生物粘合劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物粘合劑及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)用粘合劑在醫(yī)療器械等領(lǐng)域具有許多用途，包括人體和動(dòng)物體活性組織創(chuàng)面的 封閉修復(fù)、手術(shù)創(chuàng)面的封閉止血、活性生理組織間的粘合、活性生理組織與非生理材料間的 粘合等。醫(yī)用粘合劑按材料性質(zhì)可分為化學(xué)粘合劑和生物粘合劑?；瘜W(xué)粘合劑如a_氰基 丙烯酸酯類，雖在臨床應(yīng)用多年，但其降解產(chǎn)物所產(chǎn)生的毒性難以避免。生物粘合劑如纖維 蛋白膠，是一種醫(yī)用創(chuàng)面封閉劑，是從人或動(dòng)物血漿中提取的蛋白生物制品，主要應(yīng)用于手 術(shù)創(chuàng)面止血、促進(jìn)傷口愈合、封閉缺損組織等，已在外科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但來源于異體 的人或動(dòng)物血清制成的纖維蛋白膠可能激發(fā)免疫副反應(yīng)，其安全性受到廣泛關(guān)注，同時(shí)纖 維蛋白膠粘接強(qiáng)度較低。因此急需開發(fā)相容性好、潮濕環(huán)境粘接強(qiáng)度高、可生物降解的醫(yī)用 粘合劑。
[0003] 在海洋環(huán)境中，一些成體營固著生活的無脊椎動(dòng)物，例如貽貝和藤壺，它們能夠分 泌蛋白性的粘附劑，牢固地粘附在幾乎任何水下物體表面，具有極強(qiáng)的粘結(jié)力、濕粘結(jié)特性 和耐水性，在生物醫(yī)用粘合劑、水下膠等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 貽貝和藤壺代表了兩種典型的水下粘附機(jī)制，前者主要是依靠存在于足絲粘附蛋 白中的大量3, 4-二羥基苯丙氨酸(多巴，D0PA)，而后者主要依靠粘蛋白獨(dú)特的氨基酸組成 和高級(jí)結(jié)構(gòu)。貽貝的研究由來已久，足絲粘附蛋白的提取、異源表達(dá)以及貽貝仿生粘附材 料的研究取得了較大的進(jìn)展。目前，美國已有BD Bioscience公司從紫貽貝的足部提取到 粘附蛋白并已進(jìn)行商業(yè)化，名稱和貨號(hào)分別為BD CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE， catalog NO 354240, 35424UBD Cell-Tak用作細(xì)胞和組織粘附劑，可以增強(qiáng)細(xì)胞或者組織 在各種材料表面(包括塑料、玻璃、金屬和各種生物材料)上的粘附。但是貽貝分泌蛋白的量 很少，提取成本高且價(jià)格昂貴，很難滿足需求。而通過基因工程手段表達(dá)重組的粘附蛋白存 在對(duì)翻譯后修飾的依賴，使得表達(dá)功能性的細(xì)菌重組貽貝粘著蛋白變得困難；仿生粘附材 料因其結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單以及生物相容性等，難以與真正的生物膠媲美。
[0005] 而藤壺較貽貝在水下表面的粘附更為牢固，以致它們的個(gè)體死亡后，鈣質(zhì)外殼仍 被緊緊粘附在基材表面，實(shí)現(xiàn)牢固的水下粘附。相比于貽貝，藤壺代表了另一種全新的水下 粘附模型。研究表明，藤壺粘著蛋白不存在翻譯后修飾現(xiàn)象，因而更易通過生物合成的方式 獲得細(xì)菌重組蛋白。
[0006] 日本科學(xué)家用基因工程的方法表達(dá)了紅巨藤壺中的膠蛋白cpl9k、cp20k，廈門大 學(xué)的研究人員表達(dá)了白脊藤壺cp20k蛋白并進(jìn)行了功能研究，表明cp20k能選擇性地粘附 在金屬等基體材料表面，而cpl9k在水下粘附中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，能夠粘附在水下不 同物理化學(xué)特性的材料表面，但目前對(duì)白脊藤壺處基因的克隆和表達(dá)及其粘附性 能的研究未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種粘附能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、 制備成本低的生物粘合劑，還提供了一種制備方法簡(jiǎn)單、制備成本低的制備方法；該生物粘 合劑可應(yīng)用于非生理材料之間、生理材料之間、非生理材料和生理材料之間的粘結(jié)。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方法： 本發(fā)明的一種生物粘合劑，包括Trx-Balcpl9k融合蛋白，所述Trx-Balcpl9k蛋白的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 上述的生物粘合劑，優(yōu)選的，還包括溶劑。
[0010] 上述的生物粘合劑，優(yōu)選的，生物粘合劑的溶劑為醋酸或水。進(jìn)一步優(yōu)選的，醋酸 的體積濃度為5%~10%。
[0011] 上述的生物粘合劑，優(yōu)選的，所述Trx-Balcpl9k蛋白在所述生物粘合劑中的濃度 為 0? 98 ~1. 78 mg/mL。
[0012] 作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種生物粘合劑的制備方法，所述制備 方法為：Sl、從白脊藤壺軟組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA; 52、 以步驟Sl中第一鏈cDNA為模板，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中白脊藤壺你處基因 序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 53、 將所述步驟S2中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中構(gòu)建重組質(zhì) 粒； 54、 將所述步驟S3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中得到轉(zhuǎn)化子； 55、 將所述步驟S4中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到表達(dá)產(chǎn)物； 56、 將所述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鎳親和層析純化得到Trx-Balcpl9k洗脫液； 57、 將所述Trx-Balcpl9k洗脫液進(jìn)行透析過夜，得到Trx-Balcpl9k蛋白。
[0013] 上述的制備方法，優(yōu)選的，還包括以下步驟：將Trx_Balcpl9k蛋白溶于溶劑中得 到生物粘合劑。進(jìn)一步的，溶劑為醋酸時(shí)：將醋酸配制成體積濃度為5%~10%的醋酸溶液， 將Trx-Balcpl9k蛋白溶于所述醋酸溶液中配制成生物粘合劑。進(jìn)一步的，溶劑為水時(shí)：將 Trx-Balcpl9k蛋白溶于水中配制成生物粘合劑。
[0014] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中設(shè)計(jì)的引物為：SEQ ID NO. 3所示的核苷 酸序列、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
[0015] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S6中所述親和層析具體包括以下步驟： S6-1、將表達(dá)產(chǎn)物置于層析柱上用咪唑濃度為50~80mM的咪唑緩沖液(咪唑緩沖液的 成分為：50~80mM咪唑、50mM磷酸氫二鈉、300mM氯化鈉，pH 8. 0)作為漂洗液漂洗層析柱， 以去除非特異結(jié)合的雜蛋白； S6-2、用咪唑濃度為250~300mM的咪唑緩沖液(咪唑緩沖液的成分為：250~300mM 咪唑、50mM磷酸氫二鈉、300mM氯化鈉，pH 8. 0)作為洗脫液洗脫層析柱，獲得Trx-Balcpl9k 洗脫液。
[0016] 上述的制備方法，優(yōu)選的，親和層析過程中，漂洗液的體積至少為柱床體積的5 倍。
[0017] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S6-1中，作為漂洗液的咪唑緩沖液的流速為 2. 5 ~5ml/min〇
[0018] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S6-2中，作為洗脫液的咪唑緩沖液的流速為 2. 5 ~5ml/min〇
[0019] 上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟S7中所述透析過程中采用的透析液為去離子 水。進(jìn)一步優(yōu)選的，去離子水的pH為6~7。
[0020] 作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的生物粘合劑或所述制備方法 制備得到的生物粘合劑在生理材料之間粘結(jié)中的應(yīng)用。
[0021] 作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的生物粘合劑或所述制備方法 制備得到的生物粘合劑在非生理材料之間粘結(jié)中的應(yīng)用。
[0022] 作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種所述的生物粘合劑或所述制備方法 制備得到的生物粘合劑在非生理材料與生理材料之間粘結(jié)中的應(yīng)用。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： (1)本發(fā)明提供了一種生物粘合劑，該粘合劑主要由Trx-Balcpl9k融合蛋白構(gòu)成， Trx_Balcpl9k蛋白是由白脊藤壺處基因經(jīng)克隆、表達(dá)后純化得到。該Trx_Balcpl9k 蛋白粘合劑具有粘附性能強(qiáng)、產(chǎn)量高、制備成本低等優(yōu)勢(shì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0024] (2)本發(fā)明提供了一種生物粘