具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個(gè)能夠負(fù)載多個(gè)化療藥 物的PH敏感納米粒前藥，特別是具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥及其制備方法 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)化療在治療癌癥疾病時(shí)受到了多重限制，小分子抗腫瘤藥物常作為臨床上治 療腦膠質(zhì)瘤疾病的化療制劑，但由于其本身的物理化學(xué)特性導(dǎo)致的生物利用度差、血液/ 腎清除速率高、特異性差、腫瘤蓄積濃度低、毒副作用大，以及腫瘤多藥耐藥等問題嚴(yán)重限 制了其臨床應(yīng)用。臨床上必須通過增加給藥劑量來滿足有效濃度的藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)， 由此會導(dǎo)致機(jī)體毒副作用的發(fā)生。聯(lián)合治療的提出給傳統(tǒng)化療提供了新的轉(zhuǎn)機(jī)，擬通過藥 物間對腫瘤細(xì)胞的不同作用機(jī)制發(fā)揮殺傷效果，進(jìn)而降低每個(gè)藥物的給藥劑量以降低對正 常組織的毒副作用。然而，由于不同藥物的理化性質(zhì)導(dǎo)致的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性的不同，使 藥物根據(jù)各自的特性在體內(nèi)分布代謝，導(dǎo)致注射到體內(nèi)的藥物不能夠"同時(shí)同位"的發(fā)揮殺 傷腫瘤的作用。并沒有從根本上解決化療效率差，毒副作用大的難題。
[0003] 納米載體在改善化療藥物的水溶性、生物利用度和延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間方面取得了 很明顯的結(jié)果。而傳統(tǒng)的納米載體通過物理負(fù)載藥物的方法載藥量一般都很低，必須通過 注射高濃度載體或頻繁注射才能實(shí)現(xiàn)有效藥物濃度被遞送至腫瘤內(nèi)，由此導(dǎo)致體內(nèi)大量的 載體蓄積可能產(chǎn)生未知的毒副作用以及腫瘤耐藥的產(chǎn)生。同時(shí)一些通過納米沉淀技術(shù)組 裝的載體，常常會導(dǎo)致納米藥物在注射到體內(nèi)幾小時(shí)后會有部分藥物發(fā)生"突釋"。這些過 早釋放的藥物由于被動(dòng)擴(kuò)散會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用；同時(shí)二次釋放的藥物由于濃度 低、釋放速率慢導(dǎo)致抗腫瘤活性明顯降低。因此，有必要設(shè)計(jì)一個(gè)能夠可控制藥物釋放的納 米粒前藥，即保證藥物活性在長循環(huán)時(shí)"隱藏"起來，到達(dá)腫瘤細(xì)胞時(shí)實(shí)現(xiàn)完全釋放，以此來 達(dá)到高效殺傷腫瘤并降低毒副作用的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一個(gè)能夠負(fù)載多個(gè)藥物并響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境藥物釋放的 高載藥量的納米粒前藥，特點(diǎn)是：實(shí)現(xiàn)納米粒前藥通過被動(dòng)靶向（EPR效應(yīng)）進(jìn)入腫瘤細(xì)胞 內(nèi)，pH敏感納米粒前藥實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗腫瘤藥物在胞內(nèi)的響應(yīng)性釋放，根據(jù)藥物的不同機(jī)制發(fā) 揮聯(lián)合殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。即保證了有效濃度的多個(gè)藥物到達(dá)瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤 作用，同時(shí)降低了藥物在正常組織的滲透和載體蓄積所引起的副作用和系統(tǒng)毒性。
[0005] 本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了一個(gè)具有高載藥量，腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性釋放的納米粒前藥，通過 物理負(fù)載的方式負(fù)載其它藥物實(shí)現(xiàn)同時(shí)遞送多個(gè)藥物，以發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤作用徹底殺傷腫 瘤細(xì)胞，以此來解決化療藥物的相容性和生物利用度的問題，同時(shí)解決了載體的負(fù)載和遞 送藥物的效率，以及單一藥物治療導(dǎo)致的耐藥性的產(chǎn)生。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容： 具有共遞送多個(gè)藥物的PH敏感納米粒前藥，具有如下的結(jié)構(gòu)： PEG-W-Cur-NPs其中PEG為聚乙二醇； DOX為：阿霉素； W為姜黃素、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春花堿、地塞米松、或博來霉 素； NPs為：nanoparticles，粒徑為 183. 5±4. 5nm納米粒； 根據(jù)透射電子顯微鏡（TEM)拍照結(jié)果，顯示本發(fā)明的藥物形態(tài)為圓形的納米粒子藥物， 根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射（DLS)結(jié)果顯示本發(fā)明的納米粒子藥物粒徑為183. 5 ±4. 5nm，粒徑均一。
[0007] 本發(fā)明所述具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥的制備方法，其特征在于 按如下的步驟進(jìn)行： (1)PH敏感納米粒前藥的制備：稱取200mg分子量為2000的mPEG-CHO(醛基化聚乙 二醇)和50mg阿霉素，將其共溶于2.0mL的二甲基亞砜內(nèi)，加入20yL三乙胺作為催化 劑，40°C水浴鍋內(nèi)震蕩反應(yīng)24h; (2) 將溶液置于截留分子量為IKDa的透析袋內(nèi)，DMSO作為透析液，透析48h除去未 反應(yīng)的DOX;再將溶液置于截留分子量為3. 5KDa的透析袋內(nèi)，pH7. 4的PBS作為透析液，透 析48h除去DMSO; (3) 將得到的pH敏感的前藥納米粒水分散液凍干，得到可再分散的納米粒凍干粉 (PEG-DOXnanoparticles(NPs)(聚乙二醇化阿霉素納米粒前藥)。
[0008] (4)PEG-D0X-Cur(聚乙二醇化的阿霉素-姜黃素）制備：稱取PEG-DOX凍干粉30 mg，6mg姜黃素（w)，共溶于2mLDMSO內(nèi)，將溶液緩慢的逐滴加入盛有10mLpH7. 4的PBS 燒杯內(nèi)，不斷震蕩，最后將混合溶液置于截留分子量為IKDa的透析袋內(nèi)，pH7. 4的PBS作為 透析液，透析48h以除去未反應(yīng)的姜黃素和DMS0,得到前藥納米粒溶液PEG-DOX-CurNPs (聚乙二醇化的阿霉素-姜黃素納米粒前藥)。
[0009] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了含有具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥的藥物組 合物，所述的組合物的劑型為凍干粉或者為生理鹽水分散液針劑。
[0010] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥在制備用于診 斷試劑、熒光探針，診療一體化方面的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明提供的pH敏感的納米粒前藥，提供了一個(gè)負(fù)載多個(gè)藥物的平臺，實(shí)現(xiàn)了多 個(gè)藥物在腫瘤環(huán)境內(nèi)的同時(shí)響應(yīng)性釋放，保證了不同藥物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)一致性，并根據(jù)各 自的抗腫瘤機(jī)制協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0012] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：以PEG-DOXNPs的基礎(chǔ)上，負(fù)載另一疏水抗腫瘤藥物，能夠?qū)崿F(xiàn)兩 個(gè)或多個(gè)藥物的共同快速釋放，同時(shí)根據(jù)不同抗腫瘤機(jī)制發(fā)揮協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的能力， 其抗腫瘤效果尤為明顯；由于前藥的PEG的引入，導(dǎo)致藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間明顯延長，同 時(shí)由于被動(dòng)靶向的作用導(dǎo)致藥物在腫瘤內(nèi)的蓄積含量明顯的高于裸藥(例如D0X)，導(dǎo)致其 體內(nèi)體內(nèi)抗腫瘤效果會更加明顯。
[0013] 本發(fā)明典型的含有具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥，其制備方法為： pH敏感納米粒前藥的制備方法是：稱取200mg分子量為2000的mPEG-CHO (Methoxy-poly(ethyleneglycol)-aldehyde)和 50mg阿霉素（DOX)，將其共溶于 2.OmL的二甲基亞砜（DMSO)內(nèi)，加入20yL三乙胺作為催化劑，40°C水浴鍋內(nèi)震蕩反應(yīng)24h。將 溶液置于截留分子量為IKDa的透析袋內(nèi)，DMSO作為透析液，透析48h以除去未反應(yīng)的 DOX;再將溶液置于截留分子量為3. 5KDa的透析袋內(nèi)，PBS(pH7. 4)作為透析液，透析48h 以除去DMS0。將得到的pH敏感的前藥納米粒水分散液凍干，得到可再分散的納米粒凍干 粉（PEG-DOXnanoparticles(NPs))〇
[0014]PEG-DOX-Cur制備方法是：稱取PEG-DOX凍干粉 30mg，6mg姜黃素（curcumin)， 共溶于2mLDMSO內(nèi)，將溶液緩慢的逐滴加入盛有10mLPBS(pH7. 4)的燒杯內(nèi)，不斷震蕩。 最后將混合溶液置于截留分子量為IKDa的透析袋內(nèi)，PBS(pH7. 4)作為透析液，透析48h 以除去未反應(yīng)的curcumin和DMS0。得到前藥納米粒溶液PEG-DOX-CurNPs。
[0015] 本發(fā)明含有具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米粒前藥其pH敏感響應(yīng)性能夠?qū)崿F(xiàn) 藥物的特異性釋放的同時(shí)，納米粒發(fā)生斷裂后，藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，親水端溶于體內(nèi)可降 低體內(nèi)載體的蓄積。本發(fā)明選擇聚乙二醇（PEG)為親水端，抗腫瘤藥物阿霉素（DOX)直接作 為疏水內(nèi)核，藥物直接鍵合在親水分子PEG上能夠顯著地提高載藥能力；親水端和疏水端 通過PEG末端的醛基（CHO)與DOX的氨基（NH2)反應(yīng)得到具有pH響應(yīng)的席夫堿鍵，能夠滿 足藥物快速的可控制釋放。在此納米粒前藥基礎(chǔ)上，搭建一個(gè)能夠同時(shí)遞送多個(gè)藥物的前 藥納米粒平臺。即通過疏水作用將另外一種疏水抗腫瘤藥物包覆在納米粒前藥核內(nèi)，同時(shí) 也增強(qiáng)了納米粒前藥內(nèi)核的穩(wěn)定性。納米粒前藥在體循環(huán)（PH7. 4)下持穩(wěn)定；但被腫瘤細(xì) 胞攝取后，在內(nèi)涵體/溶酶體pH4.0 ~ 6. 5條件下，具有pH敏感性的席夫堿鍵發(fā)生響應(yīng)性 斷裂，納米粒前藥解體釋放D0X，同時(shí)由于疏水作用力的消失導(dǎo)致另一疏水藥物的釋放。由 于納米粒前藥的結(jié)構(gòu)較簡單，因此當(dāng)席夫堿鍵斷裂之后會導(dǎo)致所有藥物的快速釋放，以殺 傷腫瘤細(xì)胞。
[0016] 優(yōu)選的，PEG的分子量為2000,作為Golden standard的親水段長度，能夠有效的 改善DOX的水溶性及藥代動(dòng)力學(xué)特性，明顯的降低RES對納米粒的體循環(huán)清除。
[0017] 優(yōu)選的，疏水性抗腫瘤藥物DOX作為納米粒前藥的疏水內(nèi)核，較強(qiáng)的疏水作用力 能夠使前藥聚集成納米粒子，由于其適宜的分子量能夠使納米粒前藥的載藥量高達(dá)20%。
[0018] 優(yōu)選的，在親水端和疏水藥物之間形成具有pH敏感的席夫堿鍵，其酸響應(yīng)性釋放 特異性高，能夠?qū)崿F(xiàn)納米粒前藥在腫瘤特定環(huán)境下的響應(yīng)性釋放及腫瘤細(xì)胞的攝取。
[0019] 優(yōu)選的，姜黃素（Curcumin，Cur)作為另一疏水藥物通過物理包覆的方式負(fù)載到納 米粒前藥內(nèi)，通過與DOX良好的疏水作用被包覆到內(nèi)核。在腫瘤特定環(huán)境下的響應(yīng)性同時(shí) 釋放兩個(gè)化療藥物，二者根據(jù)各自不同的抗腫瘤活性協(xié)同，聯(lián)合殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0020] 優(yōu)選的，在此納米粒前藥PEG-DOX基礎(chǔ)上，任何疏水藥物包括紫杉醇（PTX)、多西 他賽（TXT)、喜樹堿（CPT)、羥基喜樹堿（HCPT)、長春花堿（VLB)、地塞米松（DXM)、或博來霉 素（BLM)都可以通過物理包覆的方式負(fù)載要納米粒前藥內(nèi)，通過同時(shí)遞送和同時(shí)釋放多個(gè) 抗腫瘤藥物，實(shí)現(xiàn)聯(lián)合化療。
[0021] 本發(fā)明公開的含有具有共遞送多個(gè)藥物的pH敏感納米前藥，特點(diǎn)是： (1)載藥量高，原因是將疏水藥物直接鍵合到親水分子上。
[0022] (2)載體量低，原因是抗腫瘤藥物DOX直接作為納米粒的疏水內(nèi)核。本發(fā)明提供 的pH敏感的納米粒前藥，其pH敏感響應(yīng)性能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的特異性釋放的同時(shí)，納米粒發(fā) 生斷裂后，親水端溶于體內(nèi)，藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，降低體內(nèi)載體的蓄積。
[0023] (3)生物相容性好。其pH敏感響應(yīng)性能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的特異性釋放的同時(shí)，納米粒 發(fā)生斷裂后，藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，親水端溶于體內(nèi)可降低體內(nèi)載體的蓄積。能夠負(fù)載多個(gè) 疏水性抗腫瘤藥物。原因是納米粒前藥能夠通過疏水作用將另一種疏水藥物包覆在核內(nèi)。
[0024] (4)本發(fā)明提供了一個(gè)負(fù)載多個(gè)藥物的平臺，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)藥物在腫瘤環(huán)境內(nèi)的 同時(shí)響應(yīng)性釋放，保證了不同藥物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)一致性，并根據(jù)各自的抗腫瘤機(jī)制協(xié)同殺 傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)制備方法簡便易行，穩(wěn)定性良好，便于操作推廣。
[0025]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明實(shí)施例的pH敏感納米粒前藥示意圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例的PEG-CHO(A)納米粒前藥PEG