CABYR-a/b在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VP16和TRAIL的敏感性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及CABYR-a/b在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VP16和TRAIL的敏 感性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] f丐離子結(jié)合酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白（calcium-bindingtyrosine phosphorylation-regulatedprotein，CABYR)，于 2002 年首次在精子中發(fā)現(xiàn)，其包括 6 個(gè) 轉(zhuǎn)錄本編碼5種蛋白亞型，包括CABYR-a, -b,-C,-d,和-e(兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)編碼相同的亞 型，CABYR-c)。CABYR具有睪丸特異性，其定位于精子細(xì)胞的胞質(zhì)和成熟精子的鞭毛中。根 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CABYR在多種癌癥中表達(dá)，如腦癌、食管癌、肝癌和肺癌。然而關(guān)于CABYR生 物學(xué)功能上的作用，只有在肝癌和肺癌中有極少的報(bào)道，如在H印G2 (人肝癌細(xì)胞）中沉默 CABYR-c可使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。CABYR的生物功能有待于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中慢慢發(fā)掘。 [0003] Etoposide(依托泊戒，簡(jiǎn)稱VP16)，主要作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo)，抑制DNA 的合成，干擾Topo使DNA斷裂重新連接，抑制有絲分裂，使細(xì)胞分裂停止在晚S期或早G2 期，是細(xì)胞周期特異性藥物。
[0004] 腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL)，可以在人類(lèi)的多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮 強(qiáng)烈的誘導(dǎo)凋亡的作用[7-10]。截至目前，TRAIL被發(fā)現(xiàn)存在5種受體，而只有其中的兩種 (DR4和DR5)具有胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域，正是這些結(jié)構(gòu)域可以與TRAIL結(jié)合激活胞外及胞內(nèi)的凋 亡通路。多種臨床藥物可以上調(diào)TRAIL死亡受體的表達(dá)進(jìn)而同TRAIL相互作用，如DR4-和 DR5-競(jìng)爭(zhēng)的單克隆抗體可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。TRAIL的死亡受體具有可以選擇性 的損傷腫瘤細(xì)胞而不會(huì)造成正常細(xì)胞損傷的特點(diǎn)，引起了抗腫瘤治療的廣泛關(guān)注。由于一 些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞特性，產(chǎn)生了對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡不敏感的現(xiàn)象的原因依然得不到解釋， 然而研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)TRAIL敏感的細(xì)胞系其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制包括對(duì)死亡受體的修飾，Akt的 活化和過(guò)表達(dá)一系列蛋白，如cFLIP、X-linkedinhibitorofapoptosis(XIAP)、Bcl-xL、 suvivin。蛋白的表達(dá)或個(gè)別試劑的加入可調(diào)節(jié)TRAIL抗性的機(jī)制，進(jìn)而提高TRAIL的殺傷 效率。
[0005] 目前為止，尚未見(jiàn)關(guān)于CABYR與VP16和TRAIL之間關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種CABYR-a/b抑制劑的新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了CABYR蛋白抑制劑在如下（a)-(c)任一中的應(yīng)用：
[0008] (a)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VP16和/或TRAIL的敏感性；
[0009] (b)制備用于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VP16和/或TRAIL的敏感性的產(chǎn)品；
[0010] (C)制備用于協(xié)同VP16和/或TRAIL治療腫瘤的產(chǎn)品。
[0011] 本發(fā)明還提供了CABYR蛋白抑制劑在如下（al)-(a3)至少一種中的應(yīng)用：
[0012] (al)增強(qiáng)VP16和/或TRAIL誘導(dǎo)所致腫瘤細(xì)胞凋亡，和/或制備用于增強(qiáng)VP16 和/或TRAIL誘導(dǎo)所致腫瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品；
[0013] (a2)增強(qiáng)VP16誘導(dǎo)所致腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase3斷裂，和/或制備用于增強(qiáng)VP16誘 導(dǎo)所致腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase3斷裂的產(chǎn)品；
[0014] (a3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DR5蛋白表達(dá)，和/或制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DR5蛋白表達(dá)的 產(chǎn)品。
[0015] 活性成分為如下（1)或⑵或（3)的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0016] (I)CABYR蛋白抑制劑、VP16 和TRAIL;
[0017] (2)CABYR蛋白抑制劑和VP16 ;
[0018] (3)CABYR蛋白抑制劑和TRAIL;
[0019] 所述產(chǎn)品具有如下（bl)-(b4)功能中的至少一種：
[0020] (bl)治療腫瘤；
[0021] (b2)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；
[0022] (b3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase3斷裂；
[0023] (b4)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DR5蛋白表達(dá)。
[0024] 所述產(chǎn)品中的各組分分別單獨(dú)包裝。
[0025] 在本發(fā)明中，所述CABYR蛋白為a亞型CABYR蛋白和/或b亞型CABYR蛋白。
[0026] 相應(yīng)的，所述CABYR蛋白抑制劑為抑制a亞型CABYR蛋白表達(dá)的物質(zhì)和/或抑制 b亞型CABYR蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
[0027] 進(jìn)一步，所述抑制a亞型CABYR蛋白表達(dá)的物質(zhì)和所述抑制b亞型CABYR蛋白表 達(dá)的物質(zhì)具體為如下（I)或（II)所示的shRNA或者編碼所述shRNA的DNA: (I)將序列表 中序列6中的T均替換為U后所得序列所示的shRNA; (II)將序列表中序列7中的T均替 換為U后所得序列所示的shRNA;相應(yīng)的，所述"編碼所述shRNA的DNA"可為序列表中序列 6或序列7所示的DNA片段或含有所述DNA片段的表達(dá)盒或重組質(zhì)粒。
[0028] 所述a亞型CABYR蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列4所示；所述b亞型 CABYR蛋白的氣基酸序列具體如序列表中序列5所不。
[0029] 所述TRAIL是氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)。
[0030] 所述DR5蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列2所示。
[0031] 所述caSpaSe3是氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；相應(yīng)的，所述 caspase3斷裂為在序列3所示蛋白質(zhì)的第175位天冬氨酸處斷裂。
[0032] 在本發(fā)明中，所述腫瘤細(xì)胞凋亡主要為腫瘤細(xì)胞早期凋亡。
[0033] 在本發(fā)明中，所述腫瘤具體可為肺癌；所述腫瘤細(xì)胞具體可為肺癌細(xì)胞；更加具 體的，所述肺癌細(xì)胞具體可為NCI-H460細(xì)胞或A549細(xì)胞。
[0034] 在本發(fā)明中，以上所有的所述產(chǎn)品均可為藥物。
[0035] 在本發(fā)明中，所述VP16均指的是化療藥物Etoposide(依托泊戒）。
[0036] 實(shí)驗(yàn)證明，沉默CABYR-a/b能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中DR5蛋白表達(dá)，增強(qiáng)VP16誘導(dǎo)所 致腫瘤細(xì)胞中caspase3斷裂，增強(qiáng)VP16和/或TRAIL誘導(dǎo)所致腫瘤細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明 研究結(jié)果表明CABYR-a/b蛋白抑制劑對(duì)于協(xié)同VP16和/或TRAIL治療腫瘤（如肺癌）具 有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為沉默NCI-H460細(xì)胞中CABYR-a/b的沉默效果的RT-PCR和western blot檢 測(cè)結(jié)果。其中，shRNAl表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2 表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列 的克隆細(xì)胞。
[0038] 圖2為采用MTT法檢測(cè)肺癌細(xì)胞穩(wěn)定沉默CABYR-a/b后細(xì)胞的存活率的結(jié)果（經(jīng) VP16處理）。其中，shRNAl和shRNA表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆 細(xì)胞；shRNA2表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入 無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0039] 圖3為采用DAPI對(duì)沉默CABYR-a/b的肺癌細(xì)胞進(jìn)行染色，而后用熒光顯微鏡觀察 凋亡細(xì)胞結(jié)果（經(jīng)VP16處理）。其中，A為NCI-H460相關(guān)細(xì)胞；B為A549相關(guān)細(xì)胞。shRNAl 和shRNA表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2表示轉(zhuǎn)入沉默 載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0040] 圖4為Annexin V/PI染色后采用流式分析儀定量檢測(cè)細(xì)胞早期和晚期的凋亡率 (經(jīng)VP16處理）。其中，A為NCI-H460相關(guān)細(xì)胞；B為A549相關(guān)細(xì)胞。shRNAl和shRNA表 示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/ Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0041] 圖5為采用western blot對(duì)沉默CABYR-a/b的肺癌細(xì)胞聯(lián)合VP16處理后的凋亡 相關(guān)的caspase3進(jìn)行檢測(cè)。其中，A為NCI-H460相關(guān)細(xì)胞；B為A549相關(guān)細(xì)胞。shRNAl 和shRNA表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2表示轉(zhuǎn)入沉默 載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0042] 圖6為沉默CABYR-a/b后可明顯促進(jìn)體內(nèi)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物VP16的敏感性（月中 瘤體積及重量）。其中，A為腫瘤直觀形態(tài)圖；B為荷瘤體積；C為腫瘤重量。shRNA表示轉(zhuǎn) 入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆 細(xì)胞。
[0043] 圖7為沉默CABYR-a/b后可明顯促進(jìn)體內(nèi)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物VP16的敏感性 (腫瘤組織TUNEL染色）。shRNA表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121克隆細(xì)胞； sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0044] 圖8為采用MTT法檢測(cè)TRAIL處理穩(wěn)定沉默CABYR-a/b的NCI-H460細(xì)胞后的細(xì) 胞存活率。shRNAl表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2表示 轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆細(xì)胞；shVec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克 隆細(xì)胞。
[0045] 圖9為Annexin V/7-AAD染色后采用流式分析儀定量檢測(cè)TRAIL處理穩(wěn)定沉默 CABYR-a/b的NCI-H460細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況。其中，A為未經(jīng)TRAIL處理組的流式細(xì)胞 圖；B為經(jīng)TRAIL處理組的流式細(xì)胞圖；C為根據(jù)B所得的柱形圖。shRNAl表示轉(zhuǎn)入沉默載 體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆細(xì)胞；shRNA2表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/ b-303的克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0046] 圖10為Annexin V/7-AAD染色后采用流式分析儀定量檢測(cè)TRAIL處理向穩(wěn)定沉 默CABYR-a/b的NCI-H460細(xì)胞中重新轉(zhuǎn)入CABYR-a/b后的細(xì)胞凋亡情況。其中，A為各組 細(xì)胞凋亡情況柱形圖；B為各組細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞圖。其中"-vehicle"表示向相應(yīng)細(xì) 胞中導(dǎo)入PCMV-Myc空載體；"-CA"和CABYR表示向相應(yīng)細(xì)胞中導(dǎo)入用于過(guò)表達(dá)CABYR-a的 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-CABYR-a。
[0047] 圖11為沉默CABYR-a/b后可明顯促進(jìn)體內(nèi)肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。其中，A 為各組小鼠的荷瘤體積；B為各組裸鼠的腫瘤重量；C為各組裸鼠腫瘤的直觀形態(tài)；D為各 組小鼠腫瘤組織的TUNEL染色結(jié)果。shRNA表示轉(zhuǎn)入沉默載體pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121 克隆細(xì)胞；sh-vec表示轉(zhuǎn)入無(wú)義干擾序列的克隆細(xì)胞。
[0048] 圖12為沉默CABYR-a/b是通過(guò)上調(diào)DR5的表達(dá)提高肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋 亡。其中，A為沉默CABYR-a/b可以增加DR5在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)；B為利用DR5的 特異性抗體，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面的DR5受體的表達(dá)量；D為AD5-10處理后用 AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率；C為根據(jù)D所得柱形圖；E為將TRAIL處理 后的細(xì)胞加入lOOng/mLDR5特異性抗體進(jìn)行封閉，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率；F為將 TRAIL處理后的細(xì)胞加入200ng/mLDR5特異性抗體進(jìn)行封閉，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 率。E和F中，"-block"表示采用特異性抗DR5的抗體進(jìn)行了封閉。
【具體實(shí)施方式】
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