專利名稱：獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物前體細(xì)胞分離及培養(yǎng)液，特別是獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及
培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
我國現(xiàn)有慢性肝炎病人3000萬，其中一部分逐步發(fā)展成為肝纖維化，肝纖維化如 果進(jìn)一步惡化將導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、門靜脈高壓等。一般說來，早期肝纖維化是可逆的，而 晚期肝纖維化即肝硬化則是不可逆的，器官移植是目前治療晚期肝臟疾病唯一可行方案， 然而，供體器官嚴(yán)重缺乏限制了其應(yīng)用。越來越多的研究表明以肝干(前體)細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞替代治療已成為治療肝 臟疾病新的希望。成體肝臟前體細(xì)胞Ofepatic Progenitor cells,HPCs)具有較強(qiáng)的細(xì)胞 增殖及分化為特定細(xì)胞類型的能力，較低的畸胎瘤生成率，而沒有胎兒來源的HPCs和胚胎 干細(xì)胞存在的倫理問題，因此被認(rèn)為是細(xì)胞替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細(xì)胞。目前已分離到多種類型的成體HPCs。來源于人、小鼠和大鼠病理肝臟中的卵圓細(xì) 胞(oval cells)是最早被鑒定具有HPCs功能的細(xì)胞，卵圓細(xì)胞在體內(nèi)外具有很強(qiáng)的增殖 能力，并能分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞(biliary印ithelial cells, BECs)的能力。但 由于細(xì)胞分離是一種甚為復(fù)雜的技術(shù)，要做到最大限度的富集所需的細(xì)胞，同時(shí)減少其他 細(xì)胞的百分比，要求細(xì)胞分離培養(yǎng)的每一個環(huán)節(jié)都要經(jīng)過比較分析，才能得到一個簡單、高 效、穩(wěn)定的體系。目前還沒有從正常的成體肝臟中得到與卵圓細(xì)胞相同表型一致細(xì)胞的報(bào) 道。成熟的肝細(xì)胞由于在體外可以分化為膽管上皮細(xì)胞或表達(dá)膽管上皮細(xì)胞的相關(guān)蛋白， 并可參與再生膽管的重塑，因此也被認(rèn)為是成體HPCs細(xì)胞中的一種，遺憾的是成熟的肝細(xì) 胞在體外很難擴(kuò)增培養(yǎng)。除了卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞外，來源于小鼠、大鼠和豬健康的成體肝上皮細(xì)胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)具有HPC的特性，這些上皮細(xì)胞呈現(xiàn)干細(xì)胞特有的 擴(kuò)增能力、并能分化為肝臟特定的細(xì)胞類型，移植后可恢復(fù)受損肝臟的肝功能水平，所有這 些特性表明肝臟上皮前體細(xì)胞是潛在的細(xì)胞替代治療理想的供體細(xì)胞。同樣，從嚙齒類， 人以及SV40T轉(zhuǎn)染的食蟹猴的胎兒肝臟也可分離到類似的肝臟上皮細(xì)胞。許多研究進(jìn)行了從人的成體肝臟中分離HPCs的嘗試。利用特定的培養(yǎng)條件可從正 在進(jìn)行肝切除的病人的肝內(nèi)分離到一種能在體外長期增殖的肝干細(xì)胞(human hepatic stem Cells，HHSC)。然而，該細(xì)胞群的表達(dá)模式以及分化潛力都表明它們更加類似于間充質(zhì)干細(xì)胞 (mensenchymal stem cells,MSCs)而不是傳統(tǒng)意義上的HPCs。最近，從人健康的成體或肝切 除的肝臟中得到了呈現(xiàn)肝膽表達(dá)模式的肝上皮細(xì)胞，提示它們可能是潛在的前體細(xì)胞。但目 前報(bào)道并沒有完全證實(shí)肝臟前體細(xì)胞的特性，如細(xì)胞的雙向(肝和膽)分化能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可應(yīng)用于獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，所分離得到的細(xì)胞能夠?yàn)殪`長類各個物種的成體肝臟前體細(xì)胞的分離 培養(yǎng)和細(xì)胞分化機(jī)制的研究，尤其是作為替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細(xì)胞奠定基 石出。本發(fā)明目的通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml 的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30 60分鐘；(2)收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；(3)將收集到的細(xì)胞置于10%胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì) 胞團(tuán)塊；(4)挑出單個的細(xì)胞團(tuán)塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；(5)細(xì)胞培養(yǎng)液含有 10mmol/L nicotinamide, lx ITS, lOOU/mlpenicillin, 100 u g/ml str印tomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS，50ng/mL 表皮生長因子 EGF， lOng/ml肝細(xì)胞生長因子HGF ；(6)待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10 30分鐘，用流 式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，收集獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件為37°C，5%的C02，每兩天換一次培養(yǎng)液。所述步驟(1)在37°C的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊 30分鐘。所述步驟(3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)，所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培 養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。本發(fā)明具有的積極意義及進(jìn)步是經(jīng)過反復(fù)比較，我們成功地在本發(fā)明中建立了一個合適的體系，用來分離培養(yǎng) 來自于正常成年獼猴的肝臟前體細(xì)胞(monkey liver epithelialprogenitor cells, mLEPCs)，包括分離過程中的肝臟組織小塊消化時(shí)間的長度，消化酶的濃度，培養(yǎng)板的大鼠 鼠尾膠原鋪板，細(xì)胞團(tuán)塊的制備和單個細(xì)胞團(tuán)塊的挑選，培養(yǎng)液中各種成分的組合，以及 E-cad+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分選等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明能夠?yàn)殪`長類各個物種的成體肝臟前體 細(xì)胞的分離培養(yǎng)和細(xì)胞分化機(jī)制的研究提供條件，更重要的是，由于獼猴和人的高度相似 性，利用同樣的技術(shù)，將可能分離得到類似于獼猴的人肝臟前體細(xì)胞，從而使細(xì)胞替代治療 晚期肝臟疾病成為可能。本發(fā)明方法簡單，所需設(shè)備都是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室必備的設(shè)備，易于推廣。實(shí)驗(yàn)研究 結(jié)果表明，本發(fā)明的方法能夠有效地分離得到獼猴成體肝臟前體細(xì)胞，該前體細(xì)胞能在體 外分化為包括肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。該前體細(xì)胞移植到肝損傷小鼠，能參與 肝損傷小鼠的肝組織再生，并能分化為功能性的肝細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 取5克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV 型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘，收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM洗三次并以1200轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘。將收集到的細(xì)胞懸浮于10%胎牛血清的DMEM中，再置于密封的離心 管中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì)胞團(tuán)塊。在顯微鏡下，將單個的細(xì)胞團(tuán)塊挑出，并接種于大鼠鼠尾 膠原鋪板的培養(yǎng)板。待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30分鐘， 消化得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，得到獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。上述方法中，大鼠鼠尾膠原制備方法見(Malhi，2002)。
細(xì)胞培養(yǎng)液含有IOmmol/L nicotinamide, Ix ITS, 100U/ml penicillin, 100 μ g/ ml streptomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS,50ng/mL 表皮生長因子，10ng/ml 肝 細(xì)胞生長因子。實(shí)施例2 取大約8克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，在37°C的搖床 中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊50分鐘，收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM 洗三次并以1200轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘。將收集到的細(xì)胞懸浮于10%胎牛血清的DMEM 中，再置于密封的離心管中在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì)胞團(tuán)塊。在顯微鏡下，將單 個的細(xì)胞團(tuán)塊挑出，并接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37°C，5%的 CO2，每兩天換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長滿后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30 分鐘，消化得到的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，得到獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。大鼠鼠尾膠原制備方法、細(xì)胞培養(yǎng)液同實(shí)施例1。實(shí)施例3 將分離獲得的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用實(shí)施例1的細(xì)胞培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原 鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代，生長擴(kuò)增。
權(quán)利要求
一種獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30～60分鐘；(2)收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；(3)將收集到的細(xì)胞置于10％胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì)胞團(tuán)塊；(4)挑出單個的細(xì)胞團(tuán)塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；(5)細(xì)胞培養(yǎng)液含有10mmol/L nicotinami de，1x I TS，100U/mlpenicillin，100μg/ml streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生長因子EGF，10ng/ml肝細(xì)胞生長因子HGF；(6)待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長滿后，用t ryps in-EDTA在37℃消化10～30分鐘，用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，收集獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是細(xì)胞培 養(yǎng)條件為37°C，5%的C02，每兩天換一次培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步 驟(1)在37°C的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步 驟(3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步驟 (3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37°C的搖床中懸浮培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述 的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培 養(yǎng)，可按1 2或1 3多次傳代。
全文摘要
獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，屬于動物前體細(xì)胞分離及培養(yǎng)液，特別是獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)液。本發(fā)明將獼猴肝臟切除手術(shù)或其他途徑得到的少量肝臟組織，用IV型膠原酶將組織塊消化，收集細(xì)胞懸浮于10％胎牛血清DMEM中培養(yǎng)、挑出單個細(xì)胞團(tuán)塊接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板，培養(yǎng)液為專用的培養(yǎng)液，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞獲得目的細(xì)胞。本方法分離得到的細(xì)胞可用于細(xì)胞分化機(jī)制研究，并可能成為細(xì)胞替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細(xì)胞。
文檔編號C12N5/071GK101864394SQ20101019877
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者季維智, 紀(jì)少琿, 金立方 申請人:昆明亞靈生物科技有限公司