糞菌膠囊及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于糞菌移植技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種糞菌膠囊及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糞菌移植（FMT)，也稱(chēng)為糞菌治療或腸微生菌移植，是將健康人糞便中的功能菌 群，移植到患者胃腸道內(nèi)，重建具有正常功能的腸道菌群，實(shí)現(xiàn)腸道及腸道外疾病的診療。 目前，糞菌移植已被視為一種特殊的器官移植，用于治療難辨梭狀芽胞桿菌感染、炎癥性腸 病、腸易激綜合征、代謝綜合征、神經(jīng)發(fā)育不良與神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性腸病、腸道食 物過(guò)敏等。糞菌移植在中國(guó)應(yīng)用至少有1700年的歷史，中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)一直有用人大小便給 人治病的記載。公元300~400年間，東晉時(shí)期，葛洪《肘后備急方》（也稱(chēng)《肘后方》）即 有記載，用人糞清治療食物中毒、腹瀉、發(fā)熱并瀕臨死亡的患者。書(shū)中描述"飲糞汁一升，即 活"，可見(jiàn)具有"起死回生"之奇效，但是該治療方式卻被中國(guó)的現(xiàn)代臨床忽略了?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué) 史上，最早的糞菌移植報(bào)道于1958年，美國(guó)外科醫(yī)生BenEiseman等報(bào)道了他們對(duì)患有嚴(yán)重 偽膜性腸炎的4名患者實(shí)施糞便移植的結(jié)果。當(dāng)時(shí)，偽膜性腸炎的死亡率為75%，抗生素相 關(guān)性腹瀉的主要原因被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌感染。Eiseman等對(duì)這4名患者采用抗生素、 氫化可的松、益生菌等治療，患者仍腹瀉嚴(yán)重，并出現(xiàn)休克。無(wú)奈之下，醫(yī)生、患者及其家屬 商議，決定用患者健康家屬的大便制成糞水，對(duì)患者進(jìn)行灌腸。結(jié)果，其中3名垂危的患者 都在幾天之內(nèi)奇跡般的康復(fù)出院了，另1名患者在住院期間死于與腸道感染無(wú)關(guān)的其他疾 病。Bowden將此臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)表在《外科學(xué)》雜志。然而，在之后的20年里，幾乎沒(méi)引起人重 視。直至1981年，Bowden等報(bào)道用經(jīng)小腸置管輸入糞液的方法，成功治愈16例偽膜性腸 炎患者。現(xiàn)代糞菌移植技術(shù)主要是器械介入的方法，比如胃鏡、胃管、腸鏡、空腸管等，腹瀉 型IBS、潰瘍性結(jié)腸炎等治療需要多次移植，而每次糞便菌群都需要通過(guò)導(dǎo)管經(jīng)過(guò)胃、十二 指腸，注入十二指腸遠(yuǎn)端，過(guò)程復(fù)雜，患者有一定痛苦，應(yīng)用受到限制。制備的糞菌樣本在室 溫存放時(shí)間短，需要立即進(jìn)行移植，加入無(wú)菌甘油后雖然可以置于-80°C冰凍，但是取用不 便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的第一目的在于提供一種糞菌膠囊及其制 備與應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種糞菌膠囊的制備方法，包括如下步驟：
[0006] (1)糞菌液制備；
[0007] (2)將步驟（1)所得糞菌液加入凍干保護(hù)劑后，冷凍干燥，得糞菌凍干粉；
[0008] (3)將步驟（2)所得糞菌凍干粉裝入膠囊中，得糞菌膠囊。
[0009] 優(yōu)選地，步驟（1)中，糞菌液的制備方法為：
[0010] 1)初步攪拌：將供體糞便樣本，加入無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行初步均質(zhì)處理，得到糞便 漿體；
[0011] 2)初步過(guò)濾：將步驟1)中所得糞便漿體過(guò)濾去除大顆粒物質(zhì)；
[0012] 3)將步驟2)所得樣本稱(chēng)重并在勻漿器中進(jìn)一步勻質(zhì)處理；
[0013] 4)將步驟3)所得樣本逐級(jí)過(guò)濾或多次過(guò)濾；
[0014] 5)離心、懸?。簩⒉襟E4)所得樣本離心，將所得沉淀再懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，得 糞菌液。
[0015] 優(yōu)選地，步驟1)中，糞便樣本采用2h內(nèi)的新鮮糞便樣本。
[0016] 優(yōu)選地，步驟1)中，100~150g糞便樣本加入250ml無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行初步均質(zhì) 加工。更優(yōu)選，120g糞便樣本加入250ml無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行初步均質(zhì)加工。
[0017] 優(yōu)選地，步驟2)中，采用不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾。
[0018] 優(yōu)選地，步驟3)中，在氮?dú)馍锕こ虖N內(nèi)進(jìn)行稱(chēng)重和進(jìn)一步勻質(zhì)處理。
[0019] 優(yōu)選地，步驟4)中，逐級(jí)過(guò)濾是指依次經(jīng)過(guò)直徑2. 0mm、I. 0mm、0. 4mm和0.1 mm的 濾網(wǎng)。多次過(guò)濾是指經(jīng)過(guò)直徑0.25mm的濾網(wǎng)2~3次。步驟4)的作用是去除未吸收的食 物殘?jiān)托☆w粒物質(zhì)。
[0020] 為了更好地保護(hù)糞菌中的益生菌，提高細(xì)菌凍干存活率，本發(fā)明對(duì)凍干保護(hù)劑進(jìn) 行了優(yōu)化。
[0021] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述凍干保護(hù)劑為復(fù)合凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑各組分 的質(zhì)量體積濃度為：谷氨酸〇. 5~2. 0% ;脫脂乳6. 0~8. 0% ;甘露醇2. 0~3. 0% ;果糖 8. 0 ~10. 0% ;維生素 C 0· 2 ~0· 4%。
[0022] 質(zhì)量體積濃度的單位為g/100ml。
[0023] 更優(yōu)選的，所述凍干保護(hù)劑各組分的質(zhì)量體積濃度為：谷氨酸1.0% ;脫脂乳 7.0% ;甘露醇2.5% ;果糖9.0% ;維生素 C 0.3%。
[0024] 所述凍干保護(hù)劑的溶劑為無(wú)菌生理鹽水。
[0025] 所述凍干保護(hù)劑無(wú)藥理活性，可在凍干和保存時(shí)維持糞便菌群的穩(wěn)定性。并非任 意一種凍干保護(hù)劑對(duì)于糞便菌群都具有好的保護(hù)效果，而本發(fā)明的特殊凍干保護(hù)劑使得糞 菌中的6種菌群"雙歧桿菌"、"乳酸菌"、"擬桿菌"、"腸球菌"、"腸桿菌"、"小梭菌"的凍干存 活率均超過(guò)90. 00%。
[0026] 為了進(jìn)一步保護(hù)糞菌中的益生菌，本發(fā)明還對(duì)凍干方法進(jìn)行了考察和優(yōu)化。
[0027] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述冷凍干燥包括如下步驟：
[0028] 1)預(yù)凍：通過(guò)"兩步法"從25°C降至_80°C:第1步以1~2°C /min的速率進(jìn)行降 溫；第2步是以3~5°C /min的速率進(jìn)行降溫；總預(yù)凍時(shí)間為12~24h ;
[0029] 2)真空干燥：以真空度8~12pa，溫度-40~-60°C，真空干燥24~48h。
[0030] 上述冷凍干燥方法，比常規(guī)一步預(yù)凍后真空干燥，能夠更好地保護(hù)糞菌中各種重 要菌群的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
[0031] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述膠囊采用腸溶膠囊。
[0032] 更優(yōu)選，DRcap耐酸型HPMC膠囊。所述DRcap耐酸型HPMC膠囊能夠很好地保護(hù) 糞菌中各種益生菌。
[0033] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種由前述方法制備獲得的糞菌膠囊。
[0034] 本發(fā)明的第三方面，提供了前述糞菌膠囊制備方法或糞菌膠囊在糞菌移植中的用 途。
[0035] 本發(fā)明的第四方面，提供了前述糞菌膠囊制備方法或糞菌膠囊在制備炎癥性腸病 (IBD)治療藥物中的用途。
[0036] 優(yōu)選的，所述炎癥性腸病潰瘍性結(jié)腸炎（UC)或克羅恩?。–D)。
[0037] 本發(fā)明的有益效果為：
[0038] 1、菌群較為集中，可放于低溫長(zhǎng)久保存；
[0039] 2、便于菌群移植的實(shí)施，不需要侵入性的實(shí)施方式：如胃鏡、腸鏡、鼻空腸營(yíng)養(yǎng)管 等；
[0040] 3、對(duì)于虛弱的患者，增加了安全性。
[0041] 4、本發(fā)明特殊凍干保護(hù)劑的使用對(duì)于糞便菌群都具有好的保護(hù)效果。冷凍干燥方 法，比常規(guī)一步預(yù)凍后真空干燥，能夠更好地保護(hù)糞菌中各種重要菌群的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。二者的 配合，有效得提高了糞菌菌群的凍干存活率。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1:膠囊耐酸曲線圖。
[0043] 圖2 :膠囊在胃腸部位的釋放示意圖。
[0044] 圖3 :腹痛程度評(píng)分表。
[0045] 圖4 :布里斯托大便分類(lèi)法。
[0046] 圖5 :對(duì)"糞菌膠囊"治療后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清學(xué)炎性指標(biāo)進(jìn) 行了觀察，效果較為理想的患者其血中的炎癥指標(biāo)CRP于移植后第一天即出現(xiàn)了明顯的下 降，下降幅度較大，此后3天，呈現(xiàn)一個(gè)持續(xù)下降狀態(tài)，但下降幅度較第一天減少。而對(duì)于暫 時(shí)效果不明確的患者，其相關(guān)炎性指標(biāo)也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但其下降趨勢(shì)波動(dòng)較大，CRP變 化趨勢(shì)不明顯。
[0047] 圖6 :對(duì)"糞菌膠囊"治療后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清學(xué)炎性指標(biāo)進(jìn)行 了觀察，效果較為理想的患者其血中的炎癥指標(biāo)IL-6于移植后第一天即出現(xiàn)了明顯的下 降，下降幅度較大，此后3天，呈現(xiàn)一個(gè)持續(xù)下降狀態(tài)，但下降幅度較第一天減少。而對(duì)于暫 時(shí)效果不明確的患者，其相關(guān)炎性指標(biāo)也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但其下降