UK Home Office guide lines)并在批準(zhǔn) 許可下進(jìn)行。雄性斯普拉-道來(lái)（Sprague-Dawley)大鼠（225_250g)每日口服施用（管 飼法（gavage))水、F0S (低聚果糖）（4g/kg)或 G0S (低聚半乳糖[Bimuno]) (4g/kg)5 周 (n = 8/組）。該給藥方案基于先前的研究（Anthony等人；Food Chem Toxicol. ;M(6); 819-26(2006))和示出這些優(yōu)化的益生元?jiǎng)┝刻峁┳畲笪⑸锶荷L(zhǎng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)（未示 出）。最后一次喂填后24小時(shí)處死所有動(dòng)物，收集軀干血（trunk blood)并取出腦。離心 血液以得到血漿，并將額葉皮質(zhì)和海馬從獲得的一半腦中切出。將整個(gè)腦和分離的部分在 干冰上的異戊烷中迅速冷凍并在使用前用血漿儲(chǔ)存在_80°C。
[0052] BDNF 分析
[0053] 來(lái)自所有組的皮質(zhì)和海馬組織在含有蛋白酶抑制劑（' Complete-Mini'，Roche) 的RIPA(放射免疫沉淀測(cè)定）緩沖液（l:10w/v，Sigma Aldrich，UK)中均質(zhì)化。蛋白質(zhì)濃 度使用Bradford試劑（Sigma，UK)測(cè)定。蛋白質(zhì)提取物樣品在用市售BDNF ELISA試劑盒 (BDNF Emax immunoassay system, Promega UK)分析之前，在去離子水中 l:5v/v 稀釋。
[0054] 免疫印跡
[0055] 將來(lái)自益生元組和對(duì)照組的相同濃度的皮質(zhì)、海馬或小腦的蛋白質(zhì)提取物 與上樣緩沖液（50mM 1，4-二硫蘇糖醇和0.025 %溴酚藍(lán)）混合，并與分子量標(biāo)記物 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)通過(guò)電泳在預(yù)制7. 5 % SDS/聚丙稀酰胺凝膠 (Biorad，UK)上分級(jí)，并轉(zhuǎn)?。╰rans-blotted)至聚二氟乙?。≒VDF)膜（Immobilon_P，Mil lipore, Watford, UK)上。
[0056] 將膜用含有0. l%Tween的PBS (磷酸鹽緩沖鹽水）（PBST)中的5% (w/v)脫脂牛奶 封閉 45min，接著在含有針對(duì) NR1 (AB9864, Millipore, UK)、NR2A(AB1555, Millipore, UK)和 NR2B(AB15362,Millipore，UK)三個(gè)NMDAR亞單位之一的一抗（1:1000稀釋）和b-肌動(dòng)蛋白 (Sigma-Aldrich，UK，1:50, 000稀釋）的溫育緩沖液（含2% [w/v]牛奶的PBST)中室溫溫 育lh。接著將膜在PBST洗滌三次10分鐘，并在封閉緩沖液中的HRP (辣根過(guò)氧化物酶）-偶 聯(lián)的二抗中溫育 30min。使用 ECL-Plus 試劑盒（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)、并 將膜置于X-射線膜（Kodak BioMax AR film)上、通過(guò)化學(xué)熒光使免疫反應(yīng)性條帶（bands) 可視化。所有抗體產(chǎn)生期望分子量的單一條帶。使用Alphalmager 3400測(cè)量條帶的光密 度（0D)，并將數(shù)據(jù)表示為磷酸化：總NMDAR亞單位的0D比，或總NMDAR亞單位：b-肌動(dòng)蛋 白的0D比。
[0057] 原位雜交組織化學(xué)（ISHH)
[0058] 將冷凍的大鼠腦半球在低溫槽上冠狀切片（140 ym)，融解放置于 Superfrost-plus玻片（Fisher Scientific)上并儲(chǔ)存在_80°C。將含有額葉皮質(zhì)的切片 如 Burnet 等人（Mol. Cell. Neurosci. ;46 ;167_75 ; (2011))所述預(yù)處理。
[0059] 與 BDNF(堿基 883-927，NM001270630. 1)、NR1(堿基 746-780，NM008169. 1)、 NR2A(堿基 1642-1676，NM008170.2)或 NR2B (堿基 1758-1792，NM010350.2)互補(bǔ) 的商業(yè)合成的（MWG，UK)寡脫氧核糖核苷酸用于現(xiàn)有的ISHH法（Eastwood等人； J. Psychopharmacol. ;11;635-644 ; (2007))。寡脫氧核糖核苷酸探針3' -端用末端過(guò)氧核 苷轉(zhuǎn)移酶（Promega，UK)標(biāo)記[35S]-dATP。將探針在雜交緩沖液中稀釋，用移液器吸取至組 織切片上（1 X 106cpm/切片），蓋上蓋玻片，接著在34°C下在襯有濾紙的加蓋珀斯佩有機(jī)玻 璃（Perspex)托盤上溫育>16小時(shí)，濾紙浸有4XSSC(生理鹽水檸檬酸鈉）/50%甲酰胺。
[0060] 雜交后的洗滌包括：2XSSC室溫沖洗以除去蓋玻片；0. 5XSSC，20min(X3)55°C; 0.5XSSC 30min(X2)室溫。將玻片于ddH20中沖洗、干燥并以14C-微量置于X射線膜 (Kodak, Biomax MS)上7-28天。使用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析測(cè)量各mRNA的橫跨額葉皮質(zhì)灰 質(zhì)的深度的平均灰質(zhì)密度（grey density)，并使用14C-微量標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換為nCi/mg組織。
[0061] HPLC 分析
[0062] 皮層組織小碎片（50mg)單獨(dú)在冰冷的甲醇（1:10w/v)中均質(zhì)化并 以4 °C、13200rpm離心10分鐘。將上清液（10 y I )注入惠普1100液相色譜 儀（Agilent Technologies, Palo Alto, CA)并如之前所述進(jìn)行在線柱前衍生 (pre-column, derivatization) (Grant 等人；J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. ; Mi;278-282(2006))。簡(jiǎn)言之，樣品（10yl)在柱分離之前與等體積衍生 試劑[0. 2ml的甲醇和0. 8ml 0. 4M的硼酸鈉緩沖液（pH = 9)中的鄰苯二甲醛（2mg)和 Boc_L-半脫氨酸（2mg)]反應(yīng)5min。使用保持在 30°C的 Agilent Zorbax Eclipse )(DB-C18 柱（4. 6 X 150mm, 5 y m)和與 Morikawa 等人（J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. ：757： 119-25(2001))類似的分離方案實(shí)現(xiàn)分離。由乙腈（相A)和lOOmM醋酸鈉緩沖液pH = 6(相B)組成的流動(dòng)相以1.4ml/min栗過(guò)柱。使用下列梯度體系（min/%B) :0/91、35/84、 65/84。衍生的氨基酸通過(guò)焚光檢測(cè)（發(fā)射：443nm;激發(fā)：344nm)檢測(cè)。使用可靠標(biāo)準(zhǔn)品 (authentic standards) (0? 5 至 lOOOpmol)構(gòu)建 D-和 L-氨基酸（Sigma Aldrich, UK)的 8 點(diǎn)校正曲線，在各情況中發(fā)現(xiàn)線性相關(guān)系數(shù)>0. 995。
[0063] 數(shù)據(jù)分析
[0064] 所有數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)平均誤差（SEM)。用單因素方差分析（one-way AN0VA)、接著事后分析（post hoc analysis) (Tukey HSD)來(lái)進(jìn)行各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
[0065] MM.
[0066] 對(duì)照和益生元大鼠糞粒中的雙歧桿菌
[0067] 來(lái)自F0S-飼養(yǎng)大鼠的糞粒中的雙歧桿菌數(shù)（表示為loglO/g)顯著大于對(duì) 照（9. 498+0. 025vs 9. 354+0. 055，p〈0. 05)，而來(lái)自G0S-飼養(yǎng)動(dòng)物的雙歧桿菌的密度顯 著大于對(duì)照（9. 624+0. 05vs 9. 354+0. 055, p〈0. 01)和 F0S-飼養(yǎng)大鼠（9. 624+0. 05vs 9. 498+0. 025, p〈0. 05)二者。
[0068] 益生元對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)和海馬中的BDNF和NR1的作用
[0069] 額葉皮質(zhì)提取物中的BDNF蛋白質(zhì)水平在各組間并無(wú)差異（圖1A)。然而，F(xiàn)0S施用 的大鼠的海馬提取物中的BDNF顯著高于對(duì)照和G0S飼養(yǎng)的動(dòng)物的。免疫印跡揭示了，與對(duì) 照和F0S動(dòng)物相比，G0S-飼養(yǎng)大鼠額葉皮質(zhì)中含有顯著高水平的NR1免疫反應(yīng)性（圖1B)。 然而海馬的分析揭示了，盡管觀察到G0S動(dòng)物相對(duì)于對(duì)照的增加趨勢(shì)（p = 0. 055)，但F0S 大鼠比其它組含有顯著多的NR1亞單位。
[0070] 益生元對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)和海馬中的NR2A和NR2B亞單位的作用
[0071] 在免疫印跡中，來(lái)自G0S-飼養(yǎng)動(dòng)物的海馬（而非皮質(zhì)）的提取物與其它兩組相比 含有顯著高的NR2A免疫反應(yīng)性（圖2)。NR2B在額葉皮質(zhì)和海馬中的水平不受益生元飼養(yǎng) 的影響。
[0072] 益生元對(duì)海馬中的BDNF和NR亞單位的mRNA的作用
[0073] 益生元施用相對(duì)于對(duì)照增加了海馬齒狀回中BDNF(圖3A、C、E和圖4A)和NR1 (圖 3B、D、F)mRNA的豐度。還觀察到G0S-飼養(yǎng)大鼠的CA3分區(qū)中BDNF mRNA的減少（圖3C)。 光密度法證實(shí)了在益生元大鼠的齒狀回中顯著較高的BDNF和NR1表達(dá)（圖4A，B)。G0S施用 導(dǎo)致與對(duì)照和F0S-飼養(yǎng)動(dòng)物相比的齒狀回和CA1分區(qū)中的NR2A (圖4C)(而不是NR2B (圖 4D)) mRNA 升高。
[0074] 益生元后的糞便、血漿和腦氨基酸濃度
[0075] 本研究試驗(yàn)了腸道細(xì)菌的升高是否通過(guò)升高腸道和循環(huán)中的中心D-丙氨酸的量 而增加了該D型氨基酸的濃度。G0S飼養(yǎng)大鼠的糞粒中游離D-丙氨酸的濃度顯著高于對(duì)照 和FOS動(dòng)物，其中FOS施用導(dǎo)致該D型氨基酸的中間水平（表1)。單獨(dú)的益生元或GOS都 提高了包括D-絲氨酸和谷氨酸在內(nèi)的其它氨基酸。在血漿中，與對(duì)照動(dòng)物相比，D-丙氨酸 水平顯著高于G0S-飼養(yǎng)大鼠（表1)，在F0S-飼養(yǎng)大鼠中觀察到微小的、盡管并不顯著的（p = 0.086)增加。益生元施用并不改變其它循環(huán)氨基酸的濃度（表1)。用G0S飼養(yǎng)的大鼠 在額葉皮質(zhì)中與對(duì)照相比具有顯著高的D絲氨酸濃度（表2)，盡管額葉皮質(zhì)和海馬中所有 其它氨基酸的水平在益生元飼養(yǎng)后并未改變。皮質(zhì)D-絲氨酸和NR1蛋白質(zhì)水平之間存在 整體顯著相關(guān)（皮爾森的r = 0. 684,p= 0. 01)。單個(gè)組的分析揭示了該相關(guān)僅在G0S飼 養(yǎng)后顯著（GOS:r= 0? 96,p= 0? 04 ;F0S:r= 0? 68,p= 0? 32 ;水：r= 0? 01，p= 0? 989)。
[0076] 表1重復(fù)口服水或益生元后大鼠糞粒和血漿中的氨基酸濃度。與水相比*p〈0. 05 ; 與FOS相比 +p〈0. 05
[0077]
[0078] 表2重復(fù)口服水或益生元后大鼠皮質(zhì)和海馬中的氨基酸濃度。與水相比*p〈0. 05
[0079]
[0080] 討論
[0081] 我們觀察到1)與G0S飼養(yǎng)大鼠和對(duì)照動(dòng)物相比，F(xiàn)0S飼養(yǎng)大鼠中較大的海馬BDNF 水平，盡管BDNFmRNA在F0S和G0S飼養(yǎng)大鼠的齒狀回中都增加；2)G0S飼養(yǎng)大鼠的額葉皮 質(zhì)中和益生元飼養(yǎng)動(dòng)物的海馬中升高的NR1蛋白質(zhì)；3)與