海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中醫(yī)中藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成 分，還涉及所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 眼樹蓮（學(xué)名：Dischidiachinensis)是蘿蘑科眼樹蓮屬附生藤本植物，是中國 的特有植物，別名：瓜子金、瓜子藤、滴錫藤等。在我國主要分布于海南、廣東、廣西等省區(qū)， 在海南主要產(chǎn)于樂東、三亞、保亭等地，生長在低海拔至中海拔的山地林谷或曠地。眼樹蓮 全株入藥，有清肺化痰，涼血解毒之效，民間用于治療肺燥咳痰，咳血，百日咳，小兒疳積，痢 疾，疥瘡毒膿，鐵打腫痛，毒蛇咬傷。海南黎族地區(qū)用其全草煮水熏眼，治療眼疾。霍麗妮等 從眼樹蓮全株中分得總酚和總酮成分，經(jīng)研究顯示其具有體外抗氧化活性。目前國內(nèi)外尚 未見有關(guān)眼樹蓮急性毒性和藥理活性的研究報道，對其抗炎活性成分及提取，也很少有相 關(guān)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決以上對眼樹蓮開發(fā)應(yīng)用方面的不充分的問題，本發(fā)明提供了一種眼樹蓮 水提取物抗炎活性成分。本文采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增加、 雞蛋清誘導(dǎo)大鼠足腫脹三種炎癥模型考察眼樹蓮水提取物與乙醇提取物的抗炎效果，為進(jìn) 一步開發(fā)利用該植物的藥用資源提供理論依據(jù)。本文首次通過系統(tǒng)溶劑法，獲得眼樹蓮水 提取物不同溶劑萃取部位，通過動物藥理實驗初步篩選出其抗炎活性部位，為進(jìn)一步尋找 眼樹蓮抗炎作用的有效成分提供科學(xué)依據(jù)。
[0004] 本發(fā)明還提供了所述的眼樹蓮水提取物抗炎活性成分的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的：
[0006] -種海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分，是通過以下步驟得到的：
[0007] (1)取干燥眼樹蓮，粉碎后過40目篩，以30倍量水浸泡過夜，然后以超聲波提取 2h，超聲頻率為40~50KHz，溫度70-80°C，超聲波1. 5小時后，同時煎煮30min，重復(fù)上述浸 泡、超聲、煎煮3次，冷卻，過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，即得水提取物；
[0008] (2)取水提取物加水懸浮得懸浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，分別得 到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、石油醚萃取物。
[0009] 優(yōu)選步驟（2)中懸浮液分別用乙酸乙酯和正丁醇體積比1:1的混合溶劑，乙酸乙 酯和正丁醇體積比1:2的混合溶劑，乙酸乙酯、正丁醇和石油醚體積比1:2 :0. 1的混合溶劑 萃取。
[0010] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分，優(yōu)選步驟（2)中水提取物和水的重量 比為1:5~10。
[0011] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分，優(yōu)選步驟（2)中乙酸乙酯、正丁醇、石 油醚與懸浮液的體積比分別1:1~5。
[0012] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分，優(yōu)選步驟（2)中乙酸乙酯、正丁醇、石 油醚萃取時間分別為5~lOmin。
[0013] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分，優(yōu)選步驟（1)中超聲波輔助提取時間 為2h。
[0014] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
[0015] 所述的海南眼樹蓮水提取物抗炎活性成分與醫(yī)學(xué)上可接受載體制備成片劑、糖衣 片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、 微球劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注射 劑、注射乳劑、凍干粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 1、本發(fā)明工藝簡單，操作合理，同時可以得到眼樹蓮醇提取物的乙酸乙酯萃取物 (水）、正丁醇萃取物（水）兩個抗炎有效部位，是海南眼樹蓮這種天然產(chǎn)物在抗炎作用中 的新發(fā)現(xiàn)；
[0018] 2、以本發(fā)明所述的眼樹蓮水提取物給小鼠灌胃后，連續(xù)觀察14d，小鼠全部健存， 其外觀、食欲、行為活動、排泄等均未見異常；第14d脫頸處死并解剖，各個臟器官未見異 常。符合不同周齡昆明種小鼠體重的增長關(guān)系，說明眼樹蓮在該劑量下研究其抗炎性較安 全；
[0019] 3、眼樹蓮水提取物以最大灌胃容量0. 4mL/10g給小鼠灌胃，對小鼠最大耐受生藥 量為228. 71g/kg，眼樹蓮水提取物最大耐受劑量為今后進(jìn)行長期毒性試驗、特殊毒性試驗 和臨床研究的劑量設(shè)置提供參考；
[0020] 4、通過對抗炎活性部位的篩選，海南眼樹蓮水提取物的不同萃取物在抗炎實驗方 面有一定差異，其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物活性較好，它們高、中劑量組均對二甲苯引起 的耳腫脹、醋酸引起的毛細(xì)血管通透性增加、雞蛋清誘導(dǎo)的大鼠足腫脹均有明顯的抑制作 用，且均具有劑量依賴關(guān)系，其抑制作用與阿司匹林相當(dāng)，說明其能夠有效緩解炎癥發(fā)生過 程的早期癥狀；
[0021] 5、本發(fā)明研究結(jié)果為眼樹蓮在肺燥咳痰，咳血，百日咳，小兒疳積，痢疾，疥瘡毒 膿，鐵打腫痛，毒蛇咬傷治療的臨床用藥方面，提供了理論與實驗基礎(chǔ)；
[0022] 6、通過聚酰胺樹脂法和硅膠快速色譜法技術(shù)對正丁醇萃取物（水）和乙酸乙酯萃 取物（水）進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)正丁醇萃取物（水）和乙酸乙酯萃取物（水）總黃酮和鞣 質(zhì)總含量大于40%，化學(xué)成分的初步確定為以后單體化合物的純化和開發(fā)成抗炎藥物奠定 科學(xué)基礎(chǔ)；
[0023] 7、本發(fā)明得到乙酸乙酯萃取物（水）、正丁醇萃取物（水）兩個抗炎有效部位，可 以在藥學(xué)上接受載體或賦形劑制備成藥物制劑，這些藥物制劑可以選自以下劑型：片劑、糖 衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、泡騰片劑、舌下片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊 劑、微球劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、滴丸劑、散劑、膏劑、口服液、混懸劑、溶液劑、氣霧劑、注 射劑、注射乳劑、凍干粉針，還可以根據(jù)需要制備成緩釋或控釋制劑。
【具體實施方式】
[0024] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步說明。
[0025] 實施例1:水提取
[0026] 1材料
[0027] 1. 1藥物和試劑眼樹蓮采自海南省海口市火山口，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物研 究所戴好富研究員鑒定蘿蘑科（Asexepiadaeeae)眼樹蓮屬（DisehidiaR.B)植物眼樹蓮 (DischidiachinensisChamp.exBenth)全株。阿司匹林腸溶片（江蘇平光制藥有限責(zé) 任公司，批號：140801);伊文思藍(lán)（BS，5g，阿拉丁試劑上海有限公司）；0.9%氯化鈉注射液 (藥用級，湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司）；羧甲基纖維素（AR，500g/瓶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑 廠）；二甲苯（AR，500mL/瓶，天津大茂制藥化學(xué)試劑廠）；正丁醇、醋酸乙酯和石油醚均為 分析純。1. 2動物昆明種小鼠，清潔級，體重質(zhì)量18~22g，長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提 供，實驗動物使用許可證號：SCXK(湘）2014-0011，合格證號：43006700005502。SD大鼠，清 潔級，體重質(zhì)量（180±20)g，長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物使用許可證號： SCXK(湘）2014-0011，合格證號：43006700005574。根據(jù)實驗性質(zhì)和性別分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán) 境1周，自由飲水進(jìn)食。
[0028] 1. 3儀器AE100型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；T520電子天 平（湖南長沙湘儀）；722N型可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器公司）；800C型臺式低 速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；C-YLS-Q4型耳片打孔器（北京哲成科技有限公 司）；大鼠足容積測定裝置（自制）。
[0029] 2 方法
[0030]2. 1供試樣品的制備取干燥眼樹蓮5kg，粉碎后過40目篩，以30倍量水浸泡過 夜，然后以超聲波提取2h，超聲頻率為40~50KHz，溫度70-80°C，在超聲波提取1. 5小時 后，同時開啟水煎煮，共煎煮30min，重復(fù)上述浸泡、超聲、煎煮3次，冷卻，過濾，合并濾液， 減壓濃縮至浸膏狀，即得水提取物229. 5g，回收率為4. 59%。取適量水提取物加5倍水懸 浮得懸浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚與懸浮液的 體積比分別是1:5,萃取時間分別為5~lOmin，減壓濃縮，得乙酸乙酯萃取物（水）、正丁醇 萃取物（水）、石油醚萃取物（水），分別加1 %的羧甲基纖維素水溶液配制成所需濃度，分 別作為供試樣品；另外將經(jīng)各種溶劑萃取后剩余水溶液濃縮，作為水液組。
[0031] 2. 2對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響取昆明種小鼠120只，雄性，隨機(jī)分為12組： 即空白對照組（1%的羧甲基纖維素水溶液）；阿司匹林組；眼樹蓮正丁醇萃取物（水）高 (H)、中（M)、低（L)劑量組；乙酸乙酯萃取物（水）高⑶、中（M)、低（L)劑量組；石油醚萃 取物（水）高⑶、中（M)、低（L)劑量組；水液組；每組10只，稱重，標(biāo)記。灌胃給藥，各組 小鼠灌胃1次/d，連續(xù)5d，給藥體積0.lmL/10g，末次給藥后lh，將小鼠右耳雙面均勻涂抹 二甲苯2yL/只，左耳不涂作為對照，lh后脫頸處死小鼠，用9_打孔器分別在雙耳相同位 置打下耳片，置于電子天平上稱取耳片重量，以左右耳片重量差值表示腫脹度，采用q檢驗 比較各組間耳腫脹度，并計算腫脹抑制率。
[0032] 腫脹抑制率（％ ) = [(空白對照組平均耳腫脹度一給藥組平均耳腫脹度）/空白 組平均耳腫脹度]X100(% )
[0033] 結(jié)合多次二甲苯致炎預(yù)實驗結(jié)果，確定各個不同提取部位的高、中、低劑量分別 48、24、12mg?KgS阿司匹林給藥組給藥劑量500mg?KgS空白對照組為1%羧甲基纖維素 水溶液；各實驗組給藥量均為〇.lmL/10g。實驗結(jié)果（見表1)表明，與空白對照組比較，對 二甲苯所致小鼠耳廓急性炎性腫脹，正丁醇萃取物（水）高、中劑量組和乙酸乙酯萃取物 (水）高、中劑量組均有明顯抑制作用，且與空白對照組比較差異性極其顯著（P< 0.01); 這兩種萃取物高、中劑量抑制作用與阿司匹林組相比無顯著差異（P>〇. 05)，表明這兩種萃 取物能對小鼠二甲苯致炎腫脹起一定抑制作用，且這兩種萃取物間，有一定的量效關(guān)系。石 油醚萃取物（水）