新型的穩(wěn)定十五肽鹽，其制備方法，其在制備藥物制劑中的用途以及其治療用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域并涉及新型的穩(wěn)定十五肽的鹽，其在下文也稱為式（I) 的 bepecin 鹽：
[0003]其中n是1、2或3，并且BAA是堿性氨基酸，
[0004] 涉及其制備方法，其在制備藥物制劑中的用途以及其治療用途。
[0005] 技術(shù)問題
[0006] 許多藥理學(xué)研究已證實了具有氨基酸序列Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val (SEQ ID NO I)的十五肽（縮寫為 BPC-157 或 b印ecin)對人和 動物有機(jī)體的保護(hù)、再生和治療活性。到現(xiàn)在為止，這種肽一直以游離形式或以醋酸鹽形式 或作為與堿的鹽例如鈉鹽使用。所有這些形式的特點均為在胃液中仍沒有足夠的穩(wěn)定性， 這特別地限制了這些化合物的口服使用并同時降低了它們的治療價值。因此，有必要以在 胃液中和在升高的環(huán)境溫度下均實質(zhì)性地更加穩(wěn)定的形式制備此十五肽。該制劑的這種形 式可更成功地用于特別是至生物體中的口服遞送。由于更高的穩(wěn)定性，還可預(yù)期總體更好 的效力。 現(xiàn)有技術(shù)
[0007] 十五肽BPC 157或bepecin (身體保護(hù)化合物的縮寫）具有以下肽序列：Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val ;并且其代表實際存在于哺乳動 物的胃液中的天然BPC蛋白質(zhì)的N-末端部分。天然BPC蛋白借助復(fù)雜的生化方法（美國專 利號5, 288, 708)從人或動物的胃液中獲得。且不論高要求的操作，這種方式的獲得在原材 料來源的不確定性和可能污染病毒方面也是不合適的。因此，通過化學(xué)合成（P.Sikirii, R.Rucman,:B.Rucnian,M. Petek, Peptides 1998, Proceed, of 25th EPS, Budapest 1998, p. 814 ；Z. PfIaum and R.RllCllian,Acta Chim. Slov. , 2005, 52, 34 - 39)，僅制備了 具有上述序列的N-末端部分。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)該片段保留了天然BPC蛋白的幾乎所 有效應(yīng)（EP 0572688和美國專利號6, 268, 346)。具有15個氨基酸的序列的N-末端部分似 乎是整個蛋白質(zhì)具有生物活性的最主要原因。從醫(yī)學(xué)角度來看該化合物非常吸引人，因為 其在極低濃度（每公斤體重從ng到mg及更多的范圍）下對幾乎所有的器官具有效應(yīng)并且 沒有任何毒性或副作用。
[0008] 藥理學(xué)研究已顯不被引入生物體中的十五肽bepecin(SEQ ID NO 1)具有以下效 應(yīng)：
[0009] -對胃腸道任何部分的潰瘍的效應(yīng)（P. SikirM等人，Life Sci.，1994 ; M，PL63 - 68) ; (P.Sildrid等人，Exp. Clin. Gastroenterol.，1991，1，17 - 20);
[0010]-不論病因的抗炎癥效應(yīng)（P.Sikirid等人，J. Physiol. / Paris/, 1997, 9i, 113 - 122)；
[0011] -針對胃腸道的炎性疾病-克羅恩氏病的效應(yīng)（Sikirif等人，j. PhysioI? / Paris/, 2001, 95, 295 - 301)；
[0012] -對肝臟和胰臟的保護(hù)效應(yīng)（Prka^iii等人，J. Physiol. / Paris/, 2001, 95, 315 - 324)；
[0013] -促進(jìn)燒傷的愈合（D. Miku§, P.Sikirid等人，Burns 2003,盌，323 - 334 ; Burns, 2001. 127. 817 - 827)；
[0014] -促進(jìn)傷 口愈合（S. Seiwerth, P. Sildrid 等人，J. Physiol. / Paris/, 1997, 9i, 173 - 178)；
[0015] -針對放射性輻射的保護(hù)效應(yīng)（p. Sikirid,m. Petek, R. RuSman, J. Physiol. /Paris/, 1993, 87, 313 - 327)；
[0016] -促進(jìn)骨折的愈合（b. SebefiiA,. v. MikM, p. BiMti 泛等 人，Bone, 1999, M，195 - 202);
[0017]-與腎上腺素能和多巴胺能系統(tǒng)相互作用，在應(yīng)激條件下保護(hù)粘膜（P.Sikirid等人，Dig. Dis. Sci.，1997,堅，661 - 671);
[0018]-在一些腫瘤類型（腹水，黑色素瘤）中的抗腫瘤效應(yīng)（p. SikirM， M. Petek, R.Rucman,J. Phys iol. /Paris/, 1993, 87, 313 - 327 ；S. Radel jak, S. Seiwert, P.Sikiric,Melanoma Research, 2004, H(4), A14 - A15)；
[0019] -對皰疹病毒HSV-I和HSV-2、LCM、CMV、A型流感病毒和蜱傳腦炎病毒的抗病毒效 應(yīng)（P.SiMrMsR. Rufiman，. M. Petek, J. Physiol. /Paris/, 1993, §1，313 - 327);
[0020]-促進(jìn)斷裂的神經(jīng)聯(lián)系的再生（P.Sikirid等人，Dig. Dis.Sci. ,11,1604 - 1614; M. Giura§in 等人，Dig. Dis. Sci.，2003,堅，1879);
[0021] -促進(jìn)斷裂跟腱的愈合（M. StareSinid, p. Sikirid 等人，1〇竹11〇?6(1. Res. , 2003, 21, 976 - 983)；
[0022] -去除與NO形成有關(guān)的器質(zhì)性異常（P. SikirK等人，Eur. J. Pharm. , 1997, 332, 23 - 33) 〇
[0023] 肽b印ecin作為活生物體自身物質(zhì)的組成部分不顯示任何毒性體征。為了測定 LD5。以及獲得關(guān)于急性、亞慢性和慢性毒性的數(shù)據(jù)的目的而在小鼠上進(jìn)行的測試仍未成功， 因為以IOng至100mg/kg體重的廣泛劑量范圍靜脈內(nèi)、口服或腹膜內(nèi)施用的此肽不誘導(dǎo)任 何毒性變化。
[0024] 此外，致畸和遺傳毒性的測試（沙門氏菌微粒體試驗）沒有證實這種作用的體征。
[0025] 合成的十五肽BPC-157的鹽還公開于專利EP 0983300和美國專利號6, 288, 028 中。這些鹽比原始的形式，即比游離酸或乙酸鹽稍好，但它們?nèi)匀狈υ谖敢褐凶銐虻姆€(wěn)定 性。
[0026] 技術(shù)問題的解決方案
[0027] 待解決的基本問題是化合物在升高的溫度下的穩(wěn)定性，特別是在胃液中的穩(wěn)定 性。本發(fā)明涉及具有堿性氨基酸的新型十五肽鹽，其具有顯著改善的熱穩(wěn)定性和在胃液中 的穩(wěn)定性。
[0028]胃液是不同化合物的復(fù)雜混合物且主要成分是：水，氯化鈉，鹽酸，粘蛋白類，酶， 特別是胃蛋白酶，等等。胃液主要是酸性的；其PH值從1至7不等且異常更高。正常pH值 的范圍是從2至5,這也是分解的多肽、肽和蛋白質(zhì)的胃蛋白酶的最大活性范圍。
[0029] 本發(fā)明因此涉及式（I)的新型穩(wěn)定十五肽鹽：
[0031] 其中n是1、2或3,并且BAA是堿性氨基酸.
[0032] 作為堿性氨基酸，可使用L-、D_或DL-形式的堿性精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸或其它， 優(yōu)選為L-精氨酸。
[0033] 本發(fā)明還涉及式（I)的十五肽鹽的制備方法，其中具有序列（SEQ ID NO 1)的 十五肽與堿性氨基酸BAA在水溶液中于室溫下以1至3摩爾堿性氨基酸對1摩爾具有SEQ ID NO 1的十五肽的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)：
[0034]
[0035] 形成的溶液的pH值用滴定法調(diào)節(jié)，隨后通過HPLC色譜和冷凍干燥以固體形式分 離形成的式（I)的鹽。
[0036] 在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，通過Imol堿性氨基酸與Imol十五肽（SEQ ID NO 1)的反應(yīng)獲得的溶液的pH值被調(diào)節(jié)至4. 1至5. 0,優(yōu)選被調(diào)節(jié)至4. 60±0. 05。
[0037] 在本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，通過2mol堿性氨基酸與Imol十五肽 (SEQ ID NO 1)的反應(yīng)獲得的溶液的pH值被調(diào)節(jié)至6. 7至7. 8,優(yōu)選被調(diào)節(jié)至7. 40±0. 05。
[0038] 本發(fā)明還涉及固體和液體形式的藥物制劑，其用于口服、靜脈內(nèi)、直腸、陰道、肌肉 內(nèi)、局部和其它的使用，所述制劑含有治療有效量的本發(fā)明的十五肽鹽。
[0039] 本發(fā)明還涉及除了本發(fā)明的十五肽鹽以外，還含有一種或多種其它活性物質(zhì)，優(yōu) 選為抗生素或抗氧化劑的藥物制劑。
[0040] 本發(fā)明還涉及除了本發(fā)明的十五肽鹽以外，還含有穩(wěn)定性增強(qiáng)添加劑的藥物制 劑，所述添加劑選自包含堿金屬和堿土金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽的組，優(yōu)選為碳酸氫鈉。
[0041] 本發(fā)明還涉及除了本發(fā)明的十五肽鹽以外，還含有穩(wěn)定性增強(qiáng)添加劑的藥物制 劑，所述添加劑選自包含糖諸如海藻糖、山梨糖醇或D-甘露糖醇的組，但優(yōu)選為D-甘露糖 醇。
[0042] 本發(fā)明還涉及用于阻止、預(yù)防和治療下列疾病和病狀的藥物制劑：
[0043]-應(yīng)激相關(guān)疾病和病癥，胃腸道任何部分中的潰瘍，一般性抗炎活性，胃腸炎性疾 病，克羅恩氏病，急性胰腺炎；
[0044] _器官保護(hù)活性：保護(hù)肝臟和胰腺病變，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，預(yù)防粘連形成，預(yù)防和治 療心肌梗死和腦卒中，在免疫系統(tǒng)中的保護(hù)作用；
[0045]-治療病毒感染，特別是甲型肝炎、皰疹病毒、A型流感病毒和ARBO病毒，諸如蜱傳 腦炎，西尼羅河熱，登革熱1-4型，巨細(xì)胞病毒CMV和LCM病毒，貓白血病病毒；
[0046] _治療黑色素瘤及相關(guān)腫瘤；
[0047]-傷口、燒傷、骨折的加速愈合，斷裂的神經(jīng)聯(lián)系、跟腱和破裂的肌肉、脊髓損傷的 再生；
[0048] _治療與NO形成相關(guān)的器質(zhì)性異常：高血壓，低血壓，過敏反應(yīng)，循環(huán)和感染性休 克，凝血細(xì)胞聚集；
[0049]-治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥：多發(fā)性硬化，重癥肌無力，紅斑狼瘡，神經(jīng)病變，軀體 感覺神經(jīng)功能障礙，哮喘，鼻炎，天皰瘡和濕疹；
[0050] _兒茶酚胺能功能障礙，精神分裂癥，苯丙胺，藥物和酒精戒斷效應(yīng)；
[0051]_預(yù)防和消除因皮質(zhì)類固醇和NSAID引起的病癥；
[0052] _治療眼中的鱗狀黃斑變性；
[0053]-作為原始療法用于其中血液循環(huán)的快速重組是必需的所有病況；
[0054] _在獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中用于動物增重以及用于增加精子的貯存穩(wěn)定性。
[0055] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的十五肽鹽在制備用作食品補(bǔ)充劑的制劑中的用途。
[0056] 發(fā)明詳述
[0057] 新型化合物的組成和結(jié)構(gòu)通過使用質(zhì)譜儀，通過氨基酸分析，1H-NMR, FTIR和UV光 譜來測定。UV光譜在Varian Carry 50光譜儀中記錄，F(xiàn)TIR光譜在Perkin Elmer 727B光 譜儀中記錄，質(zhì)譜在AutoSpec Q質(zhì)譜儀上記錄，以及1H-NMR光譜在Bruker Advance DPX500 光譜儀上記錄。比旋度[a ]D28使用Perkin Elmer 141型光譜儀測定。對于實施例43中 的光學(xué)成像，使用攝像機(jī)Veho Discovery VMS-001，x30-30,對于熱成像，使用利用FLIR QuickPlot軟件的紅外攝像機(jī)的T-335 (FLIR，USA)。
[0058] 上述問題通過具有可以是L-、D-或DL-形式的堿性氨基酸的新型十五肽 bepecin鹽而得到解決。典型的氨基酸是精氨酸，賴氨酸，鳥氨酸，2, 4-二氨基丁酸， 2, 6-diaminocapronic acid，2, 6-二氨基己酸，2, 5-二氨基戊酸，2, 6-二氨基庚二酸， 2, 3-二氨基丙酸，瓜氨酸，高精氨酸，高賴氨酸（homolysine)等。這些鹽可由一分子的十五 肽和一個、兩個或三個分子的堿性氨基酸組成。
[0059] 鹽溶液的pH值取決于介導(dǎo)鹽穩(wěn)定性的鹽組成。優(yōu)選使用具有L-精氨酸的鹽。它 們通常通過將十五肽（SEQ ID NO 1)與堿性氨基酸在水溶液中以1:1至1:3 (十五肽：堿 性氨基酸）的摩爾比反應(yīng)來制備。首先，將氨基酸過量加入，隨后用稀乙酸重新滴定過量的 氨基酸以調(diào)節(jié)適宜的pH值。最佳pH值是：在具有摩爾比1:1 (十五肽：BAA)的鹽中，4. 1 至5.0,優(yōu)選4. 60±0. 05 ;在具有摩爾比1:2的鹽中，6. 7至7. 8,優(yōu)選7. 40±0. 05 ;在具有 摩爾比1:3的鹽中，該值未經(jīng)調(diào)節(jié)。該鹽溶液隨后在填充有反相吸附劑的HPLC柱上純化。 在冷凍干燥相應(yīng)的流出物后，獲得高純度的十五肽鹽。
[0060] 所獲得的鹽非常易溶于水。含有2mol堿性氨基酸/Imol十五肽的十五肽鹽具有 最有利的特性，優(yōu)選的是bepecin二-L-精氨酸鹽（縮寫：Arg-BPC)。
[0061]如在之前的專利EP 0572688、US 6, 268, 346和在出版物Z. Pflaum, R. Rl^man, Acta Chem. Slov.，2005,翌，34 - 39中所描述的，用于合成的起始化合物（十五肽BPC-157 或b印ecin)在固體聚合物載體上利用肽合成制備。十五肽可以是游離形式，如銨或鈉鹽， 或甚至是乙酸鹽或三氟乙酸鹽的形式。
[0062] bepecin二-L-精氨酸鹽（1:2,縮寫：Arg-BPC)在升高溫度下的穩(wěn)定性通過加速 老化法在50°C和65%的相對濕度（其代表具有肽結(jié)構(gòu)的化合物的非常嚴(yán)格的條件）下測 定。
[0063] 表1 :處于50°C和65%相對濕度中的十五肽含量涕減:
[0065] 該表進(jìn)一步顯示碳酸氫鈉至bepecin鹽的添加增加了其在升高溫度下的穩(wěn)定性。 這樣的添加將在〇. 5mg至3. Omg/lmg bepecin的范圍中。在片劑和膠囊劑的組成中將考慮 此特性。使用特定糖例如海藻糖或D-甘露糖醇的添加的單獨實驗顯示穩(wěn)定性的類似改善。
[0066] 具有L-精氨酸的b印ecin鹽