7/AKAP4/PTTG1的體液應(yīng)答，本發(fā)明人通過間接ELISA比 較了來自NSCLC患者的血清中的循環(huán)CTA-特異性IgG自身抗體的水平與來自受試者的那 些。如果ELISA信號(hào)比健康受試者中發(fā)現(xiàn)的中值信號(hào)高至少3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，則認(rèn)為受試者 是陽性的（20)。與來自RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光的表達(dá)數(shù)據(jù)一致，圖4A-4C顯示大 多數(shù)NSCLC患者顯示CTA特異性循環(huán)自身抗體。
[0062] 由患者的PBMC生成CTA-特異性CTL。
[0063] 本發(fā)明人成功地生成能夠有效殺死來自5名患者的自體腫瘤細(xì)胞的CTL(圖5A-F， 左側(cè)）。對(duì)于該分析，本發(fā)明人選擇顯示在其腫瘤細(xì)胞中在蛋白水平上特異性CTA表達(dá)的 患者。細(xì)胞毒效應(yīng)的特異性由自體腫瘤細(xì)胞和NSCLC來源細(xì)胞系的細(xì)胞溶解的高百分比 (40%至高于80% )來支持，而非腫瘤細(xì)胞（DC，使用不相關(guān)的HPV-E7抗原致敏的DC，和正 常支氣管來源細(xì)胞系CRL-2503)的細(xì)胞溶解〈10% (圖5A-F，右側(cè)）。HLA I類限制通過 針對(duì)單態(tài)HLA I類分子而不是HLA II類分子的抗體的細(xì)胞溶解抑制來顯示（圖5A-F，右 側(cè)）。通過基于ELISA的細(xì)胞因子表達(dá)的測(cè)量顯示了朝向Thl效應(yīng)細(xì)胞表型的T細(xì)胞活化 和極化：在使用CTA-致敏的DC刺激并且與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，IFN- y和TNF- a的水平升 高超過50倍，而IL-4、IL-5和IL-10基本未改變（圖6A-F，左側(cè)）。IFN- y的ELISP0T結(jié) 果進(jìn)一步證實(shí)了在使用與自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的精子蛋白（ropporin)呈遞DC活化的PBMC 中，產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞的升高的高發(fā)生率（圖6A-F，右側(cè)）。
[0064]雖然歷史上認(rèn)為NSCLC由于低頻率的腫瘤浸潤T細(xì)胞而具有弱的免疫原性（21)， 但是使用鼠NSCLC模型的研究已顯示可以利用基于DC的方法活化有效的免疫應(yīng)答（22， 23)。此外，在患有NSCLC的患者中已檢測(cè)到腫瘤抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答（23)，表明確定特異 性NSCLC-相關(guān)抗原并將其以最佳方式呈遞到免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生在該疾病中通常不存在或 無活性的腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞（24)。免疫治療在提高患者生存率和降低與標(biāo)準(zhǔn)治療相關(guān) 的死亡率的潛在作用已通過最近的對(duì)患有NSCLC的患者的12個(gè)臨床疫苗試驗(yàn)的薈萃分析 證實(shí)（25)。當(dāng)研究基于免疫治療的抗癌策略時(shí)，選擇被疫苗靶向的抗原是關(guān)鍵步驟（5)。理 想的靶標(biāo)應(yīng)是在癌癥細(xì)胞而不在正常細(xì)胞中選擇性表達(dá)的高免疫原性蛋白（5,10)。由于其 高腫瘤限制性表達(dá)譜及其免疫原性，CTA特別適用于腫瘤免疫治療的腫瘤相關(guān)抗原（7, 9)。
[0065] 在該研究中，本發(fā)明人示出了三種CTA，即SP17、AKAP4和PTTGl在NSCLC的免疫 治療中的用途。本發(fā)明人首次分析了 3種CTA，即SP17、AKAP4和PTTGl在一組正常組織、 三個(gè)NSCLC細(xì)胞系、一個(gè)正常支氣管細(xì)胞系、來自17名NSCLC患者的原發(fā)腫瘤細(xì)胞和來自8 名健康受試者的支氣管上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)。如預(yù)期的，除了睪丸以外，非腫瘤組織均未 表達(dá)RNA水平的選擇的CTA (7, 10)。NSCLC細(xì)胞系表達(dá)SP17/AKAP4/PTTG1轉(zhuǎn)錄物和蛋白，而 正常支氣管上皮細(xì)胞系僅顯示微弱的SP17RNA表達(dá)。這與我們之前的報(bào)導(dǎo)一致，該報(bào)導(dǎo)顯 示SP17在體細(xì)胞纖毛上皮細(xì)胞中表達(dá)，包括氣道的體細(xì)胞纖毛上皮細(xì)胞（26)。有趣的是， 獨(dú)立的臨床前研究強(qiáng)烈表明SP17-定向的免疫治療未產(chǎn)生任何與纖毛細(xì)胞中SP17-表達(dá)相 關(guān)的毒性（16, 27, 28)。源自患者的所有肺癌組織顯示轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的SP17表達(dá)，而大 多數(shù)樣本也顯示AKAP4和PTTGl表達(dá)。蛋白表達(dá)的結(jié)果獨(dú)立地通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光 證實(shí)，結(jié)果是一致的。來自17名NSCLC受試者中的16名的腫瘤顯示研究的三種CTA中的 至少兩種的表達(dá)，表明其在該疾病中的潛在重要性。對(duì)于充當(dāng)免疫治療的靶標(biāo)的蛋白，其應(yīng) 能夠引發(fā)強(qiáng)烈且可測(cè)量的免疫應(yīng)答，該性質(zhì)稱為免疫原性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NSCLC患 者的血清對(duì)至少兩種CTA-特異性抗體是陽性的，僅有#5患者顯示抗-SP17但無抗-AKAP4 或抗-PTTGlIgG。雖然在腫瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)之間完全一致，但體液抗腫瘤 應(yīng)答以血清中的抗-CTA抗體來測(cè)量，導(dǎo)致更加異質(zhì)。例如，三名NSCLC患者（#2, 13, 14)分 類為抗-SP17陰性，但是其腫瘤表達(dá)SP17。有趣的是，所有AKAP4-或PTTGl-陽性患者在 其血清中也顯示相應(yīng)的特異性自身抗體。Shan Q.等人的最近的研究（29)生成了含有72 種CTA的低密度蛋白微陣列，并使用來自NSCLC患者和健康受試者的血清對(duì)其探測(cè)。這些 研究者報(bào)導(dǎo)了在NSCLC患者的血清中的NYES0-1、XAGE-1、ADAM29和MAGEClAb的檢測(cè)。這 些發(fā)現(xiàn)表明抗-CTA抗體可以開發(fā)為NSCLC的診斷工具。
[0066] 為了測(cè)定SP17/AKAP4/PTTG1免疫原性是否能夠產(chǎn)生CTA/腫瘤特異性CTL應(yīng)答， 發(fā)明人檢查了對(duì)CTA-負(fù)載的樹突細(xì)胞（DC)的T細(xì)胞應(yīng)答。DC的應(yīng)用是廣泛認(rèn)可的用于刺 激腫瘤抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，并且本發(fā)明人之前已經(jīng)在MM、宮頸癌和前列腺癌中 使用該技術(shù)（6, 15, 30, 31)。為了研究由PBMC產(chǎn)生CTA-特異性CTL的可行性，本發(fā)明人選 擇了經(jīng)測(cè)試對(duì)腫瘤細(xì)胞中的SP17、AKAP4或PTTGl蛋白表達(dá)顯陽性的5名患者。如預(yù)期的， 使用CTA-呈遞DC刺激的患者的PBMC顯示顯著的對(duì)自體肺癌細(xì)胞和NSCLC-來源細(xì)胞系的 細(xì)胞溶解活性。觀察到的細(xì)胞毒效應(yīng)限于HLA I類陽性靶標(biāo)，因?yàn)槠浔豢?HLA I類抗體阻 斷而不是被抗-HLA II類抗體阻斷。對(duì)CTL細(xì)胞溶解活性的抗原特異性通過其不能產(chǎn)生針 對(duì)CTA-陰性CRL-2503細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答來證實(shí)或在暴露于非致敏DC或負(fù)載HPV E7抗 原的DC之后證實(shí)。細(xì)胞因子表達(dá)分析顯示我們的基于DC的CTL產(chǎn)生方案在刺激的PBMC 中誘導(dǎo)強(qiáng)的Th-I極化，如升高的IFN- y和TNF- a以及降低的IL-4、IL-5和IL-10水平所 證實(shí)的（6, 16, 19, 31-33)。由于NSCLC患者顯示異常的Th-2-型細(xì)胞因子譜（34)，所述異 常的Th-2-型細(xì)胞因子譜負(fù)面影響對(duì)免疫治療的顯著應(yīng)答（35)，因此可能的是（但不限制 本發(fā)明），CTA-負(fù)載的DC具有刺激T-輔助細(xì)胞Th-I譜的能力（36)。效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的 活化進(jìn)一步通過ELISP0T分析證實(shí)，其顯示在使用CTA-負(fù)載的DC致敏（prime)并暴露于 自體腫瘤細(xì)胞的PBMC中高頻率的IFN- y -表達(dá)細(xì)胞。該發(fā)現(xiàn)是有意義的，因?yàn)镮FN- Y已 顯示在NSCLC生長中發(fā)揮顯著的抑制作用（37)。
[0067] 體外產(chǎn)生活性CTA-特異性免疫應(yīng)答的可行性表明由NSCLC細(xì)胞表達(dá)CTA可以具 有治療意義，并充當(dāng)針對(duì)該疾病設(shè)計(jì)新型免疫治療策略的基礎(chǔ)。此外，在體外改造以有效 將CTA呈遞到效應(yīng)T細(xì)胞的DC可以克服在NSCLC腫瘤微環(huán)境中見到的免疫抑制，實(shí)現(xiàn)針對(duì) 該疾病的有效的疫苗接種策略的開發(fā)（38-40)?？梢葬槍?duì)NSCLC開發(fā)CTA-依賴性免疫治 療以確定是否能夠在體外產(chǎn)生CTA-特異性CTL應(yīng)答并克服在該疾病中觀察到的免疫耐受 (41-44)?？傊?，這些結(jié)果顯示，CTA SP17、AKAP-4和PTTG1，在NSCLC中選擇性表達(dá)，并且其 表達(dá)可以開發(fā)用于產(chǎn)生特異性CTL-介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答。本發(fā)明人之前已確定SP17、AKAP4 和PTTGl在多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌和前列腺癌中的表達(dá)和免疫原性（6, 16, 17, 19, 31，32)， 以及目前在NSCLC中的表達(dá)和免疫原性的這一事實(shí)表明可以使用CTA-驅(qū)動(dòng)的疫苗接種策 略靶向CTA表達(dá)腫瘤。
[0068] 預(yù)期的是在本說明書中討論的任何實(shí)施方案可以以本發(fā)明的任何方法、試劑盒、 試劑或組合物實(shí)施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0069] 要理解的是，本文描述的具體實(shí)施方案通過說明的方式顯示，并不作為對(duì)本發(fā)明 的限制。在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，可以在各種實(shí)施方案中采用本發(fā)明的主要特征。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定本文描述的具體過程的多種等價(jià)方 式。認(rèn)為這樣的等價(jià)方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并涵蓋在權(quán)利要求中。
[0070] 在本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)表示本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域中的技術(shù) 人員的技術(shù)水平。將所有出版物和專利申請(qǐng)引入本文作為參考，其程度如同具體地和單獨(dú) 地表明將每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)引入作為參考。
[0071] 單詞"一個(gè)（a) "或"一個(gè)（an) "當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中與術(shù)語"包括"聯(lián)合 使用時(shí)，可以指"一個(gè)"，但其也與"一個(gè)或多個(gè)"、"至少一個(gè)"和"一個(gè)或多于一個(gè)"的含義一 致。在權(quán)利要求中術(shù)語"或"的使用是指"和/或"，除非明確表明僅指代供選擇的方案，或 供選擇的方案是互相排斥的，但是公開內(nèi)容支持僅指代供選擇的方案和"和/或"的定義。 在本申請(qǐng)中，術(shù)語"約"用來指這樣的值，其包括裝置的誤差、用于測(cè)定值的方法或在研究受 試者中存在的變化的固有改變。
[0072] 如在本說明書和權(quán)利要求（或多個(gè)權(quán)利要求）中所使用的，單詞"包含 (comprising) "（和包含的任何形式，如"包含（comprise) "和"包含（comprises) "）、"具有 (having) "(和具有的任何形式，如"具有（have) "和"具有（has) ")、"包括（including) "（和 包括的任何形式，如"包括（includes)"和"包括（include)"）或"含有（containing)"（和 含有的任何形式，如"含有（contains)"和"含有（contain)"）是包括性的或開放式的，不 排除另外的未列舉的元素或方法步驟。
[0073] 如本文所使用的術(shù)語"或其組合"是指在該術(shù)語前所列項(xiàng)目的所有排列和組合。 例如，"A、B、C或其組合"旨在包括以下中的至少一個(gè)：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果 在具體上下文中的順序是重要的，還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)該實(shí) 例，明確包括的是包含一種或多種項(xiàng)目或條目的重復(fù)的組合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、 CBBAAA、CABABB等。技術(shù)人員將理解通常對(duì)任意組合的項(xiàng)目或條目的數(shù)量沒有限制，除非 從上下文中明顯得出。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明，本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法可以在不進(jìn)行過度實(shí) 驗(yàn)的情況下形成或?qū)嵤?。雖然以優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)于本 領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，變化可以適用于本 文所描述的組合物和/或方法以及方法的步驟或步驟的順序中。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的 是所有這些類似的替代和改變被視為在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思 內(nèi)。
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