一種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，尤其涉及一種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氣管的惡性腫瘤、良性占位性病變或者氣管狹窄、外傷，行長(zhǎng)段氣管切除(成人大于全長(zhǎng)的50%，兒童大于30% )后，切緣不能直接進(jìn)行吻合，需要?dú)夤芴娲锏闹踩?，才可進(jìn)行吻合，恢復(fù)氣管的呼吸通氣功能。而據(jù)Neville等提出理想的氣管替代材料需要具備以下幾種特質(zhì):(1)封密的管腔結(jié)構(gòu)；(2)質(zhì)地柔韌；(3)良好的生物相容性；(4)低炎性反應(yīng)；(5)低免疫性；(6)有助于生長(zhǎng)氣管上皮細(xì)胞的管內(nèi)壁。隨著科研人員在氣管重建上的研究的深入，氣管重建替代物的選擇越來(lái)越多，逐漸成熟。因此同種異體氣管移植和組織工程氣管一直以來(lái)是氣管外科的研究熱點(diǎn)。
[0003]同種異體氣管移植包含了氣管粘膜上皮和氣管軟骨的移植。研究表明，氣管粘膜上皮細(xì)胞具有較高M(jìn)HCI和MHCII抗原，氣管粘膜細(xì)胞外基質(zhì)的完整可以促進(jìn)移植段氣管的再血管化和再細(xì)胞化，所以在去除氣管上皮細(xì)胞抗原性的同時(shí)，最大限度的保留細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，有望在降低氣管免疫原性的同時(shí)，增加氣管移植的成功概率。同種異體原位氣管移植所面臨的最大難題之一是免疫排斥所致的移植物失功，其中上皮細(xì)胞是免疫攻擊的靶目標(biāo)和重要環(huán)節(jié)。提高受體上皮的覆蓋率和實(shí)現(xiàn)再上皮化作為減低上皮組織誘發(fā)的免疫排斥反應(yīng)的技術(shù)手段，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外應(yīng)用鼠氣管原位和異位移植模型的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，一旦異體移植氣管能夠完成再上皮化，具有受體表型的上皮組織，該段氣管組織便將能夠維持管腔的持久通暢，受體便能得到長(zhǎng)久存活。
[0004]理想的氣管支架應(yīng)該最大限度地降低移植氣管的免疫原性，并且盡可能的保留細(xì)胞外基質(zhì)。組織工程氣管正好滿足了這些基本條件，并可以不受供體缺乏的影響，是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，可能是解決長(zhǎng)段氣管損傷后氣管外科重建的有效方法。組織工程是在體外構(gòu)建具有生命力的活體植入體內(nèi)。從而達(dá)到修復(fù)缺損、重建功能、提高生活質(zhì)量之目的。Vacanti等應(yīng)用生物相容性好并有生物降解性能的聚合物作為支架材料，結(jié)合細(xì)胞分離和組織培養(yǎng)技術(shù)成功地在裸鼠皮下再中了新的透明軟骨。在此基礎(chǔ)上，Vacanti等將從新生牛肩關(guān)節(jié)分離出來(lái)的軟骨細(xì)胞種植于2.5cmX 40cm大小的Polyglylactic acid (PGA)無(wú)紡支架網(wǎng)上，包裹在硅膠管周?chē)踩肼闶篌w內(nèi)，4周后大體和組織學(xué)觀察有新生軟骨形成。
[0005]然而，現(xiàn)有的靜電紡織技術(shù)和同軸收集方法中仍存在有待改進(jìn)提高的空間。比如:如何加快制作周期，現(xiàn)在完整制作一段組織工程氣管需要I?2周左右的時(shí)間，隨著管徑的增大，這種制作周期還將進(jìn)一步加大。制作產(chǎn)品容易受到環(huán)境、人為因素的影響，不同批次的產(chǎn)品存在一定的技術(shù)差異。這些問(wèn)題都將是下一階段工作的重點(diǎn)。
[0006]最近的十年，增材制造技術(shù)，也就是人們熟悉的“三維打印技術(shù)”的快速發(fā)展，為生物醫(yī)學(xué)界帶來(lái)新的啟迪。它是一種個(gè)性化制備復(fù)雜支架和組織工程植入物的多功能快速成型技術(shù)。而生物打印在傳統(tǒng)三維打印的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)于細(xì)胞空間分布的精確定位?？墒牵捎谀壳霸O(shè)備發(fā)展的限制以及氣管結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，目前尚無(wú)成熟實(shí)用的氣管生物打印方案存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出了一種空間分布合理、支架材料配方優(yōu)化、內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)完善的適用于臨床的安全可靠的生物性復(fù)合人工氣管。
[0008]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為:
[0009]—種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法，包括以下步驟:
[0010]步驟一，利用支氣管鏡，無(wú)菌刷取支氣管上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；提取耳廓軟骨細(xì)胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0011]步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過(guò)濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中；
[0012]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細(xì)胞的軟材料混合物；
[0013]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物；
[0014]步驟五，分別將所述步驟一中擴(kuò)增培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料；
[0015]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料分別置于兩只低溫墨倉(cāng)內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機(jī)上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉(cāng)內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機(jī)針頭，加載于3D打印機(jī)上備用；
[0016]步驟七，使用建模軟件構(gòu)建三維立體圓筒狀結(jié)構(gòu):首先構(gòu)建一圈輪輻狀結(jié)構(gòu)，作為水平穩(wěn)固支架，指定打印材料為所述硬材料混合物；然后構(gòu)建4個(gè)同心圓結(jié)構(gòu)，重疊于所述輪輻狀結(jié)構(gòu)之上，四圓由內(nèi)向外依次指定材料為:硬材料混合物、支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料、軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料和硬材料混合物；將全部模型結(jié)構(gòu)復(fù)制并累加，得到完整人工氣管模型；
[0017]步驟八，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機(jī)并進(jìn)行3D打印，得到生物性復(fù)合人工氣管。
[0018]為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括:
[0019]上述步驟八具體步驟包括:
[0020]步驟1，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序，分層解析；
[0021]步驟2，將一片無(wú)菌載玻片置于打印機(jī)作業(yè)平臺(tái)上，校準(zhǔn)定位打印機(jī)針頭；
[0022]步驟3，設(shè)置打印機(jī)運(yùn)行參數(shù):硬材料混合物加熱溫度為180_220°C，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.01-0.25毫米，墨倉(cāng)內(nèi)驅(qū)動(dòng)氣壓為0.2-0.4Bar，針頭運(yùn)行速度為5_10毫米/秒?’支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料保持室溫，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.01-0.1毫米，墨倉(cāng)內(nèi)驅(qū)動(dòng)氣壓為0.1-0.3Bar，針頭運(yùn)行速度為10毫米/秒；
[0023]步驟4，啟動(dòng)打印流程，按照設(shè)置的運(yùn)行參數(shù)打??；
[0024]步驟5，全部生物性復(fù)合人工氣管打印完成后，用超聲霧化機(jī)將5-10%三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于生物性復(fù)合人工氣管上，使之充分交聯(lián)；
[0025]步驟6，封閉制作完成的生物性復(fù)合人工氣管兩端，將其浸沒(méi)于培養(yǎng)液中，檢查氣密性并保存。
[0026]上述步驟二為將5-10%膠原和3-7%透明質(zhì)酸按照質(zhì)體積比與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過(guò)濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時(shí)徹底滅菌，以5-10%質(zhì)量體積比分散于滅菌培養(yǎng)液中。
[0027]上述步驟四為將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物。
[0028]上述步驟五為分別將所述步驟一中擴(kuò)增培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)并離心，棄去上清后，按照I X 16個(gè)/毫升的細(xì)胞濃度重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料。
[0029]上述步驟七中構(gòu)建的輪輻高度為I毫米，間距為15°，內(nèi)徑為30毫米，外徑為37毫米。
[0030]上述步驟七中構(gòu)建的4個(gè)同心圓結(jié)構(gòu)高均為I毫米，寬均為0.5毫米；四個(gè)同心圓圓心重合，半徑等差0.5毫米，最小圓直徑與輪福結(jié)構(gòu)內(nèi)徑相同，最大圓直徑與輪福結(jié)構(gòu)外徑相同。
[0031]本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述方法所制備的生物性復(fù)合人工氣管。
[0032]本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述方法所制備的生物性復(fù)合人工氣管的相關(guān)應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:
[0034]本發(fā)明采用生物相容性好的生物材料配方用于打印人工氣管，并能直接在臨床應(yīng)用，避免了對(duì)于供體氣管的依賴；其次，本發(fā)明所用材料具有同時(shí)具備柔韌性和一定機(jī)械強(qiáng)度，滿足氣管作為胸腔內(nèi)空腔臟器的物理機(jī)械性能；再次，本發(fā)明的人工氣管結(jié)構(gòu)多孔疏松，有利于養(yǎng)份的擴(kuò)散和自體血管的長(zhǎng)入；另外，本發(fā)明將由受體自己的氣道上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞擴(kuò)增得到的種子細(xì)胞打印在氣管壁內(nèi)，避免了患者對(duì)于細(xì)胞的排異反應(yīng)；而且，種子細(xì)胞由終末分化的成熟細(xì)胞組成，避免了使用干細(xì)胞所帶來(lái)的誘導(dǎo)分化難題和成瘤風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，本發(fā)明中的細(xì)胞的空間分布在打印中精確可控，按照組織學(xué)規(guī)律分布(上皮朝向管腔，軟骨朝向縱膈)加速了修復(fù)過(guò)程；最后，氣管支架可在體內(nèi)降解，減少了異物殘留體內(nèi)所帶來(lái)的并發(fā)癥，避免了二次手術(shù)取出的風(fēng)險(xiǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為本發(fā)明構(gòu)建的輪輻狀結(jié)構(gòu)的俯視圖；
[0036]圖2為本發(fā)明構(gòu)建的輪輻狀結(jié)構(gòu)的立體圖；
[0037]圖3為一個(gè)輪輻狀結(jié)構(gòu)疊加一個(gè)同心圓結(jié)構(gòu)的示意圖；
[0038]圖4為同心圓結(jié)構(gòu)的材料分層示意圖；
[0039]圖5為打印完畢時(shí)完整的生物性復(fù)合人工氣管的結(jié)構(gòu)示意圖；
【具體實(shí)施方式】
[0040]本發(fā)明提供了一種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法，包括以下步驟:
[0041]步驟一，利用支氣管鏡，無(wú)菌刷取支氣管上皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；提取耳廓軟骨細(xì)胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；
[0042]步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過(guò)濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中；
[0043]步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細(xì)胞的軟材料混合物；
[0044]步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物；
[0045]步驟五，分別將所述步驟一中擴(kuò)增培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細(xì)胞生物復(fù)合材料和軟骨細(xì)胞生物復(fù)合材料；