〇-rutinoside) 0· 34% ~1. 48%。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)模擬人體胃腸道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶等提取方式制 備得到桑葚提取物。該桑葚提取物含有人體最終吸收的有效成分，最大限度的保留了有效 成分，其功能性具有實(shí)用性；而通過(guò)傳統(tǒng)方法提取的桑葚產(chǎn)物，進(jìn)入人體后，一部分有效物 質(zhì)被人體消化系統(tǒng)分解消化，因而功能性具有不可預(yù)測(cè)性，不能代表進(jìn)入人體后的真實(shí)情 況。
[0016] 作為優(yōu)選，桑葚鮮果經(jīng)胃蛋白酶酶解的具體步驟為：
[0017] 桑葚鮮果與水等質(zhì)量混合打漿，加入HCl調(diào)節(jié)pH = 1. 5~2后得到勻漿，再加入 胃蛋白酶，37°C、100~200rpm下水浴振蕩2~3h，得到混合漿液。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述HCl的濃度為5mol/L ;
[0019] 所述胃蛋白酶的加入量為5000~7000單位胃蛋白酶/20g勻漿。
[0020] 作為優(yōu)選，胰蛋白酶酶解的具體步驟為：
[0021] 取經(jīng)胃蛋白酶酶解得到的混合漿液，加入NaOH調(diào)節(jié)pH = 6~7,再加入胰液，然后 用NaHC03調(diào)節(jié)pH至7. 2~7. 5, 37°C，100~200rpm水浴振蕩2~3h后，得到酶解液。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述NaOH的濃度為lmol/L，NaHCO^濃度為ImoVL0
[0023] 所述胰液中胰蛋白酶的含量為5~6mg/mL，膽鹽的含量為20~30mg/mL ;所述胰 液的加入量為5mL/18mL混合漿液。
[0024] 本發(fā)明還公開(kāi)了所述桑葚提取物在制備肝臟細(xì)胞氧化損傷的抑制劑中的新用途， 拓展了桑葚的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0025] 進(jìn)一步公開(kāi)了所述的桑葚提取物在制備由丙烯酰胺誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞氧化損傷的 抑制劑中的應(yīng)用。
[0026] 作為優(yōu)選，所述的抑制劑中桑葚提取物的有效劑量為lmg/mL。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 本發(fā)明模擬人體胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶制備桑葚提取物。
[0029] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了桑葚提取物能夠有效抑制丙烯酰胺誘導(dǎo)的氧化損傷，減少活性 氧的生成，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
[0030] 本發(fā)明為桑葚提取物提供了新的醫(yī)療用途，拓展了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為實(shí)施例1制備的桑葚提取物對(duì)ABTS' +自由基清除能力；
[0032] 圖2為實(shí)施例1制備的桑葚提取物對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù) 作用；
[0033] 圖3為實(shí)施例2制備的桑葚提取物對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活性氧自由基 ROS (DCF熒光）的抑制作用；
[0034] 圖4為實(shí)施例3制備的桑葚提取物對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞核損傷 (Hochest)的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施 例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 桑葚鮮果與水等質(zhì)量混合打漿，用5M鹽酸將桑葚勻漿pH調(diào)節(jié)至2,加入胃蛋白酶 (5000單位胃蛋白酶/20g勻漿），在37°C下，200rpm水浴振蕩2. 5h，體外模擬胃消化的產(chǎn)物 繼續(xù)用IM NaOH調(diào)pH至6,加入5mL胰液（胰液中胰酶含量為6mg/mL，膽鹽含量為20mg/ mL)，再用IM NaHCOJjf pH至7. 2,在37°C下，IOOrpm水浴振蕩3h，體外模擬腸消化結(jié)束后， 在8000rpm條件下離心10min，上清液即為桑葚粗提取物。上清液利用Millipore Pellicon 超濾系統(tǒng)，將上述提取液泵至截留分子量為5kDa的再生纖維素超濾膜表面，收集濾液，真 空冷凍干燥，得到桑葚提取物。
[0038] 經(jīng)液相色譜測(cè)試可知，該桑葚提取物的主要成分如下表所示：
[0039] 表 1
[0040]
[0041] 實(shí)施例2
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種桑葚提取物，其特征在于，提取步驟如下： 桑葚鮮果依次經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，酶解液經(jīng)分離得到上清液，所述上清液經(jīng) 過(guò)濾后截留分子量大于5kDa的成分，濾出液再經(jīng)真空冷凍干燥，得到所述的桑葚提取物； 以質(zhì)量百分比計(jì)，所述桑葚提取物包括：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葚提取物，其特征在于，桑葚鮮果經(jīng)胃蛋白酶酶解的具體 步驟為： 桑葚鮮果與水等質(zhì)量混合打漿，加入HC1調(diào)節(jié)pH= 1. 5~2后得到勻漿，再加入胃蛋 白酶，37°C、100~200rpm下水浴振蕩2~3h，得到混合漿液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的桑葚提取物，其特征在于，所述HC1的濃度為5mol/L; 所述胃蛋白酶的加入量為5000~7000單位胃蛋白酶/20g勻漿。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑莓提取物，其特征在于，胰蛋白酶酶解的具體步驟為： 取經(jīng)胃蛋白酶酶解得到的混合漿液，加入NaOH調(diào)節(jié)pH= 6~7,再加入胰液，然后用 NaHC03調(diào)節(jié)pH至7. 2~7. 5, 37°C，100~200rpm水浴振蕩2~3h后，得到酶解液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的桑葚提取物，其特征在于，所述NaOH的濃度為lmol/L，NaHCO3 的濃度為lm〇l/L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的桑葚提取物，其特征在于，所述胰液中胰蛋白酶的含量為5~ 6mg/mL，膽鹽的含量為20~30mg/mL; 所述胰液的加入量為5mL/18mL混合漿液。
7. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葚提取物在制備肝臟細(xì)胞氧化損傷的抑制劑中的應(yīng) 用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝臟細(xì)胞氧化損傷由丙烯酰胺誘 導(dǎo)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制劑中桑葚提取物的有效劑 量為lmg/mL。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種桑葚提取物，按質(zhì)量百分含量計(jì)，該桑葚提取物包括：矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷(58％～68％)、矢車(chē)菊-3-O-蕓香糖苷(27％～39％)、天竺葵-3-O-葡萄糖苷(0.87％～4.44％)、天竺葵-3-O-蕓香糖苷(0.34％～1.48％)。提取步驟為：桑葚鮮果依次經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，離心分離得到上清液，所述上清液經(jīng)超濾膜過(guò)濾后截留分子量大于5kDa的成分，濾出液經(jīng)真空冷凍干燥，得到所述的桑葚提取物。本發(fā)明還公開(kāi)了該桑葚提取物在制備由丙烯酰胺誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞氧化損傷的抑制劑中的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61K36-605, A61P1-16, A61K31-7048
【公開(kāi)號(hào)】CN104840523
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510221689
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 張凌霞, 鮑濤
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日