新型生物補(bǔ)片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及2種生物補(bǔ)片，即肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的制備方法，提供了一種具備良好的生物力學(xué)特性和生物相容性的天然生物補(bǔ)片材料。方法為：獲取豬的肌腱和小腸漿膜為原料；脫細(xì)胞過程中全程使用包含一種保護(hù)肌腱和小腸漿膜支架結(jié)構(gòu)的保護(hù)液；采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離肌腱和小腸漿膜組織內(nèi)的細(xì)胞；采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核；利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片；使用保護(hù)液進(jìn)行漂洗。本發(fā)明在細(xì)胞核脫凈的基礎(chǔ)上，最大限度的降低了肌腱和小腸漿膜組織內(nèi)的免疫原性，同時(shí)保留了組織的正常膠原纖維的三維結(jié)構(gòu)及排列極性，適用于組織缺損修復(fù)、組織材料充填等。因其具有生物纖維材料的特性，還可廣泛應(yīng)用于其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【專利說明】
新型生物補(bǔ)片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為新型的肌腱和小腸漿膜組織補(bǔ)片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)、膀胱、血管、肌腱、腹壁及眼的結(jié)膜等組織缺損的修復(fù)中最大的難題是修復(fù)材料。目前國內(nèi)外用外科補(bǔ)片的材料絕大部分是合成材料，如聚丙烯補(bǔ)片(PP)和聚酯補(bǔ)片(PE)等。其最大的缺陷是抗感染率低，組織相容性差，及物理刺激引起的無菌炎癥和慢性排異引起的后遺癥，甚至造成修補(bǔ)的器官發(fā)生感染和與周圍組織發(fā)生粘連。近幾年發(fā)展的半吸收復(fù)合材料，如聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，常因降解過快導(dǎo)致失去療效。而使用合成材料和復(fù)合材料可能導(dǎo)致諸多臨床并發(fā)癥，均不是理想的組織修補(bǔ)材料。隨著生物材料的出現(xiàn)一一尋找具有良好組織屏障作用和抗感染能力強(qiáng)的低細(xì)胞毒性、低抗原性的生物材料應(yīng)用于臨床迫在眉睫。
[0003]肌腱和小腸的漿膜是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，主要由1、III型纖維膠原蛋白構(gòu)成，并具有彈性結(jié)締組織復(fù)雜的成分結(jié)構(gòu)，是理想的生物支架材料。另外，小腸的漿膜中還含有多種生長因子，即使經(jīng)過脫細(xì)胞處理后依然保留，這些生長因子在組織的修復(fù)和重構(gòu)中有著重要的促進(jìn)作用，優(yōu)于目前臨床應(yīng)用的其它細(xì)胞外基質(zhì)材料和人工聚合物。
[0004]國外已經(jīng)有多種商品化的小腸脫細(xì)胞產(chǎn)品，如Surgisis，Restore等產(chǎn)品；在我國也有相關(guān)專利如“脫細(xì)胞小腸粘膜下層生物材料”(申請?zhí)?00810150792.5)和“一種脫細(xì)胞生物補(bǔ)片及其制備方法和裝置”(申請?zhí)?01310117569.1)等，這些產(chǎn)品的問題在于脫細(xì)胞方法不完善，例如處理方法僅使用低濃度過氧乙酸處理，細(xì)胞殘留較多，脫細(xì)胞效果欠佳，使用中會引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng);或加用乙醇等進(jìn)行脫細(xì)胞;或應(yīng)用長時(shí)間浸泡;或采用超聲、反復(fù)凍融、核酸酶進(jìn)行脫細(xì)胞處理，這些處理造成被脫組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性破壞，使得脫細(xì)胞肌腱和小腸組織材料內(nèi)所包含的生長因子不能發(fā)揮作用。
[0005]因此針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明采用高靜壓技術(shù)聯(lián)合少量的酶和去垢劑脫除細(xì)胞核，并全程應(yīng)用保護(hù)液進(jìn)行保護(hù)的方法，提供了兩種既降低了組織的免疫原性，又保留了其正常膠原結(jié)構(gòu)的優(yōu)質(zhì)生物補(bǔ)片。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種快速、全程使用特殊保護(hù)液以及適宜高效的物理聯(lián)合復(fù)合生物酶制備肌腱和小腸漿膜的脫細(xì)胞支架以用作生物補(bǔ)片的方法。
[0007]本發(fā)明的創(chuàng)新處在于:1、肌腱和小腸漿膜的脫細(xì)胞過程中全程使用一種肌腱和小腸漿膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)液;2、采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離肌腱和小腸漿膜組織內(nèi)的細(xì)胞;3、采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核;4、利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片;5、使用保護(hù)液進(jìn)行漂洗。脫細(xì)胞步驟設(shè)定合適的溫度、時(shí)間以及去垢劑、消化酶濃度對肌腱和小腸漿膜組織進(jìn)行處理。
[0008]保護(hù)液的成分為:DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基粉末5-10g/L、L-組氨酸鹽酸鹽2.87-3.83g/L、硫酸軟骨素25-30g/L、低分子右旋糖酐20-35g/L、羥丙基甲基纖維素2-8g/L、別嘌呤醇0.5-
0.Sg/UHEPES 緩沖液 20-25ml/L、鹽酸地塞米松 l-2mg/L、還原型谷胱苷肽 1.5-3g/L 以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。
[0009]調(diào)節(jié)保護(hù)液的ph值為7.2-8.0，滲透壓為300-400m0sm/kgH20。
[0010]高靜壓壓力條件為200-400MP，高靜壓頻率為2_5次，每次為1_2分鐘。
[0011 ] DNA酶的濃度為100-10000U/ml，核酸酶的濃度為100-10000U/ml ANA酶或核酸酶的脫細(xì)胞核時(shí)間為1-4小時(shí)，處理溫度為15-30度。
[0012]去垢劑條件濃度為0.5-8%的TritonX-100，去垢劑使用時(shí)間為1-4小時(shí)。
[0013]可選擇性的同時(shí)或分開進(jìn)行酶和去垢劑的處理。
[0014]在保護(hù)液中漂洗0.5-4小時(shí)。
[0015]將制備的肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片貼附在硝酸纖維素膜上，放入無水氯化鈣分子篩內(nèi)脫水，經(jīng)裝袋密封并標(biāo)記，后經(jīng)鈷60照射滅菌，以4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0016]在臨床使用前將保存的肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片放入4000U的妥布霉素生理鹽水溶液浸泡1分鐘。
【附圖說明】
[0017]圖1為小腸的結(jié)構(gòu)說明圖，最下層為本發(fā)明所采用的小腸漿膜
[0018]圖2為正常兔小腸的切片HE染色，最上層為漿膜層
[0019]圖3為兔小腸漿膜脫細(xì)胞切片DAPI染色
[0020]圖4為正常豬肌腱切片HE染色
[0021]圖5為脫細(xì)胞豬肌腱切片HE染色
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，這些實(shí)施例只用于進(jìn)一步詳述說明本發(fā)明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)做出非本質(zhì)的調(diào)整需本發(fā)明方授權(quán)。
[0023]為說明采用本發(fā)明獲得的脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的安全和有效性，以下的實(shí)施例，在除去對照組條件外，均全部采用下述的條件、步驟與具體實(shí)施方案。
[0024]本發(fā)明的實(shí)施例1
[0025]肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片脫細(xì)胞保護(hù)液的配制:
[0026]1、取DMEM粉末8g加入去離子水500ml，溶解后高壓滅菌；
[0027]2、取硫酸軟骨素30g加入去離子水275ml加熱溶解高壓滅菌，制成硫酸軟骨素溶液;低分子右旋糖苷35g加入注射用水10ml溶解高壓滅菌，制成低分子右旋糖苷溶液;L-組氨酸鹽酸鹽3.83g，加入注射用水100ml溶解高壓滅菌，制成L-組氨酸鹽酸鹽溶液；
[0028]3、取無菌容器加入DMEM培養(yǎng)液500ml，高壓滅菌硫酸軟骨素275ml，低分子右旋糖酐溶液100ml，L-組氨酸鹽酸鹽溶液100ml，Ifepes緩沖液25ml;加入別嘌呤醇0.5g，羥丙基甲基纖維素6g，還原型谷胱苷肽1.5g，地塞米松注射液1.8mg，左氧氟沙星注射液0.1g混勾；
[0029]4、調(diào)節(jié)PH 值至 7.4，滲透壓為 350m0sm/kgH20
[0030]本發(fā)明的實(shí)施例2
[0031]脫細(xì)胞豬肌腱補(bǔ)片的制備。
[0032]1、取新鮮(宰后3小時(shí)內(nèi)取得)豬大腿肌腱組織，必須保證肌腱外膜完整。將肌腱腱膜切開做出I X 3cm的肌腱組織片，密封在盛有保護(hù)液的塑料袋中；
[0033]2、于400MP高靜壓條件下，處理4次，每次時(shí)間為2分鐘；
[0034]3、將肌腱取出后，置于含2%TritonX-100+600U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為250C，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理2小時(shí)；
[0035]4、去垢劑與酶處理完畢后，取出脫細(xì)胞肌腱置于保護(hù)液中漂洗2小時(shí)；
[0036]5、制備的脫細(xì)胞肌腱貼附在硝酸纖維素模上，放入無水氯化鈣分子篩內(nèi)脫水，經(jīng)裝袋密封并標(biāo)記，后經(jīng)鈷60照射，制備成用于脫細(xì)胞肌腱材料，以4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0037]6、在臨床使用前將保存的脫細(xì)胞肌腱放入4000U的妥布霉素生理鹽水溶液浸泡10分鐘。
[0038]本發(fā)明的實(shí)施例3
[0039]脫細(xì)胞豬小腸漿膜補(bǔ)片的制備。
[0040]1、取新鮮(宰后3小時(shí)內(nèi)取得)豬小腸(包括空腸和回腸)組織用水沖洗干凈，切成5cm段;鈍性刮除小腸粘膜、粘膜下層和肌層，僅留下纖維漿膜層，用PBS漂洗干凈;將小腸纖維漿膜層組織制為I X 3cm的組織片，密封在盛有上述保護(hù)液的塑料袋中；
[0041 ] 2、于300MP高靜壓條件下，處理4次，每次時(shí)間為I分鐘；
[0042]3、將小腸片取出后，置于含1.5%TritonX-100+500U/ml DNA酶的保護(hù)液中，溫度為25°C，設(shè)定搖床速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，處理I小時(shí)；
[0043]4、去垢劑與酶處理完畢后，取出脫細(xì)胞小腸纖維漿膜置于保護(hù)液中漂洗2小時(shí)；
[0044]5、制備的脫細(xì)胞小腸漿膜片貼附在硝酸纖維素膜上，放入無水氯化鈣分子篩內(nèi)脫水，經(jīng)裝袋密封并標(biāo)記，后經(jīng)鈷60照射，制備成脫細(xì)胞小腸漿膜補(bǔ)片材料，以4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0045]6、在臨床使用前將保存的脫細(xì)胞小腸纖維漿膜放入4000U的妥布霉素生理鹽水溶液浸泡1分鐘。
[0046]本發(fā)明的實(shí)施例4
[0047]脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的結(jié)構(gòu)觀察
[0048]將實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的組織結(jié)構(gòu)帶行染色后，對兩組標(biāo)本給予石蠟包埋，切片(5μπι)、ΗΕ染色觀察。觀察細(xì)胞核成分(蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，與正常肌腱和小腸漿膜作比較?？焖倮鋬銮衅Ｒ?guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI) (Invitrogen，美國)熒光染色，檢測脫細(xì)胞程度。結(jié)果:脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜的組織切片中無完整的細(xì)胞及DAPI陽性染色的細(xì)胞。
[0049]本發(fā)明的實(shí)施例5
[0050]脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的免疫原性檢測
[0051 ]對實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片與未處理的肌腱和小腸漿膜組織片作比較，進(jìn)行新西蘭大白兔皮下包埋實(shí)驗(yàn)，以檢測其是否可引起動物免疫原性反應(yīng)，分別于植入后第I和第4周后取樣，將其制作成組織學(xué)切片進(jìn)行觀察，結(jié)果表明脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片不引起明顯的免疫原性反應(yīng)，切片觀察可見脫細(xì)胞的兩種組織周圍無明顯的炎癥及淋巴細(xì)胞，有少許纖維母細(xì)胞。而未脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜組織片，術(shù)后I周包埋處充血腫脹，4周出現(xiàn)包塊，組織病理見大量纖維包裹肌腱和小腸漿膜，有大量的炎癥及淋巴細(xì)胞，并發(fā)生肌腱和小腸漿膜溶解改變。
[0052]本發(fā)明的實(shí)施例5
[0053]PCR檢測脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的DNA殘留情況
[0054]用PCR的方法對實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的DNA殘留情況進(jìn)行檢測并和未處理的組織片檢測結(jié)果比較。結(jié)果表明未處理的肌腱和小腸漿膜組織中均檢測到DNA殘留；而從所制備的脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜中未檢測到DNA殘留，證明本發(fā)明的脫細(xì)胞肌腱或韌帶的制備方法能徹底脫除細(xì)胞殘留成分。
[0055]本發(fā)明的實(shí)施例6
[0056]豬脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片的生物力學(xué)檢測
[0057]取10條脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜縱向IX3cm的條帶補(bǔ)片，作為生物力學(xué)檢測樣本，取相同部位、相同大小的10條新鮮豬大腿肌腱和小腸漿膜作為比較。使用生物力學(xué)儀檢測生物力學(xué)性能，持續(xù)牽拉，測試樣本中間斷裂為準(zhǔn)。其中I個(gè)脫細(xì)胞肌腱在鉗夾端斷裂，不納入比較。使用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)分析脫細(xì)胞對生物力學(xué)的影響。結(jié)果見彈性模量、最大位移、最大載荷均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明脫細(xì)胞前后肌腱和小腸漿膜生物力學(xué)無明顯改變。
[0058]本發(fā)明的實(shí)施例7
[0059]豬脫細(xì)胞小腸漿膜補(bǔ)片的功能檢測
[0060]新西蘭大白兔結(jié)膜缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珹、新西蘭大白兔結(jié)膜缺損模型組，即剪去兔1/4瞼和球結(jié)膜，2周后出現(xiàn)缺損的眼球表面糜爛。B、新西蘭大白兔結(jié)膜缺損，羊膜移植組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M，即剪去兔1/4瞼和球結(jié)膜后，同時(shí)在結(jié)膜缺損面行羊膜移植覆蓋創(chuàng)面，2周后出現(xiàn)羊膜組的羊膜組織已開始溶解，而破損組并未有新的結(jié)膜組織長出，創(chuàng)面暴露。C、新西蘭大白兔結(jié)膜缺損、脫細(xì)胞小腸漿膜補(bǔ)片移植組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停醇羧ネ?/4瞼和球結(jié)膜后，同時(shí)在結(jié)膜缺損面行脫小腸漿膜移植覆蓋創(chuàng)面，2周后移植的脫細(xì)胞漿膜補(bǔ)片在位，創(chuàng)面修復(fù)。
[0061 ]本發(fā)明的實(shí)施例8
[0062]豬脫細(xì)胞肌腱補(bǔ)片的功能檢測
[0063]新西蘭大白兔腹壁缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，A、新西蘭大白兔腹壁缺損模型組，即切除3cmX3cm兔腹壁的纖維膜和相對應(yīng)的腹肌，僅保留表層皮膚，2周后出現(xiàn)缺損的腹壁膨出。B、新西蘭大白兔腹壁缺損模型組，即切除3cmX3cm兔腹壁的纖維膜和相對應(yīng)的腹肌，僅保留表層皮膚，同時(shí)應(yīng)用與腹壁缺失大小相同的脫細(xì)胞的肌腱補(bǔ)片進(jìn)行修補(bǔ)，2周后移植脫細(xì)胞肌腱補(bǔ)片的部位未見腹壁膨出，創(chuàng)面修復(fù)良好。
[0064]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種脫細(xì)胞肌腱和小腸漿膜組織作為新型生物補(bǔ)片的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取豬的肌腱，清除肌腱表面的外膜和滑膜組織；取豬的空腸和回腸用水沖洗干凈，鈍性刮除小腸粘膜、粘膜下層和肌層，僅留下漿膜纖維層，用PBS漂洗干凈； (2)肌腱和小腸漿膜纖維層脫細(xì)胞過程中全程使用一種保護(hù)肌腱和小腸漿膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)液； (3)采用高靜壓技術(shù)預(yù)分離肌腱和小腸漿膜組織內(nèi)的細(xì)胞，通過物理的方法將肌腱和小腸漿膜結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞松解和破碎； (4)采用復(fù)合核酸酶方法消化殘余細(xì)胞核； (5)利用去垢劑脫除松散破碎細(xì)胞片； (6)用保護(hù)液對肌腱和小腸漿膜進(jìn)行漂洗。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，獲取的成年豬肌腱和小腸漿膜，經(jīng)處理清洗，制為I?3cm X 3?5cm大小的補(bǔ)片備用。3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述混合保護(hù)液的成分為:DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基粉末5-10g/L、L-組氨酸鹽酸鹽2.87-3.83g/L、硫酸軟骨素25_30g/L、低分子右旋糖酐20_35g/L、羥丙基甲基纖維素2-8g/L、別嘌呤醇0.5-0.8g/L、HEPES緩沖液20-25ml/L、鹽酸地塞米松l-2mg/L、還原型谷胱苷肽l.5-3g/L以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述混合保護(hù)液的ph值為7.2-8.0，滲透壓為300-400m0sm/kgH20。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，高靜壓技術(shù)所采用的條件為200-400MPa，高靜壓頻率為2-5次，每次為I?2分鐘。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述復(fù)合核酸酶，DNA酶的濃度為100-2000U/ml，核酸酶的濃度為100-2000U/ml，DNA酶或核酸酶的脫細(xì)胞核時(shí)間為1-4小時(shí)，處理溫度為15-30攝氏度。7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述去垢劑TritonX-100的濃度為0.5_8%，去垢劑使用時(shí)間為1-4小時(shí)。8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，于肌腱和小腸漿膜的保護(hù)液中漂洗的時(shí)間為0.5?4小時(shí)。9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，制備完成的肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片需貼附在硝酸纖維素膜上，放入無水氯化鈣分子篩內(nèi)脫水，再裝袋密封并標(biāo)記后經(jīng)鈷60照射滅菌，以4°C保存?zhèn)溆谩?0.在臨床使用前將保存的肌腱和小腸漿膜補(bǔ)片放入4000u的妥布霉素生理鹽水溶液浸泡1分鐘。
【文檔編號】A61L27/50GK105963787SQ201610511579
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】史真, 史偉云
【申請人】拜歐迪賽爾（北京）生物科技有限公司