，37°C下避光培養(yǎng)30min，PBS洗3次，在相差顯微鏡下觀察其顏色變化（附圖8)。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著材料濃度的不斷增加，細(xì)胞被染的藍(lán)色越變?cè)缴?，這一結(jié)果說明HeLa細(xì) 胞對(duì)LAP-Fe 3O4納米顆粒具有明顯的吞噬作用。
[0063] 實(shí)施例5
[0064] 為了進(jìn)一步定量分析HeLa細(xì)胞對(duì)實(shí)施例1制備的LAP-Fe3O4納米顆粒的吞噬情 況，將2X IO5/孔的HeLa細(xì)胞接種在12孔板中，并加入ImL DMEM培養(yǎng)基，在5 % 0)2和 37°C條件下培養(yǎng)過夜，使其貼壁，棄去培養(yǎng)基，每孔更換900 μ L DMEM培養(yǎng)基，并分別添加 100 μ L不同濃度的本發(fā)明制備的LAP-Fe3O4納米顆粒（最終Fe元素濃度為0. 1-1. 2mM)和 PBS緩沖液（對(duì)照組）共培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3-5次，通過胰酶消化，離心，用ImL王 水（鹽酸/硝酸；體積比3 : 1)消化，然后利用ICP-OES測(cè)試法測(cè)量細(xì)胞吞噬的Fe濃度。 結(jié)果顯示（附圖9)，經(jīng)LAP-Fe3O 4納米顆粒（I. 2mM)處理的細(xì)胞，其吞噬量達(dá)到13. 65pg/ cell。這一結(jié)果說明LAP-Fe3O4納米顆粒易于被腫瘤細(xì)胞所吞噬，從而獲得理想的造影效 果。
[0065] 實(shí)施例6
[0066] 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，本發(fā)明評(píng)價(jià)了本發(fā)明制備的LAP-Fe3O4納米顆粒的細(xì)胞MR成像 效果。在DMEM培養(yǎng)基中加入實(shí)施例1所得到的LAP-Fe 3O4納米顆粒，配制鐵濃度分別為0. 1、 0· 2、0· 4、0· 8 和 I. 6mM 的培養(yǎng)液。
[0067] 將HeLa細(xì)胞以1父106/孔密度種植于6孔板中，在5%0)2和37°〇下以211〇1^]\1 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜貼壁，棄去培養(yǎng)基，每孔更換180 μ L DMEM培養(yǎng)基，并分別添加20 μ L不同 濃度的LAP-Fe3O4納米顆粒（最終Fe元素濃度為0· 1、0· 2、0· 4、0· 8和I. 6mM)和PBS緩沖 液（對(duì)照組），在5% 0)2和37°C下共同培養(yǎng)6小時(shí)。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3-5次， 胰酶消化，離心，懸浮于ImL的PBS緩沖液中（含0. 5%瓊脂糖）。用臨床核磁共振系統(tǒng)掃 描樣品，記錄不同濃度材料共培養(yǎng)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度（附圖10)。
[0068] 如圖10所示，為HeLa細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液和不同鐵濃度的LAP-Fe3O 4納米顆粒處 理4小時(shí)后的T2加權(quán)MR成像圖片（a)和信號(hào)值柱狀圖（b)，
[0069] 如圖10(a)所示，隨著Fe濃度的升高，LAP-Fe3O4納米顆粒處理后的細(xì)胞均表 現(xiàn)出MRI信號(hào)減弱的趨勢(shì)，說明隨著材料濃度的增加，細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吞噬量也增加， LAP-Fe3O4納米顆粒的成像效果逐漸增強(qiáng)。圖10(b)是細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的納米顆粒處理 后的MRI信號(hào)值，從圖中明顯看出，隨著Fe濃度的升高，細(xì)胞的MRI信號(hào)值逐漸降低。這些 結(jié)果表明本發(fā)明制備的LAP-Fe 3O4納米顆粒具有很好的細(xì)胞磁共振成像效果。
[0070] 實(shí)施例7
[0071] 為了評(píng)價(jià)本發(fā)明材料在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)際的成像效果，在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建HeLa移植瘤 模型，通過尾靜脈注射本發(fā)明實(shí)施例1所得的LAP-Fe 3O4納米顆粒的生理鹽水溶液（鐵含量 為930 μ g/mL，0.1 mL)，用臨床核磁共振系統(tǒng)采集得到裸鼠的磁共振圖象（附圖11)，測(cè)定腫 瘤部位的MRI信號(hào)值（附圖12)。
[0072] 如圖11所示，與注射前相比，在注射LAP-Fe3O4的生理鹽水溶液（Fe :930 μ g/mL， 0.1 mL)后2小時(shí)到4小時(shí)內(nèi)，裸鼠腫瘤部位明顯變暗，說明LAP-Fe3O4納米顆粒在腫瘤部位 富集，展示出LAP-Fe 3O4納米顆粒具有明顯的MRI腫瘤診斷效果。6小時(shí)后，MR成像效果顯 示腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度有一定程度的增強(qiáng)，表明材料已經(jīng)逐漸的從腫瘤部位代謝排出。圖 12是相應(yīng)注射時(shí)間點(diǎn)的腫瘤部位MRI信號(hào)值變化。在注射后，裸鼠腫瘤部位的MRI信號(hào)值 逐漸降低，在4小時(shí)達(dá)到最低。6小時(shí)后，腫瘤部位的MRI信號(hào)值回升，這一結(jié)果與圖9相一 致。體內(nèi)成像結(jié)果說明本發(fā)明制備的LAP-Fe 3O4納米顆粒能夠在體內(nèi)循環(huán)過程中被動(dòng)靶向 到腫瘤部位，具有良好的腫瘤MR成像效果。
[0073] 實(shí)施例8
[0074] 以實(shí)施例7構(gòu)建的HeLa腫瘤模型裸鼠來研宄本發(fā)明制備的LAP-Fe3O 4納米顆粒 在生物體內(nèi)各組織的分布代謝情況（附圖13)。向裸鼠尾靜脈注射本發(fā)明實(shí)施例1制備的 LAP-Fe3O4納米顆粒的PBS溶液（[Fe] = 5mg/mL，0.1 mL)，分別在12h和24h處死裸鼠；取出 各個(gè)器官并稱重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-OES測(cè)定各個(gè)組織器 官中鐵的含量，并以空白老鼠作為參考對(duì)照。如圖13所示，在注射材料12h后，肝、脾和肺 中鐵的含量較注射前均明顯增加，而在注射材料24h之后，裸鼠體內(nèi)的鐵逐漸減少，說明本 發(fā)明制備的LAP-Fe 3O4納米顆粒能在裸鼠體內(nèi)正常的代謝清除。
[0075] 對(duì)比例1
[0076] 將0· 721g六水合氯化鐵（FeCl3 · 6H20)和0· 263g四水合氯化亞鐵（FeCl2 · 4H20) 溶于2. 67mL水中，加入0. 089mL的HCl (37% )溶液，并于N2保護(hù)下80°C攪拌10分鐘；然后 將混合溶液逐滴加入60mL的NaOH(2g)溶液中，N 2保護(hù)下持續(xù)攪拌混合均勻，于80°C反應(yīng) 2小時(shí)；自然冷卻，得到黑色的Fe3O4納米顆粒。將制備的Fe 304納米顆粒溶液磁分離3次， 離心10分鐘去除大顆粒沉淀，然后取上層溶液定容到50mL。取5mL上層液冷凍干燥，用于 X-射線衍射檢測(cè)，結(jié)果見附圖1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括： 步驟1 :在隊(duì)保護(hù)下，將鋰皂石（LAP)分散于超純水中，攪拌10~15分鐘，得到鋰皂石 分散液；在N2保護(hù)下，將三價(jià)鐵鹽和二價(jià)鐵鹽溶解于鹽酸水溶液中，再逐滴加至鋰皂石分散 液中，攪拌10~15分鐘，得到混合溶液；在N2保護(hù)下，將NaOH水溶液加入到上述的混合溶 液中，在75-85°C水浴中攪拌反應(yīng)1-3小時(shí)，即得到黑色的LAP-Fe3O4納米顆粒； 步驟2 :將制備的LAP-Fe3O4納米顆粒磁分離，去除上層溶液中未負(fù)載Fe304納米顆粒的 鋰皂石；離心，去除離心沉淀物，即為純化的LAP-Fe3O4分散液。2. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的鋰皂石分散液的濃度為6~10mg/mL。3. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的二價(jià)鐵鹽為四水合氯化亞鐵，三價(jià)鐵鹽為六水合氯化鐵，兩者的摩爾 比為I:1. 8~I:2. 0。4. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的鹽酸水溶液的濃度為I. 〇%~1. 5%。5. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的鋰皂石、二價(jià)鐵鹽和三價(jià)鐵鹽的投料質(zhì)量比為〇. 5 :0. 248 :0. 676~ 0? 5 :0? 285 :0? 773〇6. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的鋰皂石與NaOH水溶液中所含有的NaOH的質(zhì)量比為0. 5 :1. 5~2. 0。7. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟1中的水浴溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。8. 如權(quán)利要求1所述的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在 于，所述的步驟2中的離心的轉(zhuǎn)速為5000~6000rpm，離心時(shí)間為5~10分鐘。9. 一種用于腫瘤診斷的MRI造影劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的 制備方法所制備的鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鋰皂石負(fù)載磁性四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括：步驟1：在N2保護(hù)下，將鋰皂石分散于超純水中，攪拌10～15分鐘，得到鋰皂石分散液；在N2保護(hù)下，將三價(jià)鐵鹽和二價(jià)鐵鹽溶解于鹽酸水溶液中，再逐滴加至鋰皂石分散液中，攪拌10～15分鐘，得到混合溶液；在N2保護(hù)下，將NaOH水溶液加入到上述的混合溶液中，在75-85℃水浴中攪拌反應(yīng)1-3小時(shí)，即得到黑色的LAP-Fe3O4納米顆粒；步驟2：將制備的LAP-Fe3O4納米顆粒磁分離，去除上層溶液中未負(fù)載Fe3O4納米顆粒的鋰皂石；離心，去除離心沉淀物，即為純化的LAP-Fe3O4分散液。本發(fā)明制備的LAP-Fe3O4納米顆粒粒徑分布均勻、粒徑較小，弛豫率高、造影效果顯著，具有良好的膠體穩(wěn)定性，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。
【IPC分類】A61K49/08
【公開號(hào)】CN104922701
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510165977
【發(fā)明人】郭睿, 丁玲, 史向陽
【申請(qǐng)人】東華大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年4月9日