依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]1.Fe2+供體和Fe 2+依賴性藥物(青蒿素類)共轉(zhuǎn)運(yùn)可顯著增強(qiáng)治療作用青蒿素(artemisinin，ART)是從中藥黃花蒿中分離得到的倍半萜內(nèi)酯化合物，隨后又合成了一系列衍生物(雙氫青蒿素，青蒿琥酯等)，被廣泛用于瘧疾的治療。已有實(shí)驗(yàn)證明，青蒿素類藥物(為了方便，以下文中以青蒿素(ART)代表)除具有上述治療作用外，還對腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷作用。
[0003]腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Fe2+能和青蒿素類分子內(nèi)特有的過氧橋結(jié)構(gòu)(-0-0-)反應(yīng)，產(chǎn)生以碳原子為核心的自由基或親電子化合物。此類產(chǎn)物為強(qiáng)烷化劑，通過攻擊細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)或直接氧化蛋白質(zhì)分子，以及破壞DNA結(jié)構(gòu)而誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，為一類Fe2+依賴性抗腫瘤藥物。因此，F(xiàn)e2+是青蒿素類藥物發(fā)揮其腫瘤細(xì)胞殺傷作用的必要條件。
[0004]那么如何使該類藥物最大程度的發(fā)揮抗腫瘤作用呢？設(shè)計(jì)Fe2+和該類藥物的共轉(zhuǎn)運(yùn)體系將會有效解決該問題。
[0005]有文獻(xiàn)報(bào)道使用轉(zhuǎn)鐵蛋白(體內(nèi)唯一能夠轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的內(nèi)源性蛋白)介導(dǎo)青蒿素類藥物傳遞，從而實(shí)現(xiàn)Fe2+和該類藥物的共轉(zhuǎn)運(yùn)，對人肝癌0fepG2)及肺癌(A549)細(xì)胞株均有良好的抗腫瘤效果。但是，該遞藥體系存在Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)量有限、載藥量偏低、機(jī)制單一等缺點(diǎn)。
[0006]2.中空介孔四氧化三鐵(Hollow 1NPs)的特點(diǎn)
Hollow 1NPs內(nèi)部具有較大的中空結(jié)構(gòu)，其中空和孔道結(jié)構(gòu)均可荷載藥物，具有很高的藥物荷載能力。而且具有pH響應(yīng)型釋藥功能。在人體中性環(huán)境下，Hollow 1NPs能夠保持結(jié)構(gòu)的完整性，而在腫瘤部位偏酸性環(huán)境下，Hollow 1NPs結(jié)構(gòu)會逐步消蝕，荷載的藥物隨之釋放進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶部位定點(diǎn)釋藥的目的，減少藥物的毒副作用。同時(shí)由于空心球殼層的保護(hù)作用，藥物在輸送過程中可避免與血漿蛋白或其他生物分子相互作用，因此，可保護(hù)藥物避免被酶解。
[0007]另外，Hollow 1NPs在交變磁場照射下可以產(chǎn)生熱和活性氧。與傳統(tǒng)熱療方式(射頻、超聲、微波等)相比，交變磁場介導(dǎo)的熱療可以在更低的培養(yǎng)溫度及更短時(shí)間內(nèi)顯著增加細(xì)胞膜及血腦屏障的穿透性，為腫瘤治療提供了一個(gè)安全有效的治療方式。利用Hollow1NPs在交變磁場照射下產(chǎn)生活性氧的性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)磁動(dòng)力學(xué)治療-化療協(xié)同治療目的。
[0008]3.透明質(zhì)酸(HA)修飾納米載體的優(yōu)勢
HA因其親水性、良好的生物相容性、生物可降解性、非免疫原性、腫瘤靶向性(受體為CD44)等優(yōu)勢已作為藥物載體或靶向分子應(yīng)用于藥物新型給藥系統(tǒng)中，并已成為近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于靶向分子成像、靶向藥物以及基因治療等方面。HA修飾的納米粒不僅可以增加其親水性和穩(wěn)定性，延長血液循環(huán)時(shí)間，還能提高納米粒的腫瘤靶向性。
[0009]另外，由于腫瘤處與正常組織處的pH差異，使pH響應(yīng)性藥物控釋載體在治療腫瘤方面有著很大優(yōu)勢。利用pH響應(yīng)性化學(xué)鍵修飾納米載體，是構(gòu)建pH響應(yīng)性載藥體系的重要途徑。而腙鍵具有顯著的pH敏感性，在偏酸性生理環(huán)境下(如腫瘤，pH < 7)會很快水解，而在中性生理環(huán)境中則穩(wěn)定存在(如血液，PH 7.4)。因此利用腙鍵可實(shí)現(xiàn)客體分子在腫瘤部位的定點(diǎn)釋放，具有廣闊的應(yīng)用前景，但至今未見有利用Hollow 1NPs對交變磁場的敏感性，可以通過交變磁場遠(yuǎn)程調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的定位多機(jī)制治療藥物的公開報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系及其制備方法與應(yīng)用，可有效解決介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系的制備，實(shí)現(xiàn)在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用問題。
[0011]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該體系是，透明質(zhì)酸通過腙鍵與中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs)化學(xué)連接，在水介質(zhì)中形成納米層，F(xiàn)e2+依賴性抗腫瘤藥物進(jìn)入中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs)的介孔內(nèi)，構(gòu)成介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系；所述介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系的粒徑為20-500nm ;所述和透明質(zhì)酸為分子量為600 -400000道爾頓。包括以下步驟:
(I)合成中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs):室溫下，將0.16-0.80g的十二烷基苯磺酸鈉加入到15-75ml的乙二醇中，攪拌，成澄清透明溶液，然后將0.54-2.5g的氯化鐵和0.93-4.5g的乙酸鈉加入澄清透明溶液中，攪拌均勻，放入高壓反應(yīng)釜，密封，在150-200°C下反應(yīng)8-20小時(shí)，析出黑色產(chǎn)物，用磁鐵吸取黑色產(chǎn)物，棄去液體，黑色產(chǎn)物依次用蒸餾水和無水乙醇洗滌至中性，將洗滌后的產(chǎn)物放在60°C的真空干燥箱中干燥12-24小時(shí)，成中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs)；
(2)中空介孔磁性納米粒(Hollow1NPs)與對羧基苯肼的合成反應(yīng):將0.2-0.8g的中空介孔磁性納米粒溶解在pH 7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性納米粒溶液，加入0.40-1.60g巰基乙胺(CYS)，攪拌24h，透析，凍干，得Hollow 1NPs-CYS (巰基乙胺修飾的載體);分別稱取Hollow 1NPs-CYS 50-80 mg和HBA (對羧基苯肼)50-80 mg加入到50-100 ml pH 7.4的PBS溶液中，超聲溶解，分別加入EDC (1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)80-120 mg和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)35-60 mg，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)避光反應(yīng)24-48小時(shí)，再用無水乙醇200-300ml沉淀，過濾，用無水乙醇洗滌除去EDC、NHS和多余的HBA，60°C真空干燥24h，得到Hollow 1NPs-HBA，4°C保存；
(3)HA (透明質(zhì)酸)與Hollow 1NPs-HBA的反應(yīng):分別稱取50-80 mg Hollow1NPs-HBA和80-100 mg HA加入到50-60 ml DMSO中，超聲溶解，室溫下避光攪拌24-48h，透析48-72h，每隔8h換液，除去DMSO和多余的HA，冷凍干燥得HA-Hollow 10NPs，4°C保存；
(4)HA-Ho11ow 1NPs 負(fù)載 Fe2+依賴性藥物的制備:稱取 5-20mg HA-HoI low 1NPs 載體，加入到2.5-40ml超純水中，超聲溶解，與乙醇或水溶解的Fe2+依賴性藥物混合，經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)處理，室溫?cái)嚢?，采用透析、超濾或柱分離除去有機(jī)溶劑及游離藥物，凍干，得介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系；
所述的Fe2+依賴性藥物是含有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，優(yōu)選自青蒿素類藥物，包括青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和二氫青蒿素。
[0012]本發(fā)明涉及一種具有介孔門控功能的Fe2+供體與Fe2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系。其方法為通過水熱合成法制備多功能中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs),以該材料為基體(比表面積大，容量大，密度小，F(xiàn)e2+供體)，F(xiàn)e2+依賴性藥物(以青蒿素代表:ART)為藥物模型，通過腙鍵連接透明質(zhì)酸(HA)分子，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性和藥物釋放的門控作用。該體系在交變磁場照射下產(chǎn)熱和活性氧(R0S)，并實(shí)現(xiàn)Fe2+供體與Fe 2+依賴性藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物定位釋放、同一位點(diǎn)多機(jī)制治療腫瘤(熱、活性氧和化學(xué)藥物)，達(dá)到遠(yuǎn)程定位調(diào)控腫瘤多機(jī)制治療的目的，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0014]實(shí)施例1
本發(fā)明在具體實(shí)施中，介孔門控型的Fe2+供體與Fe 2+依賴性抗腫瘤藥物共轉(zhuǎn)運(yùn)體系由以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)合成中空介孔磁性納米粒(Hollow1NPs):室溫下，將0.3_0.6g的十二燒基苯磺酸鈉加入到30-50ml的乙二醇中，攪拌，成澄清透明溶液，然后將l_2g的氯化鐵和2_3.5g的乙酸鈉加入澄清透明溶液中，攪拌均勻，放入高壓反應(yīng)釜，密封，在160-180°C下反應(yīng)10-15小時(shí)，析出黑色產(chǎn)物，用磁鐵吸取黑色產(chǎn)物，棄去液體，黑色產(chǎn)物依次用蒸餾水和無水乙醇洗滌至中性，將洗滌后的產(chǎn)物放在60°C的真空干燥箱中干燥15-20小時(shí)，成中空介孔磁性納米粒(Hollow 1NPs)；
(2)中空介孔磁性納米粒(Hollow1NPs)與對羧基苯肼的合成反應(yīng):將0.4-0.