一種椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]椎間盤(pán)退變性疾病是當(dāng)今社會(huì)中的一種常見(jiàn)疾病。在美國(guó)，僅次于上呼吸道感染而居第二位，是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要原因之一；亞洲國(guó)家如中國(guó)因?yàn)轶w力勞動(dòng)者較多，發(fā)病率更高。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的發(fā)展，椎間盤(pán)退變性疾病越來(lái)越成為嚴(yán)重影響人們工作生活的疾病。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為椎間盤(pán)疾病的治療提供了新的思路和方法，有望為椎間盤(pán)修復(fù)或置換提供永久替代產(chǎn)品。其中，纖維環(huán)的再生修復(fù)是椎間盤(pán)組織工程首先要解決的問(wèn)題，只有纖維環(huán)得到修復(fù)才能讓髓核組織保持在椎間隙，進(jìn)而對(duì)退變髓核實(shí)施下一步治療。
[0003]近年來(lái)，用于構(gòu)建纖維環(huán)組織工程支架的材料和方法研究較多。如靜電紡絲納米支架，雖然孔隙率高，但其力學(xué)性能是各向同性的，與天然纖維環(huán)不符，且其生產(chǎn)效率太低；取向性藻酸鹽/殼聚糖復(fù)合支架，其力學(xué)性能與天然纖維環(huán)相差甚遠(yuǎn)；聚己酸內(nèi)酯蘋(píng)果酸三醇/脫鈣骨基質(zhì)明膠雙相纖維環(huán)支架，雙相支架的內(nèi)外層結(jié)合不牢、容易脫落，且生物相容性差；國(guó)內(nèi)徐寶山等用豬的纖維環(huán)脫細(xì)胞基質(zhì)作為纖維環(huán)支架，存在的問(wèn)題在于支架形狀、大小、降解速率無(wú)法隨意控制。因此，尋找新的纖維環(huán)組織工程支架材料和制備方法是椎間盤(pán)再生修復(fù)領(lǐng)域亟需解決的問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明所采用的材料配方為魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石，均無(wú)毒性且具有良好的生物相容性。魔芋葡甘聚糖力學(xué)性能好，降解速率偏慢；明膠力學(xué)性能差，降解速率偏快；通過(guò)改變二者的配比，可以按需控制支架的降解速率。納米羥基磷灰石在支架中起到增強(qiáng)相的作用。本發(fā)明采用濕法紡絲法制備的纖維環(huán)支架，形狀、尺寸可調(diào)，并且具有各向異性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和力學(xué)性能，能夠滿(mǎn)足纖維環(huán)抗一定張力的要求，在結(jié)構(gòu)上具有高仿真性。本發(fā)明制備的纖維環(huán)由細(xì)絲按照一定取向堆積而成，孔隙率高，能夠滿(mǎn)足組織工程支架材料對(duì)孔徑和孔隙率的要求。該支架在椎間盤(pán)再生修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有纖維環(huán)支架結(jié)構(gòu)仿真度不高、降解速率不可控、力學(xué)性能不具備各向異性等問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)紡絲原液的配制:將魔芋葡甘聚糖、明膠、納米羥基磷灰石溶于蒸餾水中制備得到紡絲原液，紡絲原液中魔芋葡甘聚糖濃度為10~30g/L，明膠濃度為0~30g/L，納米羥基磷灰石濃度為0~20g/L ；
(2)濕法紡絲:將紡絲原液倒入噴絲設(shè)備中，噴絲設(shè)備的噴頭放入固化液中，噴絲設(shè)備在噴絲過(guò)程中按設(shè)定的軌跡運(yùn)動(dòng)，噴出的紡絲原液在固化液中固化為絲狀，隨著絲狀纖維的堆積，需及時(shí)更換新的固化液，以確保原液及時(shí)固化；
(3)纖維環(huán)的交聯(lián):待原液完全擠出，取出凝固的初生纖維環(huán)，浸沒(méi)于交聯(lián)液中10~12小時(shí)，取出后再將其放入堿液中，70~90°C水浴加熱8~12小時(shí)；水浴加熱結(jié)束，將纖維環(huán)取出冷卻至室溫，并用蒸餾水浸泡充分除堿；
(4)冷凍干燥:將除堿后的纖維環(huán)樣品取出，在-18~-40°C的條件下冷凍24小時(shí)以上，然后對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥直至樣品水分完全揮發(fā)，得到干燥的椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架。
[0007]本發(fā)明所述固化劑為乙醇或者乙醇和丙三醇的混合溶液，其中，混合溶液中丙三醇的體積分?jǐn)?shù)小于等于10%。
[0008]本發(fā)明所述交聯(lián)液為乙醇與氨水的混合液，其中，乙醇與氨水的體積比為
2:1?3:1 ο
[0009]本發(fā)明所述堿液為市售氨水。
[0010]本發(fā)明所述紡絲原液的配制，具體包括以下步驟:將明膠加入蒸餾水中靜置2~12h，然后水浴加熱至40~60°C，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解；然后加入納米羥基磷灰石粉體，繼續(xù)攪拌直至羥基磷灰石粉體在溶液中形成均勻懸浮狀態(tài)，加入魔芋葡甘聚糖粉末攪拌至魔芋葡甘聚糖粉末與懸浮液充分混合，密封后置于700W功率的微波爐中加熱20~30s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到紡絲原液。
[0011]噴絲設(shè)備在噴絲過(guò)程中按設(shè)定的軌跡運(yùn)動(dòng)，噴絲設(shè)備的運(yùn)動(dòng)由數(shù)控設(shè)備精確控制，常規(guī)的數(shù)控設(shè)備只要能實(shí)現(xiàn)控制噴絲設(shè)備按設(shè)定的軌跡運(yùn)動(dòng)均可以用于本發(fā)明，例如激光切割機(jī)。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明所述噴絲設(shè)備的噴頭的直徑為0.5~lmm。
[0013]本發(fā)明所述魔芋葡甘聚糖和明膠均屬于天然高分子材料，無(wú)細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，且來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。魔芋葡甘聚糖力學(xué)性能好，降解速率偏慢；明膠力學(xué)性能差，降解速率偏快；通過(guò)改變二者的配比，可以按需控制支架的降解速率；適量添加的納米羥基磷灰石在支架中起到增強(qiáng)相的作用；采用濕法紡絲法將魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石材料制備成絲狀，并且利用數(shù)控設(shè)備的精確運(yùn)動(dòng)，將細(xì)絲堆積成任意設(shè)計(jì)的形狀。由于絲與絲之間的結(jié)合力不強(qiáng)，初生纖維環(huán)還需要后期的交聯(lián)。魔芋葡甘聚糖在堿性溶液環(huán)境中可以發(fā)生脫乙?；饔?，從而產(chǎn)生交聯(lián)，并且這種交聯(lián)是熱不可逆的，非常穩(wěn)定。利用魔芋葡甘聚糖的這一特性，后期采用堿液浸泡加熱進(jìn)行交聯(lián)，提高了纖維環(huán)的強(qiáng)度。
[0014]本發(fā)明所述紡絲原液經(jīng)固化劑固化成絲狀，形成初生纖維環(huán)支架。之后，還需在交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)，以提高纖維環(huán)的強(qiáng)度；由于原材料中含有魔芋葡甘聚糖成分，因此利用魔芋葡甘聚糖在堿性環(huán)境中可發(fā)生脫乙?；磻?yīng)并產(chǎn)生交聯(lián)這一特性，對(duì)初生纖維環(huán)支架進(jìn)行交聯(lián)；如果直接將初生纖維環(huán)支架放入堿液中進(jìn)行交聯(lián)則會(huì)出現(xiàn)纖維環(huán)溶脹并溶解的現(xiàn)象，會(huì)破壞纖維環(huán)支架的結(jié)構(gòu)。因此，交聯(lián)過(guò)程應(yīng)分為兩個(gè)步驟，先是初步交聯(lián)，然后是后期交聯(lián)。初步交聯(lián)的交聯(lián)劑配方是乙醇與氨水的混合液，其中，乙醇與氨水的體積比是2:1-3:1 ;后期交聯(lián)的交聯(lián)劑為氨水。
[0015]本發(fā)明的有益效果: (I)本發(fā)明所用原料魔芋葡甘聚糖、明膠和納米羥基磷灰石均無(wú)細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，并且通過(guò)改變魔芋葡甘聚糖和明膠的配比，使支架的降解速率可調(diào)。
[0016](2)本發(fā)明所述方法制備得到的椎間盤(pán)纖維環(huán)支架細(xì)絲的直徑可調(diào)，通過(guò)改變紡絲原液擠出設(shè)備噴絲孔的直徑即可實(shí)現(xiàn)。
[0017](3)本發(fā)明使用數(shù)控設(shè)備精確控制絲的堆積，堆積方式可通過(guò)數(shù)控編程控制噴絲孔的走向精確實(shí)現(xiàn)，因此，該方法可制備任意形狀、尺寸的纖維環(huán)支架，以適應(yīng)不同人群不同部位椎間盤(pán)纖維環(huán)的再生修復(fù)。
[0018](4)本發(fā)明制備的纖維環(huán)支架是對(duì)天然椎間盤(pán)纖維環(huán)的高度仿真，具有各向異性的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征，能夠承受一定的壓力和張力；另外，纖維環(huán)由細(xì)絲堆積而成，因而具備較高的孔隙率，有利于細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為該椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架的制備工藝流程圖；
圖2為實(shí)施例3得到的纖維環(huán)支架的紅外光譜圖；
圖3為實(shí)施例3得到的纖維環(huán)支架的粉末X射線衍射圖；
圖4為實(shí)施例4得到的纖維環(huán)支架的掃描電子顯微鏡照片；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例1~6所用裝置。
[0020]圖中:1_固化裝置；2_固化劑；3_初生纖維環(huán)支架；4-噴頭；5_紡絲原液；6-噴絲裝置；7_數(shù)控設(shè)備；8_軟管；9_空氣栗。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于所述內(nèi)容。
[0022]本發(fā)明實(shí)施例1~6所用裝置如圖5所示，包括固化裝置1、噴頭4、紡絲原液5、噴絲裝置6、激光切割機(jī)7、軟管8、空氣栗9，空氣栗9通過(guò)軟管8與噴絲裝置6連接，噴絲裝置6下面設(shè)有噴頭4 ;噴絲裝置6固定在激光切割機(jī)7設(shè)備上，噴絲裝置6的下方設(shè)有固化裝置1，固化裝置I內(nèi)裝有固化劑。
[0023]使用時(shí)，空氣栗9推動(dòng)噴絲裝置6將紡絲原液擠出成液態(tài)細(xì)流，隨后在固化裝置的固化液中固化成絲狀；激光切割機(jī)7控制噴絲裝置6運(yùn)動(dòng)將擠出的絲按需排列成設(shè)計(jì)好的形狀。
[0024]實(shí)施例1
(1)紡絲原液的配制:將魔芋葡甘聚糖加入蒸餾水中在轉(zhuǎn)速為1400r/min的條件下攪拌15min，然后密封置于700W的微波爐中加熱22s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到紡絲原液，紡絲原液中魔芋葡甘聚糖濃度20g/L ；
(2)濕法紡絲:將紡絲原液倒入噴絲設(shè)備(60mL醫(yī)用注射器)中，噴絲設(shè)備的噴頭放入固化液中，噴絲設(shè)備在噴絲過(guò)程中按設(shè)定的軌跡運(yùn)動(dòng)，噴出的紡絲原液在固化液中固化為絲狀，隨著絲狀纖維的堆積，需及時(shí)更換新的固化液(所述固化液為乙醇和丙三醇的混合溶液，其中，混合溶液中丙三醇的體積分?jǐn)?shù)為10%)，以確保原液及時(shí)固化；
(3)纖維環(huán)的交聯(lián):待原液完全擠出，取出凝固的初生纖維環(huán)，浸沒(méi)于交聯(lián)液(所述交聯(lián)液為乙醇與氨水的混合液，其中，乙醇與氨水的體積比為2:1)中10小時(shí)，取出后再將其放入堿液(氨水)中，75°C水浴加熱9小時(shí)；水浴加熱結(jié)束，將纖維環(huán)取出燒杯冷卻至室溫，并用蒸餾水浸泡充分除堿；
(4)冷凍干燥:將除堿后的纖維環(huán)樣品取出，在_22°C的條件下冷凍24小時(shí)以上，然后對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥直至樣品水分完全揮發(fā)，得到干燥的椎間盤(pán)纖維環(huán)組織工程支架。
[0025]實(shí)施例2
(1)紡絲原液的配制:將明膠加入蒸餾水中靜置10h，然后水浴加熱至55°C，充分?jǐn)嚢柚撩髂z完全溶解；加入魔芋葡甘聚糖粉末攪拌，攪拌速度為1300r/min，時(shí)間為lOmin，至魔芋葡甘聚糖粉末與明膠溶液充分混合，密封后置于700W功率的微波爐中加熱24s，加熱完成后取出冷卻至室溫得到紡絲原液；紡絲原液中魔芋葡甘聚糖濃度為30g/L，明膠濃度為25g/L ;
(2)濕法紡絲:將紡絲原液倒入噴絲設(shè)備(60mL醫(yī)用注射器)中，噴絲設(shè)備的噴頭放入固化液中，噴絲設(shè)備在噴絲過(guò)程中按設(shè)定的軌跡運(yùn)動(dòng)，噴出的紡絲原液在固化液中固化為絲狀，隨著絲狀纖維的堆積，需及時(shí)更換新的固化液(所述固化液為乙醇)，以確保原液及時(shí)固化；
(3)纖維環(huán)的交聯(lián):待原液完全擠出，取出凝固的初生纖維環(huán)，浸沒(méi)于交聯(lián)液(所述交聯(lián)液為乙醇與氨水的混合液，其中，乙醇與氨水的體積比為2.5:1)中11小時(shí)，取出后再將其放入堿液(氨水)中，82°C水浴加熱10小時(shí)；水浴加熱結(jié)束，將纖維環(huán)取出燒杯冷卻至室溫，并用蒸餾水浸泡充分除堿；
(4)冷凍干燥:將除堿后的纖維環(huán)樣品取出，在_28°C的條件下冷凍24小時(shí)以上，然后對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥直至樣品水分完全揮發(fā)，得到干燥