綠原酸在激活機體的wnt信號通路中的用途及其研究方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及綠原酸在激活機體的WNT信號通路中的用途 及其研究方法。 技術(shù)背景
[0002] 綠原酸khlorogenicacidCGA)又名咖啡較酸，是由咖啡酸kaffeicacid CA)和奎尼酸（quinicacidQA)組成的縮酪酸，其化學(xué)名為3-0-咖啡酷奎尼酸 (3-〇-caffeo^quinicacidCGA)。綠原酸是植物在進行有氧呼吸的過程中，經(jīng)憐酸戊糖途 徑中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)。綠原酸已經(jīng)被開放應(yīng)用于食品，保健品，化妝品和藥 品等多個領(lǐng)域。由于它廣泛的存在于常見的各種蔬菜水果中，具有多種生物活性，如：屯、 血管保護作用、抗氧化作用、抗紫外及抗福射作用、抗誘變及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作 用、降脂降糖作用、免疫調(diào)節(jié)作用等。在醫(yī)藥化工和食品等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。目前已 有大量證據(jù)顯示綠原酸具備抗癌功能，然而，目前為止綠原酸抗癌功能的分子學(xué)作用機制 尚不明確，從而限制了人們從分子和基因?qū)用鎸ζ淇拱C理相關(guān)的信號通路、精確的作用 祀點、具體生物因子的準確把握和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述問題，本發(fā)明提供了綠原酸的一種從基因和分子水平調(diào)控機體WNT信號 通路新用途，即綠原酸在激活機體的WNT信號通路中的用途，建立了WNT信號通路與綠原酸 抗癌功能之間的分子學(xué)聯(lián)系，提供了一種通過綠原酸精確調(diào)控機體WNT信號通路的方法。 通過該應(yīng)用可進一步用于指導(dǎo)腫瘤的治療，也可W用于建立相關(guān)的研究模型用于對WNT信 號通路的具體作用原理或其他相關(guān)的應(yīng)用。
[0004] 進一步的，所述機體為患癌機體，更進一步的為荷瘤小鼠。
[0005] 進一步的，在上述應(yīng)用中通過上調(diào)基因GSK-3P和APC的表達來激活WNT信號通 路。
[0006] 進一步的，還同時下調(diào)P-Catenin基因的表達。
[0007] 作為可選方式，在上述用途中，將綠原酸制作成含有效劑量的藥物制劑后施用于 機體。
[0008] 作為可選方式，在上述用途中，所述綠原酸的使用劑量為：l-100mg/kg。優(yōu)選為 20 ~40mg/kg。
[0009] 作為可選方式，所述的藥物制劑是W綠原酸為有效成分，加入一種或多種藥學(xué)上 可接受的藥用賦形劑制備而成的制劑。
[0010] 作為可選方式，所述的藥物中每制劑單位含有綠原酸1~3000mg。
[0011] 作為可選方式，所述的藥物是口服制劑、注射制劑或外用透皮給藥制劑。 陽01引作為可選方式，所述的藥物是綠原酸濃度為1~40mg/血的生理鹽水注射液。也 可選擇其他藥學(xué)上可接受的注射液。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種綠原酸激活機體WNT信號通路的分子機制的研究方法，包括 W下步驟：
[0014] (1)建立動物模型；
[0015] (2)采用綠原酸對模型動物進行干預(yù)作為實驗組，同時建立對照組；
[0016] (3)采用基因忍片技術(shù)獲得實驗組和對照組中的差異表達基因；
[0017] (4)采用時間序列分析、基因功能分類分析（GO)和信號通路分析篩選出相關(guān)的基 因；
[0018] (5)采用ELISA技術(shù)或分子印記檢測（westernblottest)技術(shù)或PCR技術(shù)對步 驟（4)篩選出的基因進行驗證。
[0019] 采用目前的基因忍片對模型動物的基因表達進行分析時，由于方法本身的系統(tǒng)誤 差和隨機誤差（如RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、雜化過程中產(chǎn)生的誤差W及基因忍片和RNA質(zhì)量 的影響等）會在一定程度上影響分析結(jié)果的準確性，該方法雖然可W快速基因表達的差異 但由誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)果的可能性也很大，本發(fā)明通過將基因忍片技術(shù)分析獲得的差異 表達基因與pathway(信號傳導(dǎo)通路）和GO(geneontology)兩個指標來進行分析和相互 驗證，將差異基因控制在研究目標相關(guān)功能基因的范圍內(nèi)有助于高效準確地篩選出目標基 因，同時采用化ISA技術(shù)或分子印記檢測（westernblottest)技術(shù)或PCR技術(shù)對步驟（4) 中篩選出的基因進行驗證，可有效避免假陽性，提升結(jié)果的可信度。
[0020] 作為可選方式，所述步驟（1)中的動物模型為小鼠EMT-6乳腺癌動物模型，本領(lǐng)域 技術(shù)人員也可根據(jù)研究需要和實際情況靈活選擇其他動物模型。
[0021] 作為可選方式，所述步驟（2)中的對照組可W包括陽性對照、陰性對照、空白對 照，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)研究需要和實驗對照的公知設(shè)計原理進行靈活的選擇。例如，所 述對照組可W包括多締紫杉醇干預(yù)組、干擾素干預(yù)組和生理鹽水空白對照組。
[0022] 作為可選方式，所述步驟（2)中的實驗組中包括多個不同劑量的實驗組。進一步 的，包括綠原酸劑量分別為5mg/kg、lOmg/kg和20mg/kg的S個實驗組。作為可選，各實驗 組和對照組分別設(shè)置至少3組平行試驗，優(yōu)選為5組平行試驗。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種采用上述方式篩選出的基因在激活機體的WNT信號通路中 應(yīng)用，其特征在于，通過促進機體本身的WNT信號通路關(guān)鍵基因的表達或向機體中引入外 源性的WNT信號通路關(guān)鍵基因。通過促使相關(guān)基因的高表達，激活WNT信號通路來實現(xiàn)抗 癌效果。
[0024] 作為可選方式，所述WNT信號通路關(guān)鍵基因為GSK-3 P和APC中的至少一種。研 究證實：糖原合成激酶3(GSK-3P)基因是泛素連接酶E3(APC)的上游基因，GSK-3P基因 能夠上調(diào)APC基因的表達，兩者又能在WNT信號通路直接下調(diào)處于更下游的P -連環(huán)蛋白 (P-catenin)基因的表達。P-連環(huán)蛋白可作為細胞核內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子來促進細胞分裂 基因的表達，P-連環(huán)蛋白的積累可能會導(dǎo)致腫瘤的形成。另外，糖原合成激酶3可通過多 種信號通路對轉(zhuǎn)錄活性、細胞的增殖、分化和遷移產(chǎn)生影響，還能夠使軸蛋白和P-連環(huán)蛋 白憐酸化，導(dǎo)致P-連環(huán)蛋白降解。APC基因的表達可在細胞分裂后期促進免疫復(fù)合物的高 效、快速和高度選擇性的降解，同時也可W使軸蛋白和P-連環(huán)蛋白憐酸化，導(dǎo)致P-連環(huán) 蛋白降解。本發(fā)明通過上調(diào)GSK-3P和APC基因來抑制P-連環(huán)蛋白基因的表達和降低體 內(nèi)的P-連環(huán)蛋白水平，通過WNT信號通路促進腫瘤細胞的調(diào)亡，可實現(xiàn)抗腫瘤功能。
[00巧]作為可選方式，通過向機體施用有效劑量的綠原酸來促進機體本身的WNT信號通 路關(guān)鍵基因的表達。采用綠原酸依靠機體自身的響應(yīng)機制可同時實現(xiàn)上述2種基因的高表 達，對WNT信號通路進行多方位的協(xié)同調(diào)節(jié)，有利于提高綜合抗癌作用。
[00%] 作為可選方式，通過將WNT信號通路關(guān)鍵基因與基因載體復(fù)合后引入機體中使其 進行表達。通過引入外源性基因可在機體本身缺乏相應(yīng)基因的情況下實現(xiàn)對WNT信號通路 的控制，且可根據(jù)需要對單一基因或特定基因的組合作用進行研究，簡化研究對象。作為可 選方式，所述載體為常用的腺病毒等病毒載體或常用的非病毒載體（如PEI等）。
[0027] 本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟W外，均可任何方式組合。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] 本發(fā)明提供了一種從基因和分子水平調(diào)控機體的WNT信號通路的新方法，為從基 因和分子水平研究機體的WNT信號通路提供了新的切入點。同時還提供了一種從基因和分 子水平研究綠原酸抗癌機理的方法，該方法可有效控制誤差和避免假陽性結(jié)果，準確性高， 易于實現(xiàn)。通過該方法成功篩選出2種WNT信號通路關(guān)鍵基因，通過對該基因的調(diào)控可有 效調(diào)節(jié)機體的WNT信號通路，可用于腫瘤的治療。
【附圖說明】：
[0030] 圖1為實施例1中基因忍片技術(shù)檢測獲得的擬合曲線18和21的示意圖，其中（a) 擬合曲線18,（b)為擬合曲線21 ; 陽03U 圖2為實施例1中各組中立種基因表達的相對量，其中（a)為GSK-3P基因，化） 為APC基因，（C)為P-catenin基因；
[0032] 圖3為本發(fā)明中的WNT信號通路的示意圖。
【具體實施方式】：
[0033]W下通過實施例的【具體實施方式】再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但 不應(yīng)當將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。在不脫離本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)做的任何修改，W及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的等同替換或者改 進，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。 陽〇34] 實施例1
[0035] 1.動物模型的建立
[0036] 1. 1乳腺癌移植BALB/C鼠模型的建立
[0037] 本次實驗采用的瘤株為EMT-6 (小鼠乳腺癌細胞）細胞。
[0038] 1. 2EMT-6細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、接種
[0039] 將凍存細胞株從-152°C超低溫冰柜中取出，40°C水浴解凍，離屯、并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 洗涂后用完全培養(yǎng)基懸浮細胞，轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)