發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于從血液(即，從無細(xì)胞循環(huán)DNA、外來體、微RNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或總血細(xì)胞)高度特異性地靶向捕獲人類基因組和轉(zhuǎn)錄組的區(qū)域的方法，以允許使用組合的核酸酶、連接、聚合酶和測序反應(yīng)高度靈敏地檢測突變、表達、拷貝數(shù)、易位、可變剪接和甲基化變化。發(fā)明背景DNA測序的進展有望標(biāo)準(zhǔn)化和開發(fā)非侵入式分子診斷來改善產(chǎn)前護理、移植功效、癌癥和其它疾病檢測以及個性化治療。當(dāng)前，未確定患有易患疾病或早期疾病的患者，并且那些患有疾病的患者沒有得到最佳治療--這都是因為診斷水平的失敗。在癌癥領(lǐng)域中，需要開發(fā)此類技術(shù)用于早期檢測、指導(dǎo)療法和監(jiān)測復(fù)發(fā)-全部來自血液樣品。這包括需要開發(fā)：(i)已知基因中的單堿基突變、小插入和小缺失突變(當(dāng)以無細(xì)胞DNA的1％至0.01％存在時)的高靈敏度檢測；(ii)啟動子高甲基化和低甲基化(當(dāng)以無細(xì)胞DNA的1％至0.01％存在時)的高靈敏度檢測；(iii)從腫瘤衍生的外來體或RISC復(fù)合物分離的腫瘤特異性mRNA、lncRNA和miRNA或血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的精確定量；(iv)從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA中的腫瘤特異性拷貝變化的精確定量；(v)從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA中的突變、啟動子高甲基化和低甲基化的精確定量。所有這些(從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA的腫瘤特異性拷貝變化的定量除外)都需要聚焦基因組的靶基因或區(qū)域的測序?？商娲兀瑴y定來自原始片段的兩條鏈的序列信息或甲基化狀態(tài)提供急需確認(rèn)的罕見事件。正常血漿含有從經(jīng)歷正常生理過程的正常細(xì)胞中釋放的核酸(即外來體，細(xì)胞凋亡)。在應(yīng)激、炎癥、感染或損傷的條件下，可能有額外釋放的核酸。通常，從凋亡細(xì)胞釋放的DNA的平均長度為160bp，而來自胎兒細(xì)胞的DNA的平均長度為約140bp。來自癌癥患者的血漿含有從經(jīng)歷異常生理過程的癌細(xì)胞中釋放的核酸，以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)內(nèi)的核酸。同樣地，來自孕婦的血漿含有從胎兒細(xì)胞釋放的核酸。開發(fā)可靠的診斷和篩選測試面臨許多挑戰(zhàn)。第一個挑戰(zhàn)是區(qū)分發(fā)源于腫瘤或胎兒的指示疾病(即早期癌癥)的那些標(biāo)記對比存在發(fā)源于正常組織的相同標(biāo)記。還需要平衡檢查的標(biāo)記的數(shù)量和測試成本以及測定的特異性和靈敏度。這是一個需要解決疾病如癌癥中的生物變異的挑戰(zhàn)。在許多情況下，測定應(yīng)充當(dāng)篩選工具，從而需要使用輔助診斷隨訪(即結(jié)腸鏡檢查、羊膜穿刺術(shù))。加上生物學(xué)問題，需要可靠地檢測核酸序列突變或啟動子甲基化差異，或可靠地量化來自極少量初始細(xì)胞(即來自CTC)或者在癌癥或胎兒特異性信號存在大多數(shù)發(fā)源于正常細(xì)胞的大多數(shù)核酸時的DNA或RNA拷貝數(shù)量。最后，技術(shù)挑戰(zhàn)是區(qū)分由檢測所需疾病特異性核酸差異所產(chǎn)生的真實信號對比由存在于樣品中的正常核酸產(chǎn)生的錯誤信號對比在沒有疾病特異性核酸差異存在下產(chǎn)生的錯誤信號。舉例來說，考慮檢測血漿中存在p53基因中具有突變或具有甲基化啟動子區(qū)域的循環(huán)腫瘤DNA的挑戰(zhàn)。此類樣品將含有大部分源自正常細(xì)胞的無細(xì)胞DNA，其中腫瘤DNA可能僅包含總無細(xì)胞DNA的0.01％。因此，如果試圖通過全測序?qū)ふ掖祟愅蛔僁NA的存在，將需要對100,000個基因組測序才能鑒定10個具有突變的基因組。這將要求對300,000GB的DNA測序，工作量超出當(dāng)前測序技術(shù)的能力，更不用提大量的數(shù)據(jù)管理問題。為避免這個問題，許多小組試圖捕獲特異性靶區(qū)域或?qū)λ紤]的區(qū)域進行PCR擴增。序列捕獲受到遺失的困擾，使得有可能捕獲到了所需序列的90-95％，但錯過所需片段?？商娲?，PCR擴增提供了引入與真實突變難以區(qū)分的罕見錯誤的風(fēng)險。此外，PCR丟失甲基化信息。雖然傳統(tǒng)上使用亞硫酸氫鹽處理來測定啟動子甲基化的存在，但這也破壞了DNA樣品且缺乏識別無細(xì)胞DNA中的多個甲基化變化的能力。有許多用于降低錯誤率和改善測序運行的精確度的不同方法。通過反復(fù)給相同的DNA區(qū)域測序，可在高錯誤率的存在下實現(xiàn)一致性準(zhǔn)確性(consensusaccuracy)。然而，高錯誤率使得非常難以鑒定低豐度的序列變體，例如，在試圖在正常DNA存在下鑒定癌癥突變時。因此，需要低錯誤率才能檢測相對低豐度的突變。第一種稱為標(biāo)簽化擴增子深度測序(TAm-Seq)方法(Forshew等人，“NoninvasiveIdentificationandMonitoringofCancerMutationsbyTargetedDeepSequencingofPlasmaDNA，”SciTranslMed.4(136)：136(2012))的方法基于設(shè)計引物來擴增涵蓋選定癌癥相關(guān)基因區(qū)域(包括TP53、EGFR、BRAF和KRAS)的5995個堿基。這種方法能夠以2％至65％的頻率鑒定p53基因中的突變。在這種方法中，將引物設(shè)計成在具有許多PCR引物的多重反應(yīng)中預(yù)先擴增DNA(持續(xù)15個循環(huán))。這產(chǎn)生了所需和非所需產(chǎn)物，隨后進行單重PCR，以進一步擴增所需產(chǎn)物中每個。在標(biāo)準(zhǔn)下一代測序之前，使片段經(jīng)受最后的條碼PCR。這種方法的優(yōu)點是它使用經(jīng)時間檢驗的多重PCR-PCR，這對于擴增少量起始核酸而言是無可比擬的。缺點是這種方法在早期數(shù)輪擴增中無法區(qū)分真實突變與PCR錯誤。因此，雖然2％的靈敏度(即檢測50wt等位基因中的一個突變等位基因)足以在作出治療決定之前評估晚期癌癥，但對于早期檢測而言不夠靈敏。第一方法的變型稱為安全測序系統(tǒng)“Safe-SeqS”(Kinde等人，“DetectionandQuantificationofRareMutationswithMassivelyParallelSequencing，”ProcNatlAcadSciUSA108(23)：9530-5(2011))，其中將隨機剪切基因組DNA附接至連接至基因組DNA的接頭的末端。所述方法證實，絕大多數(shù)通過基因組測序描述的突變實際上是錯誤，并將假定測序錯誤減少至少70倍。同樣，稱為超靈敏深度測序的方法(Narayan等人，“UltrasensitiveMeasurementofHotspotMutationsinTumorDNAinBloodUsingError-suppressedMultiplexedDeepSequencing，”CancerRes.72(14)：3492-8(2012))將條碼附在引物上以進行巢式PCR擴增?？杉俣?，開發(fā)出附接條碼的類似系統(tǒng)來檢測罕見突變和拷貝數(shù)變化，這依賴于生物信息學(xué)工具(Talasaz，A.；SystemsandMethodstoDetectRareMutationsandCopyNumberVariation，美國專利申請US2014/0066317A1，2014年3月6日)。使用成對末端讀序來覆蓋含有假定突變的區(qū)域。利用這種方法追蹤晚期癌癥患者的血漿中的已知突變。這些方法需要許多讀段來建立共有序列。這兩種方法要求延伸跨過靶DNA，且因此，無法區(qū)分真實突變與聚合酶產(chǎn)生的錯誤，特別是在跨過受損堿基，如脫氨基胞嘧啶進行拷貝時。最后，這些方法不提供關(guān)于片段內(nèi)CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息。稱為雙重測序的第二方法(Schmitt等人，“DetectionofUltra-RareMutationsbyNext-GenerationSequencing，”ProcNatlAcadSciUSA109(36)：14508-13(2012))基于使用含有12堿基隨機化標(biāo)簽的雙重接頭。通過擴增輸出靶DNA的上鏈和下鏈，給定片段獲得獨特標(biāo)識符(每個末端由12個堿基組成)，使得可經(jīng)由測序追蹤。將共享一組獨特標(biāo)簽的序列讀段歸入配對家族，其成員具有上鏈或下鏈方向上的鏈標(biāo)識符。每個家族對反映一個雙鏈DNA片段的擴增。存在于只有一個或幾個家族成員中的突變表示出現(xiàn)在擴增晚期的測序錯誤或PCR引入的錯誤。出現(xiàn)在一個成對家族的許多或所有成員中的突變由第一輪擴增期間的PCR錯誤引起，諸如可能在跨過誘變DNA損傷位點拷貝時出現(xiàn)。另一方面，存在于DNA片段的兩條鏈上的真實突變出現(xiàn)在一個家族對的所有成員中。然而，具有真實突變的家族對中可同時出現(xiàn)人為突變，除了那些在第一輪PCR擴增期間出現(xiàn)的突變以外都可以獨立鑒定，且在產(chǎn)生錯誤校正的單鏈共有序列時被忽略。然后可比較從個別DNA雙鏈體的兩條鏈的每一條獲得的序列，以獲得雙鏈體共有序列，這消除了第一輪PCR期間出現(xiàn)的剩余錯誤。這種方法的優(yōu)點是明確地區(qū)分真實突變與PCR錯誤或誘變DNA損傷，并達到3.8x10-10的格外低的錯誤率。這種方法的缺點是許多片段需要測序，以獲得一個家族對中每條鏈的至少五個成員(即每個原始片段最少10個序列讀段，但由于波動通常需要多得多)。另外，所述方法尚未對cfDNA進行測試，cfDNA往往比從完整基因組DNA產(chǎn)生的片段更小，且因此需要對更多片段測序才能涵蓋所有潛在突變。最后，所述方法不提供關(guān)于片段內(nèi)CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息。稱為單分子分子倒置探針的smMIP的第三方法(Hiatt等人，“SingleMoleculeMolecularInversionProbesforTargeted，High-AccuracyDetectionofLow-FrequencyVariation，”GenomeRes.23(5)：843-54(2013)組合單分子標(biāo)記與多重捕獲來高度靈敏地檢測低頻率亞克隆變異。所述方法聲稱臨床標(biāo)本中的錯誤率為2.6x10-5。這種方法的缺點是許多片段需要測序，以獲得一個家族對中每條鏈的至少五個成員(即每個原始片段最少10個序列讀段，但由于波動通常需要多得多)。另外，該方法要求延伸跨過靶DNA，且因此無法區(qū)分真實突變與聚合酶產(chǎn)生的錯誤，特別是在跨過受損堿基如脫氨基胞嘧啶進行拷貝時。另外，所述方法尚未對cfDNA進行測試，cfDNA往往比從完整基因組DNA產(chǎn)生的片段更小，且因此需要給更多片段測序才能涵蓋所有潛在突變。最后，所述方法不提供關(guān)于片段內(nèi)CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息。稱為環(huán)形測序的第四方法(Lou等人，“High-throughputDNASequencingErrorsareReducedbyOrdersofMagnitudeUsingCircleSequencing，”ProcNatlAcadSciUSA110(49)：19872-7(2013)，還參見MutationalandfitnesslandscapesofanRNAvirrusrevealedthroughpopulationsequencing.AcevedoA，BrodskyL，AndinoR.，Nature.2014年1月30日；505(7485)：686-90；和LibrarypreparationforhighlyaccuratepopulationsequencingofRNAviruses.AcevedoA，AndinoR.NatProtoc.2014年7月；9(7)：1760-9.)基于將DNA或RNA剪切至約150個堿基，變性形成單鏈，使那些單鏈環(huán)化，使用隨機六聚體引物和phi29DNA聚合酶進行滾環(huán)擴增(在尿嘧啶-DNA糖基化酶和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶存在下)，重新將產(chǎn)物剪切成約500個堿基，然后以標(biāo)準(zhǔn)下一代測序繼續(xù)處理。此方法的優(yōu)點是滾環(huán)擴增制備原始靶DNA的多個串聯(lián)拷貝，以使得聚合酶錯誤可能只出現(xiàn)在一個拷貝中，但真實突變出現(xiàn)在所有拷貝中。讀段家族的大小平均為3個拷貝，因為所述拷貝彼此物理連接。所述方法還使用尿嘧啶-DNA糖基化酶和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶來移除含有受損堿基的靶，以消除此類錯誤。這種技術(shù)的優(yōu)點是使測序錯誤率從當(dāng)前水平的約0.1至1x10-2變成低至7.6x10-6的比率。后面的錯誤率現(xiàn)在足以在100至10,000倍過量野生型DNA存在下區(qū)分血漿中的癌癥突變。另一優(yōu)點是相同序列的2-3個拷貝物理連接，從而允許驗證從單個片段產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)的真實突變，與之相比利用雙重測序方法是至少10個片段。然而，所述方法不提供測定拷貝數(shù)變化的能力，也不提供關(guān)于片段內(nèi)的CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息。由CompleteGenomics開發(fā)的第五方法(Drmanac等人，“HumanGenomeSequencingUsingUnchainedBaseReadsonSelf-AssemblingDNANanoarrays，”Science327(5961)：78-81(2010))基于在納米球陣列上使用連接讀段?；蚪MDNA的約400個核苷酸與接頭環(huán)化，裂解，重新與其它接頭環(huán)化，并最終重新環(huán)化后含有約四個接頭。DNA利用phi29DNA聚合酶經(jīng)歷滾環(huán)擴增，以產(chǎn)生納米球。然后將這些納米球放在陣列上，并利用基于連接的方法測序。這種方法的與本文相關(guān)的特征點是可產(chǎn)生相同序列的多個串聯(lián)拷貝，隨后給單個滾環(huán)擴增產(chǎn)物測序。因為同一序列被連接酶或聚合酶詢問多次(通過合成方法組合滾環(huán)測序和其它測序)，所以每個堿基的錯誤率顯著下降。正因如此，直接給滾環(huán)產(chǎn)物測序提供許多上述環(huán)形測序方法的相同優(yōu)點。稱為SMRT-單分子實時測序的第六方法(Flusberg等人，“DirectDetectionofDNAMethylationDuringSingle-Molecule，Real-TimeSequencing，”NatMethods7(6)：461-5(2010))基于將發(fā)夾環(huán)添加至DNA片段的末端上，并允許具有鏈置換活性的DNA聚合酶在共價閉環(huán)周圍延伸，從而提供關(guān)于兩條互補鏈的序列信息。具體地說，單個聚合酶分子催化熒光標(biāo)記核苷酸并入互補核酸鏈中。當(dāng)在甲基化堿基對面并入核苷酸時，聚合酶減慢或“卡頓(stutter)”，且所得熒光脈沖允許直接檢測DNA模板中的經(jīng)修飾的核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。這種方法的準(zhǔn)確性有所提升，特別是在聚合酶可圍繞閉環(huán)來回移動幾次時，從而允許測定共有序列。雖然所述技術(shù)被設(shè)計用于提供關(guān)于“啞鈴”形底物(基本上含有線性DNA片段的兩條互補序列)的序列信息，但它也可以應(yīng)用在單鏈環(huán)狀底物上。本發(fā)明涉及克服本領(lǐng)域中的這些缺陷和其它缺陷。發(fā)明概要本發(fā)明的第一方面涉及不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合。所述集合的每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈合成核酸區(qū)段。所述第二單鏈合成核酸區(qū)段包含獨特標(biāo)識符部分，其中所述獨特標(biāo)識符部分和原始基因組DNA的區(qū)段的核苷酸序列區(qū)分所述集合中的一個嵌合單鏈核酸構(gòu)建體與所述集合中的所有其它嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于滾環(huán)擴增和/或測序。本發(fā)明的另一方面涉及包含不同環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合的系統(tǒng)。所述集合的每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈核酸區(qū)段。所述第二單鏈核酸區(qū)段的核苷酸序列包含第一固體載體引物特異性部分、第二固體載體引物特異性部分和患者標(biāo)識符序列。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于滾環(huán)擴增和/或測序。所述系統(tǒng)進一步包括延伸產(chǎn)物的集合，每個延伸產(chǎn)物包含與來自所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體互補的兩條或更多條串聯(lián)線性序列。所述集合中的每個延伸產(chǎn)物與所述集合的其互補環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體雜交。本發(fā)明的另一方面涉及包含不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合的系統(tǒng)。每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈核酸區(qū)段。所述第二單鏈核酸區(qū)段的核苷酸序列包含第一固體載體引物特異性部分、第二固體載體引物特異性部分和患者標(biāo)識符序列。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體適于滾環(huán)擴增和/或測序。所述系統(tǒng)進一步包含：一個或多個寡核苷酸擴增引物，每個引物包含至少第一核苷酸序列部分，其與所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分或第二固體載體引物特異性部分互補；以及適用于滾環(huán)擴增的聚合酶。本發(fā)明的其它方面涉及使用本發(fā)明的集合和系統(tǒng)對樣品中的多個核酸分子測序的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶核糖核酸分子的樣品，以及在樣品中生成所述一個或多個靶核糖核酸分子(如果存在于樣品中)的cDNA。所述方法進一步包括提供一個或多個第一寡核苷酸探針，每個第一寡核苷酸探針包含：(a)3＇cDNA靶標(biāo)特異性序列部分；(b)5＇cDNA靶標(biāo)特異性部分；以及其它部分，所述其它部分包含(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合；以及在有效地使所述第一寡核苷酸探針的3＇和5＇靶標(biāo)特異性部分以堿基特異性方式與所述cDNA的互補區(qū)域雜交的條件下，使所述樣品與所述一個或多個第一寡核苷酸探針接觸。產(chǎn)生適于連接雜交至其互補cDNA的第一寡核苷酸探針的3＇和5＇端的一個或多個可連接結(jié)，并連接在所述一個或多個連接結(jié)處的一個或多個第一寡核苷酸探針以形成包含連接至第一寡核苷酸探針的其它部分的靶核糖核酸序列的脫氧核糖核酸拷貝的環(huán)狀連接產(chǎn)物。所述方法進一步包括檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，以識別與樣品中的其它核糖核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶核糖核酸分子的存在。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個核酸分子的方法，所述核酸分子可能包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域。該方法包括提供可能含有包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域的一個或多個核酸分子的樣品，并提供一個或多個寡核苷酸探針組，每個探針組包含：(i)包含5＇第一靶標(biāo)特異性部分、3＇第二靶標(biāo)特異性部分和其它部分的第一寡核苷酸探針，以及(ii)包含5＇第二靶標(biāo)特異性部分、3＇第一靶標(biāo)特異性部分和其它部分的第二寡核苷酸探針，其中探針組的第一或第二寡核苷酸探針的其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。該方法進一步包括在有效地使探針組的第一和第二寡核苷酸探針以堿基特異性方式與其相應(yīng)的核酸分子(如果存在于樣品中)的第一和第二靶區(qū)域雜交的條件下，使樣品與一個或多個寡核苷酸探針組接觸；以及產(chǎn)生適于在探針組與互補的核酸分子的第一和第二靶區(qū)域雜交時將所述探針組的第一寡核苷酸探針的3＇端連接至第二寡核苷酸探針的5＇端以及將所述探針組的第一寡核苷酸探針的5＇端連接至第二寡核苷酸探針的3＇端的一個或多個可連接結(jié)。在所述一個或多個可連接結(jié)處連接探針組的第一和第二寡核苷酸，以形成包含連接至其它部分的對應(yīng)于核酸分子的第一和第二不同靶區(qū)域的核苷酸序列的環(huán)狀連接產(chǎn)物，并且檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別樣品中包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域的一個或多個核酸分子的存在(如果有的話)。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶核糖核酸分子的樣品，并將核苷酸接頭附接至樣品中的靶核糖核酸分子的3’和5’端。該方法進一步包括提供一個或多個寡核苷酸探針，每個寡核苷酸探針包括：(a)與靶核糖核酸分子的3＇核苷酸接頭互補的3＇部分；(b)與靶核糖核酸分子的5＇核苷酸接頭互補的5＇部分；以及(c)其它部分，所述其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。在有效地使所述寡核苷酸探針的3＇和5＇部分以堿基特異性方式與靶核糖核酸分子(如果存在于樣品中)上的互補核苷酸接頭雜交的條件下，使所述樣品與所述一個或多個寡核苷酸探針接觸。延伸雜交的寡核苷酸探針的3＇端以產(chǎn)生所述一個或多個靶核糖核酸分子的補體，并將所述寡核苷酸探針的3＇延伸端連接到所述寡核苷酸探針的5＇端，以形成包含互補于所述靶核糖核酸分子的3＇核苷酸接頭的序列、互補于所述靶核糖核酸分子的5＇核苷酸接頭的序列、所述一個或多個靶核糖核酸分子的補體和所述寡核苷酸探針的其它部分的環(huán)狀連接產(chǎn)物。該方法進一步包括檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別與樣品中的其它核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶核糖核酸分子的存在。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶核糖核酸分子的樣品，并將核苷酸接頭連接至樣品中的靶核糖核酸分子的3’和5’端，其中所述核苷酸接頭通過其它部分彼此連接，所述其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合，由此所述連接形成包含靶核糖核酸分子、3＇和5＇核苷酸接頭序列和其它部分的環(huán)狀連接產(chǎn)物。該方法進一步包括提供一個或多個第一寡核苷酸引物，其包含與所述環(huán)狀連接產(chǎn)物的3＇或5＇核苷酸接頭序列互補的核苷酸序列；以及使所述一個或多個第一寡核苷酸引物以堿基特異性方式與所述環(huán)狀連接產(chǎn)物雜交。延伸所述第一寡核苷酸引物的3＇端以產(chǎn)生所述環(huán)狀連接產(chǎn)物的補體，并且檢測和區(qū)分所述樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物補體，從而識別與所述樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基的一個或多個靶核糖核酸分子的存在。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶核糖核酸分子的樣品，并提供一個或多個寡核苷酸探針組，每個組包含：(a)具有5＇莖環(huán)部分和與靶核糖核酸分子的3＇部分互補的3＇部分的第一寡核苷酸探針；(b)具有與靶核糖核酸分子的5＇端的拷貝互補的3＇部分、與第一寡核苷酸探針的5＇莖環(huán)部分互補的5＇部分以及其它部分的第二寡核苷酸探針，所述其它部分包含：(i)獨特靶標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。該方法進一步包括摻混所述樣品、來自探針組的一個或多個第一寡核苷酸探針和逆轉(zhuǎn)錄酶，以形成逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，以及延伸雜交至其互補性靶核糖核酸分子的第一寡核苷酸探針的3＇端，以產(chǎn)生所述靶核糖核苷酸分子(如果存在于所述樣品中)的補體。使探針組中的所述一個或多個第二寡核苷酸探針與包含所述靶核糖核苷酸序列的補體的延伸的第一寡核苷酸探針雜交，并在雜交至延伸的第一寡核苷酸探針的每個第二寡核苷酸探針的3＇和5＇端之間產(chǎn)生一個或多個可連接結(jié)。該方法進一步包括連接每個第二寡核苷酸探針的3＇和5＇端，以形成包含連接至所述第二寡核苷酸探針的其它部分的靶核糖核酸序列的脫氧核糖核酸拷貝的環(huán)狀連接產(chǎn)物。檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別與樣品中的其它核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶核糖核酸分子的存在。本發(fā)明的意義在于，它教導(dǎo)了一種用于從血液(即，從無細(xì)胞循環(huán)DNA、外來體、微RNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或總血細(xì)胞)高度特異性地靶向捕獲人類基因組和轉(zhuǎn)錄組的區(qū)域的方法，以允許適用于高通量診斷模式的高度靈敏地檢測突變、表達、拷貝數(shù)、易位、可變剪接和甲基化變化。本發(fā)明的單鏈構(gòu)建體適合通過一些不同技術(shù)讀出，所述技術(shù)包括下一代測序，且被設(shè)計成讀出技術(shù)不可知。為了最大化捕獲的靈敏度，本發(fā)明不僅利用雜交，而且利用聚合酶延伸和連接以減少假陽性。為了最大化特異性，用核酸外切酶消化未連接的探針，保留環(huán)化靶序列。可通過給通過滾環(huán)擴增產(chǎn)生的原始基因組序列的串聯(lián)重復(fù)序列測序獲得其它特異性。最后，本發(fā)明提出一種捕獲由通過滾環(huán)擴增在表面上產(chǎn)生的原始基因組序列產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)序列，然后通過合成給它們測序，從而允許高度準(zhǔn)確地進行突變檢測、甲基化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄組計算的方法。所述方法特別適用于鑒定直接來自血液的癌癥特異性標(biāo)記，以篩選癌癥以及監(jiān)測功效和復(fù)發(fā)。所述方法還適用于直接來自母本血液的拷貝異常和孟德爾疾病(Mendeliandiseases)的產(chǎn)前診斷。附圖簡述圖1示出了用于擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體以準(zhǔn)備下一代測序的一種方法。該方法使用利用隨機六聚體的滾環(huán)擴增(RCA)或滾環(huán)復(fù)制(RCR)。圖2示出了從RCA產(chǎn)物產(chǎn)生適于測序的雙鏈核酸分子的串聯(lián)線性拷貝的方法。圖3示出了用于產(chǎn)生適于測序的核酸分子的串聯(lián)線性拷貝的方法。該方法特異性地選擇在初始靶DNA中的所有BstU1位點處甲基化的片段。圖4示出了用于擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體以準(zhǔn)備下一代測序的替代方法。這種方法使用利用在溶液中或在表面上的單一特異性引物進行的RCA。圖5說明了一種用于在捕獲到測序流動池表面上之前將RCA或RCR中生成的線性DNA擴增子縮合成緊湊結(jié)構(gòu)的方法。圖6描繪了使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法對樣品中的多個核酸分子測序的方法。圖7描繪了用于擴增核酸分子并將所得擴增子捕獲在適于下一代測序的固體載體上的方法。圖8示出了對根據(jù)本發(fā)明的方法制備的位于固體載體表面上的擴增子測序的過程。圖9描繪了用于擴增核酸分子并將所得擴增子捕獲在適于下一代測序的固體載體上的方法。根據(jù)在圖8中所示的方法對固定的擴增子測序。圖10描繪了用于擴增核酸分子并將所得擴增子捕獲在適于下一代測序的固體載體上的另一種方法。根據(jù)在圖8中所示的方法對固定的擴增子測序。圖11描繪了用于擴增核酸分子并將所得擴增子捕獲在適于下一代測序的固體載體上的另一種方法。根據(jù)在圖8中所示的方法對固定的擴增子測序。圖12描繪了環(huán)狀靶滾環(huán)擴增產(chǎn)生用于捕獲在含有雙引物的固體載體上的單鏈串聯(lián)重復(fù)模板DNA。圖13描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖14描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖15描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖16描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖17描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖18描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖19描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖20描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖21描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖22描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖23描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖24描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖25描繪了生成本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖26描繪了生成和擴增本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖27示出了檢測在已知基因序列中的相鄰HinP1位點處的甲基化的方法。圖28描繪了檢測在整個基因組中的相鄰HinP1位點處的甲基化的過程。圖29描繪了生成含有相鄰AciI甲基化位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖30描繪了生成和擴增含有相鄰AciI甲基化位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖31描繪了生成含有相鄰AciI甲基化位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖32描繪了生成和擴增含有相鄰AciI甲基化位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖33示出了檢測在整個基因組中的相鄰AciI位點處的甲基化的過程。圖34描繪了生成含有相鄰的未甲基化HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖35描繪了生成和擴增含有相鄰的未甲基化HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖36描繪了生成含有位于HaeIII限制性位點之間的相鄰甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖37描繪了生成和擴增含有位于HaeIII限制性位點之間的相鄰甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖38示出了用于產(chǎn)生含有位于cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的HaeIII位點之間的甲基化Bsh1236I位點的本發(fā)明嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。圖39描繪了生成含有接近5’HaeIII限制性位點的一個或多個甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖40描繪了生成和擴增含有接近5'HaeIII限制性位點的一個或多個甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖41示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近基因組DNA的已知區(qū)域中的5’-HaeIII位點的甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。圖42描繪了生成含有接近3’HaeIII限制性位點的一個或多個甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖43描繪了生成和擴增含有接近3’HaeIII限制性位點的一個或多個甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖44示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的3’-HaeIII位點的甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。圖45示出了用于產(chǎn)生適于檢測在基因組DNA的已知區(qū)域中的相鄰甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。圖46示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近基因組DNA的已知區(qū)域中的Bsh1236I位點的所有甲基化CpG位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。圖47描繪了生成含有相鄰的未甲基化HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖48描繪了生成和擴增含有相鄰的未甲基化HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖49描繪了生成含有位于HaeIII限制性位點之間的相鄰甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖50描繪了生成和擴增含有位于HaeIII限制性位點之間的相鄰甲基化AciI位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖51描繪了用于檢測已知基因組區(qū)域中的甲基化相鄰HinP1I位點的過程。圖52描繪了用于檢測已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰AciI位點的過程。圖53描繪了生成含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖54描繪了生成和擴增含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖55描繪了生成含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖56描繪了生成和擴增含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖57示出了用于檢測已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的過程。圖58描繪了生成含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰Hph1位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖59描繪了生成和擴增含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰Hph1位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖60描繪了生成含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰Hph1位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖61描繪了生成和擴增含有在已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰Hph1位點的本發(fā)明的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。圖62示出了用于檢測已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰Hph1位點的過程。圖63示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖64示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖65示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖66示出了用于從cfDNA生成測序即用模板的接頭設(shè)計和連接。圖67示出了用于測序、識別和驗證cfDNA的兩個靶鏈中的突變的“缺口”接頭設(shè)計。圖68示出了使用C3加尾、連接、含rG接頭的RNA酶H2活化、缺口填充和連接的用于測序、識別和驗證cfDNA的兩個靶鏈中的突變的接頭設(shè)計。圖69示出了使用具有有限r(nóng)A插入的dA加尾、C3加尾、連接、含rG接頭的RNA酶H2活化、缺口填充和連接的用于測序和識別cfDNA的任一條靶鏈中的突變的接頭設(shè)計。圖70示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖71示出了從涉及RNA酶H2活化的cfDNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖72示出了從涉及RNA酶H2活化的cfDNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一個示例性過程。圖73示出了具有雜交引物的包含原始靶cfDNA的單鏈環(huán)狀DNA的生成。圖74示出了具有含捕獲基團的雜交引物的包含原始靶cfDNA的單鏈環(huán)狀DNA的生成。圖75示出了使用靶標(biāo)特異性引物的RNA酶H2解阻生成具有雜交引物的包含原始靶cfDNA的單鏈環(huán)狀DNA。圖76示出了使用靶標(biāo)特異性引物的RNA酶H2解阻生成具有含捕獲基團的雜交引物的包含原始靶cfDNA的單鏈環(huán)狀DNA。圖77示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖78示出了從適于測序的cfDNA或剪切基因組DNA產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程。圖79示出了使用隨后可用于滾環(huán)擴增的靶標(biāo)特異性引物的捕獲來富集靶標(biāo)特異性單鏈環(huán)狀DNA的過程。圖80示出了使用隨后可用于滾環(huán)擴增的缺口型串聯(lián)靶標(biāo)特異性引物的捕獲來富集靶標(biāo)特異性單鏈環(huán)狀DNA的過程。圖81示出了使用隨后可用于滾環(huán)擴增的靶標(biāo)特異性引物富集靶標(biāo)特異性單鏈環(huán)狀DNA的過程。圖82示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖83示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖84示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖85示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖86示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖87示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖88示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖89示出了生成和富集適于測序的基因組靶標(biāo)特異性單鏈串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的過程。圖90示出了沿?zé)o細(xì)胞DNA(cfDNA)靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有20個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、60個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖91示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有20個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、80個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖92示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有50個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、60個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖93示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有50個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、80個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖94示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有50個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、50個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、3’和5’10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖95示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有60個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、60個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分、3’和5’10個堿基的接頭(黑條)以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖96示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有50個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、50個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖97示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有60個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、60個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖98示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有70個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、70個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖99示出了沿cfDNA靶片段(長度為160個核苷酸)的集合的增量為10個核苷酸堿基的寡核苷酸探針(“oligo”)家族的圖譜。每個寡核苷酸探針含有80個堿基的3′靶標(biāo)特異性部分、80個堿基的5′靶標(biāo)特異性部分以及20至160個堿基的復(fù)合標(biāo)識符序列(細(xì)線)。圖100說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大的連續(xù)靶區(qū)域(作為實例顯示約500個堿基)測序。圖101說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大的連續(xù)靶區(qū)域(作為實例顯示約500個堿基)測序。圖102說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大的連續(xù)靶區(qū)域(作為實例顯示約500個堿基)測序。圖103說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大的連續(xù)靶區(qū)域(作為實例顯示約500個堿基)測序。圖104示出了跨越一段基因組DNA中的相鄰160bp基因靶而拼接的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸。圖105示出了跨越一段基因組DNA中的相鄰160bp基因靶而拼接的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸。圖106示出了跨越一段基因組DNA中的相鄰160bp基因靶而拼接的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸。圖107示出了跨越一段基因組DNA中的相鄰160bp基因靶而拼接的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸。圖108描繪了生成含有靶核糖核酸分子的脫氧核糖核酸序列拷貝的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖109描繪了生成包含含有推定基因融合的靶核糖核酸分子的脫氧核糖核酸序列拷貝的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖110描繪了生成包含含有推定基因融合的靶核糖核酸分子的脫氧核糖核酸序列拷貝的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖111描繪了生成包含含有特定外顯子的靶核糖核酸分子的脫氧核糖核酸序列拷貝的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖112描繪了生成包含含有特定外顯子的靶核糖核酸分子的脫氧核糖核酸序列拷貝的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖113描繪了生成包含含有多態(tài)性的DNA片段的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖114描繪了生成含有與靶miRNA序列互補的脫氧核糖核酸序列的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖115描繪了生成含有與靶miRNA序列互補的脫氧核糖核酸序列的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖116描繪了生成含有與靶miRNA序列互補的脫氧核糖核酸序列的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。圖117描繪了生成含有與靶miRNA序列互補的脫氧核糖核酸序列的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述環(huán)狀構(gòu)建體適用于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的RCA和測序。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合。所述集合的每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈合成核酸區(qū)段。所述第二單鏈合成核酸區(qū)段包含獨特標(biāo)識符部分，其中所述獨特標(biāo)識符部分和原始基因組DNA的區(qū)段的核苷酸序列區(qū)分所述集合中的一個嵌合單鏈核酸構(gòu)建體與所述集合中的所有其它嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于滾環(huán)擴增和/或測序。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，所述集合通常包含1,000個與4,000,000,000個之間的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。下文詳細(xì)描述了制備所述集合的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。所述嵌合核酸構(gòu)建體的第一單鏈區(qū)段包含來自宿主的原始基因組DNA的區(qū)段。原始基因組DNA的這個區(qū)段可以是作為基因組DNA碎裂的直接產(chǎn)物的核酸片段(即，未向片段末端添加一個或多個接頭部分)或基因組DNA的已經(jīng)添加接頭的核酸片段。原始基因組DNA區(qū)段可以衍生自任何基因組，例如，動物、植物、原生動物、真菌、細(xì)菌或病毒基因組，諸如人類、蘋果樹、賈第蟲、酵母、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或乳頭瘤病毒的基因組。DNA的區(qū)段可以從任何新鮮、冷凍或固定的(例如，福爾馬林固定的和石蠟包埋的)生物來源分離，包括但不限于組織、細(xì)胞、血清、血漿、血液或外來體。所述集合的核酸構(gòu)建體的第二單鏈合成核酸區(qū)段例如經(jīng)由磷酸二酯鍵共價連接至第一單鏈區(qū)段。第二單鏈合成核酸區(qū)段包含標(biāo)識符序列。在一個實施方案中，所述標(biāo)識符序列是條碼。條碼通常是與原始基因組DNA區(qū)段的序列共同使用以區(qū)分集合中的每個核酸構(gòu)建體和另一個核酸構(gòu)建體的8-12個核苷酸的堿基序列。當(dāng)基因組DNA的片段具有相似的序列時，重要的是標(biāo)識符或條碼序列足夠相異，以使得沒有兩個核酸構(gòu)建體是相同的。對于包含約10,000個基因組當(dāng)量(在1ml無細(xì)胞DNA中的近似基因組)的集合而言，具有8個核苷酸的獨特標(biāo)識符序列包含足夠的多樣性(65,536)以確保每個環(huán)狀構(gòu)建體是獨特的。對于包含約1,000,000個基因組當(dāng)量(來自10ml血液中的總細(xì)胞的近似基因組)的集合而言，具有12個核苷酸的獨特標(biāo)識符序列包含足夠的多樣性(16,777,216)以確保每個環(huán)狀構(gòu)建體是獨特的。此外，當(dāng)基因組DNA或者是隨機片段化或以生物方式片段化(即，如在無細(xì)胞DNA中)時，基因組DNA和合成的核酸之間的結(jié)點將提供協(xié)助區(qū)分每種環(huán)狀構(gòu)建體的額外獨特序列。在另一個實施方案中，所述標(biāo)識符序列包含如下文所述的一個或多個引物結(jié)合位點和/或患者標(biāo)識符序列。引物結(jié)合位點不僅被用來促進擴增，而且還可以單獨或與患者標(biāo)識符序列組合地作為識別序列區(qū)段，以用于區(qū)分集合中的個別環(huán)狀構(gòu)建體。因此，所述集合的核酸構(gòu)建體的第二單鏈區(qū)段的標(biāo)識符序列可以包含條碼序列、一條或多條引物序列、患者標(biāo)識符序列或其任何組合。所述集合的嵌合核酸構(gòu)建體是環(huán)化的，即共價閉合的環(huán)化核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，環(huán)化構(gòu)建體是完全單鏈的。在本發(fā)明的其它方面，環(huán)化構(gòu)建體可以是部分雙鏈的或完全雙鏈的。本發(fā)明的另一方面涉及用于擴增核酸分子的方法。該方法包括提供如上所述的本發(fā)明的不同環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合，并將該集合與聚合酶和多個短引物(6至10個核苷酸，其中所述序列的部分包含隨機堿基和/或核苷酸類似物；例如，隨機六聚體、七聚體、八聚體)摻混以形成擴增反應(yīng)。所述短引物中的一個或多個與所述集合的一個或多個環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的一部分互補。所述擴增反應(yīng)混合物經(jīng)受一種或多種雜交和延伸處理，其中一個或多個短引物與環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體雜交且聚合酶延伸雜交的引物以產(chǎn)生多個延伸產(chǎn)物。每個延伸產(chǎn)物包含與來自集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體互補的兩條或更多條串聯(lián)線性序列。圖1(步驟A-D)提供了上述擴增核酸分子的方法的示例性說明。圖1的步驟A示出了集合的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體和多個隨機六聚體引物。環(huán)狀構(gòu)建體中的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段顯示為單一細(xì)黑線。原始基因組DNA區(qū)段內(nèi)的突變用(*)表示。環(huán)狀構(gòu)建體的獨特標(biāo)識符序列顯示為雙線。雜交六聚體引物連續(xù)延伸以擴增環(huán)形靶是使用具有鏈置換能力的聚合酶，例如Phi29DNA聚合酶或類似物(圖1中描繪為菱形)來實現(xiàn)的。如圖1步驟B中所示，雜交的引物的聚合酶延伸最終將置換初始引物，產(chǎn)生單鏈尾。一個或多個六聚體引物可以隨后與單鏈尾巴雜交，并繼續(xù)如圖1，步驟C和1D中所示以聚合酶介導(dǎo)延伸那些雜交引物，以形成不同長度的雙鏈延伸產(chǎn)物，每個延伸產(chǎn)物含有兩條或更多條與環(huán)形構(gòu)建體互補的串聯(lián)線性序列。通過這種擴增方法形成的雙鏈延伸產(chǎn)物的集合適于廣泛的任一種下一代測序(NGS)方案(例如454焦磷酸測序、通過合成進行的IonTorrentTM測序、通過連接進行的SOLiDTM測序或通過合成系統(tǒng)進行的MiSeqTM或HiSeqTM測序)。按照NGS方案，雙鏈延伸產(chǎn)物經(jīng)過片段化以使得靶DNA的一個或多個串聯(lián)互補拷貝在單一片段內(nèi)。將接頭附接至DNA片段的5’和3’端，以允許利用簇或珠粒擴增進行標(biāo)準(zhǔn)文庫制備和模板生成。在測序期間生成原始DNA分子的所有物理連接的互補拷貝的共有序列。因為片段內(nèi)的真實突變(*)將以2倍或3倍呈現(xiàn)，所以它們可以輕易地與聚合酶錯誤區(qū)分開來。根據(jù)本發(fā)明的這個和所有方面，本發(fā)明的嵌合環(huán)狀核酸構(gòu)建體和其延伸產(chǎn)物的測序可以使用本領(lǐng)域中已知的任何測序方法進行，所述測序方法包括但不限于以下測序方法：熒光引物雜交、分子信標(biāo)雜交、引物延伸、連接酶檢測反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、焦磷酸測序、基于核酸外切酶的測序、基于熒光的邊合成邊測序、基于熒光的邊連接邊測序、基于納米孔和納米管的測序、基于離子的邊合成邊測序和基于離子的邊連接邊測序。如本文中所用，“測序”包括用來獲得多核苷酸靶標(biāo)或模板的至少10個連續(xù)核苷酸的同一性的方法。在本發(fā)明的另一方面，所述集合的每個環(huán)狀核酸構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈合成核酸區(qū)段。所述第二單鏈合成核酸區(qū)段包含獨特標(biāo)識符部分和初級引物結(jié)合位點，其中獨特標(biāo)識符部分、初級引物結(jié)合位點和原始基因組DNA的區(qū)段的核苷酸序列區(qū)分所述集合中的一個嵌合單鏈核酸構(gòu)建體與所述集合中的所有其它嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于滾環(huán)擴增和/或測序。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于產(chǎn)生適于測序的核酸分子的串聯(lián)線性拷貝的方法。該方法包括提供如上所述的本發(fā)明的不同環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合，并將該集合與具有鏈置換活性的聚合酶和一個或多個初級引物摻混以形成滾環(huán)延伸反應(yīng)。所述一個或多個初級引物與所述集合的一個或多個環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的部分互補。使所述滾環(huán)延伸反應(yīng)混合物經(jīng)受一種或多種雜交和延伸處理，其中一個或多個引物與環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體雜交且聚合酶延伸雜交的引物以產(chǎn)生多個延伸產(chǎn)物。每個延伸產(chǎn)物包含與來自集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體互補的兩條或更多條串聯(lián)線性序列。圖2(步驟A-C)提供了上述擴增核酸分子的方法的示例性說明。圖2的步驟A示出了集合的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體和雜交的初級引物。環(huán)狀構(gòu)建體中的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段顯示為單一細(xì)黑線。原始基因組DNA區(qū)段內(nèi)的突變用(*)表示。環(huán)狀構(gòu)建體的獨特標(biāo)識符序列和初級引物結(jié)合位點顯示為略粗線。雜交引物連續(xù)延伸以擴增環(huán)形靶是使用具有鏈置換能力的聚合酶，例如Phi29或BstDNA聚合酶或類似物(圖2中描繪為菱形)來實現(xiàn)的。如圖2步驟B中所示，雜交的引物的聚合酶延伸最終將置換初始引物，產(chǎn)生單鏈尾。使延伸產(chǎn)物從所述環(huán)變性(參見圖2，步驟C)。提供一個或多個次級引物組，其中每個引物組包含：(a)具有與從初級引物形成的單鏈延伸產(chǎn)物的第一部分互補的核苷酸序列的第一次級未甲基化引物，以及(b)具有與所述單鏈延伸產(chǎn)物的第二部分互補的核苷酸序列的第二次級甲基化引物。單鏈延伸產(chǎn)物與次級引物組、缺乏鏈置換活性的聚合酶、連接酶和在彼此雜交時裂解單鏈延伸產(chǎn)物和第一次級引物的核酸內(nèi)切酶(即，核酸內(nèi)切酶裂解未甲基化的雙鏈識別序列)摻混。如圖2的步驟C中所示，第一和第二次級引物雜交至單鏈延伸產(chǎn)物的互補區(qū)域。聚合酶延伸雜交的引物，以形成具有與下游的雜交次級引物的連接結(jié)。如圖2的步驟C中所示，連接酶將延伸的次級引物連接在一起以形成雙鏈延伸產(chǎn)物。核酸內(nèi)切酶在延伸產(chǎn)物和第一次級引物雜交處裂解這兩者，以形成包含靶基因組DNA序列的串聯(lián)線性拷貝的雙鏈片段。雙鏈延伸產(chǎn)物片段中的串聯(lián)線性序列的數(shù)量反映了在上述方法中使用的第一和第二次級引物的比率。這些串聯(lián)拷貝片段適于使用如上所述的本領(lǐng)域中已知的任何測序方法測序。對于NGS測序，附接接頭以允許標(biāo)準(zhǔn)簇擴增或珠粒擴增和成對末端讀序。真突變(*)將出現(xiàn)2次或3次，因此與聚合酶錯誤區(qū)分開來。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于產(chǎn)生核酸分子的串聯(lián)線性拷貝的方法，如果靶標(biāo)在原始基因組DNA中是甲基化的(甲基化堿基被描繪成“m”，參見圖3)。過程基本上與上文所述相同，將Bst聚合酶用于在BstUl(CG^CG)限制性核酸內(nèi)切酶的存在下連續(xù)延伸雜交的初級引物(圖3，步驟B)。BstUl將裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解雜交的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA(圖3，步驟B)。(參見Zierhut和Diffley，“BreakDosage，CellCycleStageandDNAReplicationInfluenceDNADoubleStrandBreakResponse，”EMBOJ.27(13)：1875-85(2008)，其在此通過引用整體并入。)由于聚合酶在滾環(huán)擴增期間產(chǎn)生鈀的若干拷貝，且由于未甲基化CGCG位點在雙鏈形式時被BstU1裂解，所以這個過程特異性地選擇原始靶DNA中所有位點BstU1被甲基化的片段。雖然圖3說明了利用BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的該方法，但可以利用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解雜交的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA的其它核酸內(nèi)切酶來選擇性擴增甲基化基因組DNA。這些核酸內(nèi)切酶包括但不限于嗜熱酶BstHHI(識別GCGC；HhaI的同裂酶)、BsiSI(識別CCGG；HpaII的同裂酶)和TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。所有這些酶都對內(nèi)部CpG序列的甲基化敏感。該系列中的最后一種酶(TaqI限制酶)對CpG位點處的甲基化不敏感，所以不適用于上述技術(shù)。在本發(fā)明的另一個方面，所述集合的每個環(huán)狀核酸構(gòu)建體包含連接至第二單鏈合成核酸區(qū)段的來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段，其中所述第二單鏈區(qū)段包含一個或多個引物特異性序列(例如，第一和/或第二固體載體引物特異性部分)以及任選的患者標(biāo)識符序列。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，第二單鏈區(qū)段可以包含或不包含獨特標(biāo)識符部分。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于如本文所述的滾環(huán)擴增和/或測序。第二單鏈區(qū)段的患者標(biāo)識符序列用于識別原始基因組DNA的患者來源?；颊邩?biāo)識符序列通常包含約5至8個核苷酸的長度，并且被設(shè)計成區(qū)分來自不同患者的序列。在優(yōu)選的實施方案中，患者標(biāo)識符序列彼此在至少3個位置上有所不同，從而使得在測序中的單個堿基錯誤仍允許正確的患者標(biāo)識符序列的陽性識別。在當(dāng)前臨床實驗室實踐中，樣品的批處理通常被設(shè)計成與96和384孔板格式兼容，使得8、16、24、48、96或384個樣本同時被處理。本發(fā)明的另一方面涉及包含不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合的系統(tǒng)。所述集合的每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈核酸區(qū)段。所述第二單鏈核酸區(qū)段的核苷酸序列包含第一固體載體引物特異性部分、第二固體載體引物特異性部分和患者標(biāo)識符序列。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體是環(huán)化的且適于滾環(huán)擴增和/或測序。所述系統(tǒng)進一步包括延伸產(chǎn)物的集合，每個延伸產(chǎn)物包含與來自所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體互補的兩條或更多條串聯(lián)線性序列。所述集合中的每個延伸產(chǎn)物與所述集合的其互補環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體雜交。圖4在步驟B提供了本發(fā)明的該系統(tǒng)的示例性描繪。本發(fā)明的該系統(tǒng)可以進一步包含具有多個固定的第一寡核苷酸引物的固體載體。所述固體載體上的每個第一寡核苷酸引物具有與集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分的核苷酸序列相同并且與延伸產(chǎn)物的第一固體載體引物特異性部分互補的核苷酸序列。因此，所述固體載體上的一個或多個第一寡核苷酸引物可以經(jīng)由第一固體載體引物特異性部分雜交至延伸產(chǎn)物的集合的延伸產(chǎn)物。圖4的步驟C提供了本發(fā)明的該系統(tǒng)的示例性描繪。所述固體載體可以由各種各樣的材料制成?；目梢允巧锏?、非生物的、有機的、無機的或這些中任何的組合，并作為顆粒、鏈狀物、沉淀物、凝膠、片、管、球、珠、容器、毛細(xì)管、墊、薄片、薄膜、板、載片、圓盤、膜等存在。所述基材可以具有任何方便的形狀，如圓盤、正方形、圓形等。所述基材優(yōu)選是平坦的，但可以采用多種替代的表面構(gòu)造。例如，所述基材可以含有雜交發(fā)生在其上的凸起或凹陷區(qū)域。所述基材和其表面優(yōu)選形成在其上進行本文中所描述的測序反應(yīng)的剛性載體。在本發(fā)明的系統(tǒng)和方法中可以利用用于模板制備的市售的下一代測序固體載體平臺。例如，在本發(fā)明的系統(tǒng)和方法中可以使用FlowCell、LifeIonSphereTM和乳液PCR珠粒和454乳液PCR珠粒。因此，所述環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分被設(shè)計成與固定在市售NGS固體載體上的引物相同。因此，包含第一固體載體引物特異性部分的補體的延伸產(chǎn)物能夠與NGS固體載體表面上的引物雜交。本發(fā)明的該系統(tǒng)可以進一步包含如圖5步驟A中所示的交聯(lián)寡核苷酸的集合。交聯(lián)寡核苷酸是具有核苷酸序列的兩個或更多個重復(fù)的寡核苷酸，其中重復(fù)的核苷酸序列具有與集合中的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第二單鏈核酸區(qū)段的至少一部分相同的序列。因此，交聯(lián)寡核苷酸的重復(fù)核苷酸序列與嵌合核酸構(gòu)建體的延伸產(chǎn)物的核苷酸序列的至少一部分(即，延伸產(chǎn)物的對應(yīng)于第二單鏈區(qū)段的部分)互補。重復(fù)核苷酸序列可以具有約10至25個核苷酸的長度。如圖5的步驟B-D中所描繪，每個交聯(lián)寡核苷酸的核苷酸序列重復(fù)中的一個或多個與延伸產(chǎn)物的集合的延伸產(chǎn)物的串聯(lián)線性序列雜交，形成縮合結(jié)構(gòu)。如圖5的步驟E-H中所示，可以將結(jié)合至一個或多個交聯(lián)寡核苷酸的縮合延伸產(chǎn)物捕獲在具有多個固定的第一寡核苷酸引物的固體載體上。如上所述，固體載體上的第一寡核苷酸引物具有與延伸產(chǎn)物的第一固體載體引物特異性部分互補的核苷酸序列(即，與嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分的核苷酸序列相同的核苷酸序列)。如圖5的步驟E中所示，縮合延伸產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的一條或多條串聯(lián)線性序列可以與固體載體上的一個或多個第一寡核苷酸引物雜交，從而固定所述縮合結(jié)構(gòu)。所述交聯(lián)寡核苷酸可以被設(shè)計成含有被酶裂解的可裂解連接(在圖5步驟E和F中描繪為三角形)。合適的可裂解連接包括但不限于核糖核苷酸、脫氧尿嘧啶、無嘌呤位點和8-氧代鳥嘌呤。例如，交聯(lián)寡核苷酸可以含有由APE1核酸內(nèi)切酶、EndoIII、EndoIV、EndoVIII、Fpg或hOGG1裂解的無嘌呤位點。交聯(lián)寡核苷酸的裂解允許縮合結(jié)構(gòu)瓦解且延伸產(chǎn)物的個別串聯(lián)序列通過雜交至固體載體表面上的相鄰引物被局部捕獲，從而產(chǎn)生地毯樣結(jié)構(gòu)(圖5，步驟F)。如圖5的步驟G中所示，這種方法確保了原始靶基因組DNA序列的數(shù)百至數(shù)千個串聯(lián)互補拷貝被彼此相鄰地捕獲，并適用于后續(xù)測序。本發(fā)明的另一方面涉及包含不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的集合的系統(tǒng)。每個構(gòu)建體包含來自宿主生物體的原始基因組DNA的第一單鏈區(qū)段和連接至第一單鏈區(qū)段且包含對宿主生物體而言為外源性的核苷酸序列的第二單鏈核酸區(qū)段。所述第二單鏈核酸區(qū)段的核苷酸序列包含第一固體載體引物特異性部分、第二固體載體引物特異性部分和患者標(biāo)識符序列。所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體適于滾環(huán)擴增和/或測序。所述系統(tǒng)進一步包含：一個或多個寡核苷酸擴增引物，每個引物包含至少第一核苷酸序列部分，其與所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分或第二固體載體引物特異性部分互補。最后，該系統(tǒng)還具有適用于滾環(huán)擴增的聚合酶。本發(fā)明的該系統(tǒng)的示例性描繪示于圖4步驟A中。所述環(huán)狀嵌合核酸構(gòu)建體含有原始基因組DNA區(qū)段(細(xì)黑線)，該原始DNA區(qū)段內(nèi)的目標(biāo)單堿基替代或突變由星號(*)表示。所述構(gòu)建體的第二單鏈區(qū)段包含嵌合構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分(描繪為粗黑線)和第二固體載體引物特異性部分(描繪為雙黑線)。適用于引發(fā)所述嵌合構(gòu)建體的滾環(huán)擴增的擴增引物可以與所述構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分的區(qū)段互補(如圖4步驟A的左圖中所示)；與所述嵌合構(gòu)建體的第一和第二固體載體引物特異性部分的區(qū)段互補(如圖4步驟A的中間圖和右圖中所示)；或與所述構(gòu)建體的第二固體載體引物特異性部分的部分互補(如圖9步驟A中所示)。在后一種實施方案中，與所述嵌合構(gòu)建體的第二固體載體引物特異性部分互補的擴增引物被固定在固體載體上，從而將在滾環(huán)擴增期間形成的延伸產(chǎn)物直接栓系到所述固體載體上。在一個替代性實施方案中，擴增引物可以包含能夠如圖4步驟D和圖10步驟A中所示被栓系到固體載體上的其它部分。在一個實施方案中，所述其它部分包含與固定在固體載體上的捕獲寡核苷酸的核苷酸序列互補的獨特核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述其它部分包含與固定在固體載體上的第一或第二固體寡核苷酸引物互補的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述其它部分是被固定在固體載體上的捕獲結(jié)合伴侶捕獲的捕獲部分。所述捕獲部分和捕獲結(jié)合伴侶本質(zhì)上不必是核酸。例如，所述捕獲部分可以是生物素基團或His-Tag，它們將分別被固定的鏈霉親和素或NTA基質(zhì)捕獲。在另一個實施方案中，所述一個或多個寡核苷酸擴增引物包含：(i)與所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的原始基因組DNA區(qū)段互補的第一核苷酸序列；(ii)3′部分，其包含可裂解核苷酸或核苷酸類似物和阻斷所述寡核苷酸擴增引物的3′聚合酶延伸的阻斷基團；和(iii)包含可裂解核苷酸或核苷酸類似物和捕獲基團的5′部分，其中所述捕獲基團能夠被固定到固體載體上。在另一個實施方案中，所述一個或多個寡核苷酸擴增引物包含：(a)第一寡核苷酸擴增引物，其具有(i)與所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的原始基因組DNA區(qū)段的第一部分互補的第一核苷酸序列；和(ii)3′部分，其包含可裂解核苷酸或核苷酸類似物和阻斷所述第一寡核苷酸擴增引物的3′聚合酶延伸的阻斷基團；及(b)第二寡核苷酸擴增引物，其具有(i)與所述集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的原始基因組DNA區(qū)段的第二部分互補的第一核苷酸序列；和(ii)包含可裂解核苷酸或核苷酸類似物和捕獲基團的5′部分，其中所述捕獲基團能夠被固定到固體載體上。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，所述系統(tǒng)可以進一步包含具有多個固定的第一寡核苷酸引物的固體載體。所述固體載體上的第一寡核苷酸引物具有與集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分的核苷酸序列相同的核苷酸序列(參見例如，圖6，步驟B)。該系統(tǒng)的固體載體可以進一步包含多個固定的第二寡核苷酸引物，其具有與集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第二固體載體引物特異性部分的核苷酸序列互補的核苷酸序列(參見例如，圖5，步驟B)。如上所述，用于模板制備的市售NGS固體載體平臺(例如，F(xiàn)lowCell、LifeTechnologies等)適用于本發(fā)明的系統(tǒng)。本發(fā)明的該系統(tǒng)還可以包含如上所述的交聯(lián)寡核苷酸(即，具有核苷酸序列的兩個或更多個重復(fù)的寡核苷酸，其中重復(fù)的核苷酸序列具有與集合中的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第二單鏈核酸區(qū)段的至少一部分相同的序列)的集合。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，該系統(tǒng)的聚合酶是適用于滾環(huán)擴增的鏈置換聚合酶。示例性鏈置換聚合酶包括但不限于：phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶(大片段或5′→3′外切)、BsuDNA聚合酶(大片段或5′→3′外切)、Deep(外切)聚合酶、克列諾片段(3′→5′外切)、DNA聚合酶I(5′→3′外切)、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、(外切)DNA聚合酶和PyroPhage3173DNA聚合酶。其它示例性鏈置換聚合酶包括那些具有熱穩(wěn)定性和鏈置換活性的聚合酶，如SDDNA聚合酶(突變TaqDNA聚合酶)(參見Fu的美國專利申請公開第2012/0115145號、Ignatov等人的WO2014/161712和Ignatov等人，“AStrongStandDisplacementActivityofThermostableDNAPolymeraseMarkedlyImprovestheResultsofDNAAmplification，”BioTechniques57：81087(2014)，其在此通過引用整體并入)；AptaHotTaq聚合酶(具有5′側(cè)翼核酸內(nèi)切酶活性的熱穩(wěn)定性5′→3′聚合酶)；衍生自嗜熱病毒和微生物的聚合酶(參見Schoenfeld等人的美國專利申請公開2012/0083018，以及Schoenfeld等人的美國專利第8,093,030號，其在此通過引用整體并入；衍生自Thermusantranikianii和Thermusbrockianus的聚合酶(如Hjorleifsdottir等人的WO2006/030455以及Hjorleifsdottir等人的美國專利申請公開第2008/0311626號中所公開，所述文獻在此通過引用整體并入)；衍生自水管致黑棲熱菌(Thermusscotoductus)的熱穩(wěn)定性聚合酶(參見Rech等人的WO2007/076461，其在此通過引用整體并入)；以及衍生自蒼白茅孢桿菌(Bacilluspallidus)的I型DNA聚合酶(參見Hamilton的美國專利第5,736,373號，其在此通過引用整體并入)。本領(lǐng)域中已知的其它鏈置換聚合酶也適用于本系統(tǒng)和本發(fā)明的相關(guān)方法。本發(fā)明的另一個方面涉及一種使用該系統(tǒng)對多個核酸分子測序的方法。根據(jù)該方法，將雜交至集合的互補環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的寡核苷酸擴增引物與聚合酶摻混，以形成滾環(huán)擴增反應(yīng)混合物。所述滾環(huán)擴增反應(yīng)混合物經(jīng)受延伸處理，其中聚合酶延伸一個或多個雜交的寡核苷酸擴增引物以產(chǎn)生多個初級延伸產(chǎn)物。每個初級延伸產(chǎn)物包含一條或多條串聯(lián)線性序列，每個串聯(lián)線性序列與集合中的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體互補。可以對環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體直接測序，例如，環(huán)狀嵌合構(gòu)建體是用于合成測序的模板?；蛘撸蓾L環(huán)擴增反應(yīng)形成的初級延伸產(chǎn)物是用于測序的模板。如上所述，可以利用本領(lǐng)域中已知的任何測序方法對環(huán)狀核酸構(gòu)建體或初級延伸產(chǎn)物測序。在一個實施方案中，初級延伸產(chǎn)物在測序前被固定在固體載體上。合適的固體載體包含至少多個第一寡核苷酸引物，每個第一寡核苷酸引物具有與集合的嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第一固體載體引物特異性部分的核苷酸序列相同的核苷酸序列(即，具有與初級延伸產(chǎn)物的第一固體載體引物特異性部分互補的序列)。合適的固體載體包括但不限于那些市售的并且在下一代測序平臺中用于模板制備的固體載體，例如flowcell，LifeTechnologiesTMIonSphereTM。初級延伸產(chǎn)物與固體載體上的第一寡核苷酸引物雜交并且如下文更詳細(xì)所述在載體上測序。所述固體載體可以進一步包括多個第二寡核苷酸引物。第二引物具有與嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的第二固體載體引物特異性引物部分互補的核苷酸序列。如圖9步驟B中所描繪和本文中更詳細(xì)地描述，嵌合核酸構(gòu)建體的滾環(huán)擴增可以由固體載體上的第二寡核苷酸引物引發(fā)。該方法可以用于將初級延伸產(chǎn)物直接栓系到固體載體上。如圖5的步驟A-G中所描繪，交聯(lián)寡核苷酸可以用于縮合從滾環(huán)擴增反應(yīng)所形成的生長的初級延伸產(chǎn)物。如圖5的步驟A中所示，DNA聚合酶(實心菱形)圍繞包含原始基因組區(qū)段的環(huán)狀構(gòu)建體延伸擴增引物。隨著聚合酶繼續(xù)延伸，生長的初級延伸產(chǎn)物通過雜交至交聯(lián)寡核苷酸的互補重復(fù)區(qū)域而縮合(如圖5的步驟B中所示)。該過程如圖5的步驟C和D中所示繼續(xù)進行，產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個靶DNA的串聯(lián)互補拷貝的縮合結(jié)構(gòu)。通過改變具有不同互補序列的寡核苷酸的數(shù)目以及在給定寡核苷酸內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目，圓環(huán)或“交聯(lián)結(jié)”的數(shù)目可以變化，從而提供了控制所述結(jié)構(gòu)的“緊湊度”的機會。如圖5的步驟E中所示，縮合的初級延伸產(chǎn)物可以經(jīng)由初級延伸產(chǎn)物與互補的第一寡核苷酸引物的雜交固定在固體載體上。如圖5的步驟E中所示，縮合結(jié)構(gòu)在一些位置上與互補的引物雜交。交聯(lián)寡核苷酸包含可裂解連接，并且在裂解后，縮合結(jié)構(gòu)開始瓦解(圖5，步驟F)。初級延伸產(chǎn)物的個別環(huán)通過雜交至固體載體表面上的相鄰第一引物被局部捕獲，從而產(chǎn)生地毯樣結(jié)構(gòu)(圖5，步驟G)。這種方法確保了靶標(biāo)的數(shù)百至數(shù)千個串聯(lián)拷貝被彼此相鄰地捕獲，并適用于后續(xù)測序。圖6描繪了根據(jù)本發(fā)明的示例性測序方法。如圖6的步驟A中所示，過程開始于DNA聚合酶(例如，Phi29聚合酶；實心菱形)延伸與環(huán)狀嵌合核酸構(gòu)建體模板雜交的擴增引物以產(chǎn)生初級延伸產(chǎn)物。延伸產(chǎn)物與固體載體上的第一寡核苷酸引物雜交(圖6，步驟B)。如圖6的步驟C中所示，從滾環(huán)擴增反應(yīng)形成的生長的延伸產(chǎn)物通過與表面上的相鄰的第一寡核苷酸引物雜交被局部捕獲在固體載體上，從而產(chǎn)生地毯樣結(jié)構(gòu)。如圖6的步驟D中所示，這種方法確保了原始基因組DNA區(qū)段的數(shù)百至數(shù)千個串聯(lián)互補拷貝被彼此相鄰地捕獲以用于后續(xù)測序。一旦初級延伸產(chǎn)物被固定在固體載體上(圖6，步驟D)，靠近固體載體上的第一寡核苷酸引物的3′端雜交測序引物(如圖6的步驟E中所示)。任選地，PNA或阻斷寡核苷酸可以靠近第一寡核苷酸引物的5′端雜交(同樣如圖6的步驟E中所描繪)。初級延伸產(chǎn)物是用于由測序引物引發(fā)的合成測序反應(yīng)的模板(如圖6的步驟F中所描繪)。測序一直持續(xù)到所形成的次級合成測序延伸產(chǎn)物由于PNA或阻斷寡核苷酸而無法進一步延伸(圖6，步驟G)。為了對相反鏈測序(即，為了獲得初級延伸產(chǎn)物的序列)，固體載體上的第一寡核苷酸引物沒有被阻斷。具有5′-3′核酸酶活性的聚合酶(實心菱形)在固體載體上延伸栓系測序引物，同時消化通過合成反應(yīng)測序所得產(chǎn)物，如圖6，步驟H中所示。如圖6，步驟I中所示，聚合酶(實心菱形)延伸鏈，直到其由于PNA或阻斷寡核苷酸(寬條紋線)而無法繼續(xù)。這會生成模板的單長度拷貝，每個模板包含原始基因組DNA序列的拷貝。如圖6的步驟J中所示，使原始初級延伸產(chǎn)物和環(huán)狀模板變性和洗掉。使第二測序引物與每個單長度模板鏈雜交(如圖6的步驟K中所示)，且使用合成測序獲得固定化模板的序列(如圖6的步驟L和M中所示)。圖7描繪了根據(jù)本發(fā)明的另一種示例性測序方法。該方法包括環(huán)狀嵌合核酸構(gòu)建體的滾環(huán)擴增以及將初級延伸產(chǎn)物捕獲在具有第一和第二寡核苷酸引物的固體載體上。如圖7的步驟A中所示，鏈置換DNA聚合酶(實心菱形)在環(huán)化模板上延伸擴增引物，以產(chǎn)生單鏈初級延伸產(chǎn)物。固體載體表面上的第一寡核苷酸引物含有位于其3′端的可移除阻斷基團，這使得它們在滾環(huán)擴增過程中無法延伸(圖7，步驟B)。阻斷基團是防止聚合酶或其它酶擴增、延伸寡核苷酸或以生產(chǎn)性方式與寡核苷酸反應(yīng)的化學(xué)部分。在這個實例中，所述阻斷基團防止3′端的聚合酶延伸。合適的阻斷基團包括但不限于C3-間隔基、C18-間隔基、終止子核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸衍生物、3′磷酸、或3′或2′OH部分的其它修飾。阻斷基團本身可以是可裂解的，諸如通過使用可逆終止子核苷酸，或3′磷酸，或阻斷基團和任選一些額外的核苷酸可以通過在可裂解連接處裂解(然后釋放游離的3′OH端)去除。合適的可裂解連接包括但不限于核糖核苷酸、脫氧尿嘧啶、無嘌呤位點和8-氧代鳥嘌呤。如圖7的步驟C中所示，當(dāng)滾環(huán)擴增繼續(xù)進行而產(chǎn)生生長的初級延伸產(chǎn)物時，該產(chǎn)物通過與固體載體表面上的相鄰的第一寡核苷酸引物雜交被局部摘獲，從而產(chǎn)生地毯樣結(jié)構(gòu)。這種方法確保了靶標(biāo)的數(shù)百至數(shù)千個串聯(lián)拷貝被彼此相鄰地捕獲在固體載體表面上(圖7，步驟D)。如圖7的步驟E中所示，將阻斷基團從固體載體上的雜交至初級延伸產(chǎn)物的第一寡核苷酸引物中移除。阻斷基團可以通過裂解可裂解連接來移除。核糖核苷酸可裂解連接可以用RNA酶H裂解；脫氧尿嘧啶可裂解連接可以用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解，或使用UDG、EndoVIII和T4激酶裂解；無嘌呤位點可裂解連接可以用TthEndoIV、EndoIV或AP核酸內(nèi)切酶裂解；且8-氧代鳥嘌呤可裂解連接可以用Fgp裂解。一旦引物未被阻斷，它就會延伸，從而利用缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶(實心菱形)在固體載體上的數(shù)百至數(shù)千個位置拷貝初級延伸產(chǎn)物(圖7，步驟F)。這產(chǎn)生環(huán)化模板的單長度次級延伸產(chǎn)物。如圖7的步驟G中所示，使初級延伸產(chǎn)物和環(huán)狀模板變性并洗掉，以使得所述模板的所得的次級延伸產(chǎn)物適用于如圖8的步驟A-I中所描繪的后續(xù)測序。圖8說明了捕獲在具有第一和第二寡核苷酸引物的固體載體上的滾環(huán)擴增靶標(biāo)(例如，次級延伸產(chǎn)物)的測序。圖8步驟A顯示如圖7中所描述從雜交的初級延伸產(chǎn)物的聚合酶介導(dǎo)的延伸產(chǎn)生的單長度次級延伸產(chǎn)物。測序過程開始于將測序引物雜交至次級延伸產(chǎn)物(如圖8步驟A中所示)。使用合成測序來獲得固定的次級延伸產(chǎn)物的序列(圖8，步驟B)。測序一直持續(xù)到延伸產(chǎn)物到達栓系的第一寡核苷酸引物的末端(圖8，步驟C)。合成測序產(chǎn)物從拴系的次級延伸產(chǎn)物變性且單鏈次級延伸產(chǎn)物雜交至固體載體上的第二寡核苷酸引物(如圖8的步驟D中所示)。通過延伸雜交的第二寡核苷酸引物以產(chǎn)生次級延伸產(chǎn)物的全長拷貝(即，三級延伸產(chǎn)物)來拷貝次級延伸產(chǎn)物(圖8，步驟E)。次級延伸產(chǎn)物被裂解、變性并洗掉(圖8，步驟E-F)，留下適用于后續(xù)測序的栓系的三級延伸產(chǎn)物。使測序引物與三級延伸產(chǎn)物雜交(圖8，步驟G)，并進行合成測序以獲得三級產(chǎn)物的序列(如圖8的步驟H和I中所示)?？梢允褂萌绫疚乃枋龊兔枥L的合成測序來實現(xiàn)次級和三級延伸產(chǎn)物的測序。合成測序包括基于熒光的邊合成邊測序和基于離子的邊合成邊測序。還可以采用其它合適的測序方法，包括例如但不限于：熒光引物雜交、分子信標(biāo)雜交、引物延伸、基于核酸外切酶的測序、連接酶檢測反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、焦磷酸測序、基于熒光的邊連接邊測序、基于納米孔和納米管的測序以及基于離子的邊連接邊測序。圖9描繪了根據(jù)本發(fā)明的另一種示例性測序方法。如圖9的步驟A中所示，該實施方案包括將嵌合環(huán)狀核酸構(gòu)建體與固體載體上的未阻斷的第二寡核苷酸引物直接雜交。第二引物用作擴增引物，以引發(fā)環(huán)狀構(gòu)建體的滾環(huán)擴增。所生成的初級延伸產(chǎn)物被直接栓系到固體載體上(圖9，步驟A)。通過滾環(huán)擴增產(chǎn)生的初級延伸產(chǎn)物雜交至固體載體上的含有可移除的3′阻斷基團的第一寡核苷酸引物(如圖9的步驟B和C中所示)，從而產(chǎn)生多個“地毯環(huán)”結(jié)構(gòu)。去除第一引物的3′阻斷基團(圖9，步驟D)，以允許第一引物被合適的聚合酶(例如，缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶)延伸，從而產(chǎn)生由數(shù)百至數(shù)千個共價連接至固體載體表面上的單長度次級延伸產(chǎn)物構(gòu)成的表面(圖9，步驟E)。如圖9的步驟E-F中所示，用裂解第一引物的位點特異性裂解試劑或酶處理表面且隨后進行變性步驟會釋放初級延伸產(chǎn)物，留下共價連接的次級延伸產(chǎn)物，所述次級延伸產(chǎn)物適用于如圖8的步驟A-I中所示和所述的后續(xù)測序。圖10描繪了根據(jù)本發(fā)明的另一種示例性測序方法。在這個實施方案中，擴增引物包含短單鏈尾，即，被捕獲在固體載體上的其它部分。如圖10的步驟A中所描繪，所述其它部分可以包含與固體載體表面上的捕獲探針或引物的核苷酸序列互補的核苷酸序列。所述其它部分和其互補的摘獲探針或引物的雜交直接將通過滾環(huán)擴增形成的初級延伸產(chǎn)物栓系到固體載體上。當(dāng)滾環(huán)擴增繼續(xù)進行而產(chǎn)生包含嵌合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的串聯(lián)互補拷貝的生長的初級延伸產(chǎn)物時，該初級延伸產(chǎn)物通過與表面上的3′阻斷型第一寡核苷酸引物雜交被局部捕獲，從而在表面上形成多個地毯環(huán)結(jié)構(gòu)(圖10，步驟B和C)。解除對第一引物的阻斷(圖10，步驟D)，并利用缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶使其延伸，以形成具有均勻長度的多個次級延伸產(chǎn)物(圖10，步驟E)。變性會釋放初級延伸產(chǎn)物，并留下與原始環(huán)化模板具有相同含義且全部在其3′端具有限定的測序引物結(jié)合序列的共價連接的次級延伸產(chǎn)物。共價連接的次級延伸產(chǎn)物是用于如圖8中所示的測序的合適模板。圖11說明了根據(jù)本發(fā)明的另一種示例性測序方法。在圖11的步驟A中，Phi29DNA聚合酶(實心菱形)在嵌合環(huán)模板上延伸擴增引物，以產(chǎn)生短單鏈初級延伸產(chǎn)物。使聚合酶和初級延伸產(chǎn)物從環(huán)狀模板變性。如圖11的步驟B中所示，初級延伸產(chǎn)物與固體載體上的第一引物雜交。通過固定的第一寡核苷酸引物在多個位置的聚合酶延伸(實心菱形)拷貝初級延伸產(chǎn)物。合適的聚合酶包括如上所述的缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶。這產(chǎn)生單長度次級延伸產(chǎn)物(圖11，步驟C)。使初級延伸產(chǎn)物變性并洗掉(如圖11的步驟D中所示)。使用簇擴增方法擴增留下的單鏈次級延伸產(chǎn)物，其中次級延伸產(chǎn)物與固體載體上的第二寡核苷酸引物雜交(如圖11的步驟E中所示)。利用聚合酶延伸第二引物(圖11，步驟F)，以形成三級延伸產(chǎn)物。變性(圖11，步驟G)之后，次級和三級延伸產(chǎn)物與固體載體上的互補的第一和第二引物雜交(圖11，步驟H)。如圖11I中所示，雜交的引物經(jīng)過聚合酶延伸形成次級和三級延伸產(chǎn)物的拷貝。使延伸產(chǎn)物變性，并重復(fù)所述過程以產(chǎn)生足夠用于使用圖8中所描繪的方法對每條鏈測序的模板(圖11，步驟J)。形成具有有限(短)RCA擴增的共價附接的相同拷貝的替代性方式包括Sequoia擴增(Barany等人的WO2013/012440，該文獻以引用的方式整體并入本文中)和wildfire擴增(Ma等人，“IsothermalAmplificationMethodforNext-GenerationSequencing，”.ProcNatlAcadSciUSA10(35)：14320-3(2013)，該文獻以引用的方式整體并入本文中)。圖12說明了根據(jù)本發(fā)明的另一種示例性測序方法，其類似于圖11中所呈現(xiàn)的方法。在圖12的步驟A中，Phi29或BstDNA聚合酶(實心菱形)在嵌合環(huán)模板上延伸擴增引物，以產(chǎn)生長單鏈初級延伸產(chǎn)物。使聚合酶和初級延伸產(chǎn)物從環(huán)狀模板變性。如圖12的步驟B中所示，初級延伸產(chǎn)物與固體載體上的多于一個孔或區(qū)域內(nèi)的多個第一引物雜交。由于初級延伸產(chǎn)物是長的，所以它可以延伸進入具有引物的固體表面的多個孔或離散區(qū)域中。長延伸產(chǎn)物的這種性質(zhì)的優(yōu)點在于：相同的靶標(biāo)將在多個相鄰的孔或區(qū)域中測序，從而提供低豐度突變的額外驗證。如圖12的步驟C中所示，通過固定的第一寡核苷酸引物在多個位置的聚合酶延伸(實心菱形)拷貝初級延伸產(chǎn)物。合適的聚合酶包括如上所述的缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶。這產(chǎn)生單長度次級延伸產(chǎn)物，除了當(dāng)在生成串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物的孔之間橋接時以外(圖12，步驟C和D)。使初級延伸產(chǎn)物變性并洗掉(如圖12的步驟E中所示)。使用簇擴增方法擴增留下的單鏈次級延伸產(chǎn)物，其中次級延伸產(chǎn)物與固體載體上的第二寡核苷酸引物雜交(如圖11的步驟E-I中所示)。使延伸產(chǎn)物變性，并重復(fù)所述過程以產(chǎn)生足夠用于使用圖8中所描繪的方法對每條鏈測序的模板(參見圖11，步驟J)。本發(fā)明的另一方面涉及制備是本文所述的系統(tǒng)和方法的組成部分的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的方法。下文描述了一些示例性方法并且在附圖中描繪了這些方法。用于制備環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的一種合適的方法包括提供含有一個或多個靶基因組DNA區(qū)段的樣品。所述靶基因組DNA區(qū)段可以潛在地含有對于檢測來說受關(guān)注的一個或多個堿基差異或一個或多個甲基化殘基。所述方法進一步包括提供一個或多個第一寡核苷酸探針，每個第一寡核苷酸探針包含：(a)5′靶標(biāo)特異性部分；(b)3′靶標(biāo)特異性部分；和(c)其它部分。所述其它部分是核苷酸序列，其包含：(i)患者標(biāo)識符序列；(ii)第一固體載體引物特異性部分；和(iii)第二固體載體引物特異性部分。在有效地使第一寡核苷酸探針的3′靶標(biāo)特異性部分以堿基特異性方式與靶基因組DNA區(qū)段的互補3′端雜交以及使第一寡核苷酸探針的5′靶標(biāo)特異性部分以堿基特異性方式與靶基因組DNA區(qū)段(如果存在于樣品中)的互補5′端雜交的條件下，使樣品和一個或多個第一寡核苷酸探針接觸。雜交后，產(chǎn)生適于連接雜交至第一寡核苷酸探針的靶基因組DNA區(qū)段的3′和5′端的一個或多個可連接結(jié)，且靶基因組DNA片段在所述一個或多個連接結(jié)處連接在一起以形成集合的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。圖13，步驟A-E示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸“靶”構(gòu)建體的示例性方法。在此實施方案中，原始基因組區(qū)段包含平均長度為160bp的無細(xì)胞DNA(cfDNA)的區(qū)段，或剪切至約160bp片段的基因組DNA的區(qū)段(“靶寡核苷酸”或“DNA區(qū)段”)。所述過程開始于將短接頭連接至DNA區(qū)段(粗黑條，圖13，步驟A)。如圖13的步驟B中所示，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′端互補并與3′接頭互補的序列的寡核苷酸探針雜交至DNA區(qū)段。鄰近圖13步驟B中的靶DNA寡核苷酸的3′端的成環(huán)區(qū)域是靶寡核苷酸的不與寡核苷酸探針互補的區(qū)域。如該圖中所示，靶寡核苷酸區(qū)段和寡核苷酸探針之間的非互補的小區(qū)域不影響形成嵌合環(huán)狀構(gòu)建體的過程。寡核苷酸探針的其它部分(顯示為粗黑條)還可以含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列和/或可裂解連接(圖13，步驟B，左圖，描繪在粗條內(nèi)的可裂解連接被標(biāo)記為“U”)。所述寡核苷酸探針還可以在一端含有阻斷基團(圖13，步驟B，右圖；探針具有5′阻斷基團)。如圖13的步驟C中所示，聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。在此實施方案中使用的聚合酶可以包含核酸外切酶活性，例如，5′至3′核酸外切酶活性或3′至5′核酸外切酶活性。在延伸后，5′-核酸酶在靶DNA的匹配的5′-重疊堿基處裂解移除5′接頭區(qū)域，從而留下可連接的5′-磷酸根。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針的3′端(圖13，步驟C)，但不裂解阻斷基團(圖13，步驟C，左側(cè))。在圖13的步驟D(左圖)中，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間以及延伸的寡核苷酸探針的3′端和5′端之間的連接結(jié)，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。在環(huán)化寡核苷酸探針的可裂解連接(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)處引入缺口，以使得寡核苷酸探針易發(fā)生核酸外切酶消化(圖13，步驟E，左圖)。如圖13的步驟D(右圖)中所示，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間的連接結(jié)；然而，寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖13的步驟E中所示，核酸外切酶消化所有未連接的或有缺口的寡核苷酸產(chǎn)物(即，寡核苷酸探針)，只留下連接至含有例如獨特標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列或患者標(biāo)識符序列的其它部分的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。如上所述，所得環(huán)化產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。圖14步驟A-E中所描繪的過程與圖13步驟A-E中所示的過程基本上相同；然而，寡核苷酸探針包含在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(“r”)、引物結(jié)合序列和任選的5′捕獲基團(“Z”)(參見圖14，步驟B)。聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。DNA區(qū)段的5′端在重疊匹配堿基處的核酸酶裂解產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根(圖14，步驟C)。在圖14的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封延伸的末端以形成環(huán)狀靶連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針的3′阻斷基團防止寡核苷酸探針的延伸。隨后，通過在可裂解連接處的裂解，例如核糖核苷酸“r”的RNA酶(實心三角形)裂解，移除阻斷基團(圖14，步驟D)。如圖14的步驟E中所示，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的自由的3′端以啟動滾環(huán)擴增。通過滾環(huán)擴增形成的初級延伸產(chǎn)物適用于測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖15和圖17示出了如圖13中所描繪的用于產(chǎn)生適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸“靶”構(gòu)建體的類似過程。靶基因組DNA衍生自平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA。所述過程開始于將短接頭連接至DNA區(qū)段(粗黑條，圖15，步驟A和圖17，步驟A)。如圖15的步驟B和圖17的步驟B中所示，含有與DNA區(qū)段的5′和3′端互補并與DNA區(qū)段的3′接頭互補的序列的寡核苷酸探針雜交至靶DNA區(qū)段。在圖15步驟B中所描繪的實施方案中，寡核苷酸探針包含一個區(qū)域，即與靶寡核苷酸的3′端非互補的核苷酸序列部分(圖15步驟B中靠近寡核苷酸探針的3′端的環(huán)出部分)。此外，靶寡核苷酸的5′端(包括接頭)不與寡核苷酸探針互補，從而形成側(cè)翼。在圖17步驟B的實施方案中，寡核苷酸探針和靶寡核苷酸分別包含與靶寡核苷酸或探針寡核苷酸非互補的核苷酸序列部分。這些非互補區(qū)域被描繪為靠近寡核苷酸探針的3′端的成環(huán)區(qū)域和靠近靶寡核苷酸的5′端的成環(huán)區(qū)域(圖17，步驟B)。這些區(qū)域不影響形成環(huán)化核酸構(gòu)建體的整體過程。寡核苷酸探針的其它部分(顯示為粗黑條)可以含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列和/或可裂解連接(在粗條內(nèi)描繪為“U”(圖15，步驟B和圖17，步驟B，左圖)。所述寡核苷酸探針還可以在一端上含有阻斷基團(圖15，步驟B和圖17，步驟B，右圖；阻斷基團在寡核苷酸探針的5’端上)。如圖15的步驟C和圖17的步驟C中所示，聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。在此實施方案中使用的聚合酶可以包含核酸外切酶活性，例如，5′至3′核酸外切酶活性或3′至5′核酸外切酶活性。在延伸后，5′-核酸酶在靶DNA的匹配的5′-重疊堿基處裂解移除5′接頭區(qū)域，從而留下可連接的5′-磷酸根(圖15，步驟C和圖17，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針的3′端(圖15，步驟C和圖17，步驟C)。所述探針的5′上的阻斷基團(圖15，步驟C和圖17，步驟C，左側(cè))未裂解。在圖15的步驟D和圖17的步驟D(左圖)中，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間以及延伸的寡核苷酸探針的3′端和5′端之間的連接結(jié)，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。在環(huán)化寡核苷酸探針的可裂解連接(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)處引入缺口，以使得寡核苷酸探針易發(fā)生核酸外切酶消化(圖15，步驟E和圖17，步驟E，左圖)。如圖15的步驟D和圖17的步驟D(右圖)中所示，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間的連接結(jié)；然而，寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖15的步驟E和圖17的步驟E中所示，核酸外切酶消化所有未連接的或有缺口的寡核苷酸產(chǎn)物(即，寡核苷酸探針)，只留下連接至含有例如獨特標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列或患者標(biāo)識符序列的其它部分的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。如上所述，所得環(huán)化產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。圖16和圖18中所描繪的過程基本上分別與圖15和圖17中所示的過程相同；然而，寡核苷酸探針包含在其3′端上的阻斷基團(3’-Blk)、一個或多個可裂解連接、引物結(jié)合序列和任選的5′捕獲基團(“Z”)(參見圖16的步驟B和圖18的步驟B)。聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。DNA區(qū)段的5′端在重疊匹配堿基處的核酸酶裂解產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根(圖16，步驟C和圖18，步驟C)。在圖16的步驟D和圖18的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封延伸的末端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針的3′阻斷基團防止寡核苷酸探針的延伸。隨后，通過在可裂解連接處的裂解，例如核糖核苷酸“r”的RNA酶(實心三角形)裂解，移除阻斷基團。如圖16的步驟E和圖18的步驟E中所示，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的自由的3′端以啟動滾環(huán)擴增。通過滾環(huán)擴增形成的初級延伸產(chǎn)物適用于測序。可以在滾環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖19和圖21示出了用于產(chǎn)生如上參照圖13、15和17所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸“靶”構(gòu)建體的類似過程。靶基因組DNA衍生自平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA。在此實施方案中，過程開始于由末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)短核苷酸序列尾加成到靶寡核苷酸鏈的3′端上(靶寡核苷酸的3′端上的粗黑條；圖19，步驟A和圖21，步驟A)。如圖19的步驟B和圖21的步驟B中所示，含有與DNA區(qū)段的5′和3′端互補并與DNA區(qū)段的3′接頭互補的序列的寡核苷酸探針雜交至靶DNA區(qū)段。在圖19步驟B中所描繪的實施方案中，DNA寡核苷酸包含一個區(qū)域，即在其3′端上的與探針寡核苷酸非互補的核苷酸序列部分(圖19步驟B中靠近靶寡核苷酸的3′端的環(huán)出部分)。此外，靶寡核苷酸的5′端不與寡核苷酸探針互補，從而形成側(cè)翼。在圖21步驟B的實施方案中，寡核苷酸探針包含與靶寡核苷酸非互補的核苷酸序列部分。該非互補區(qū)域被描繪成鄰近寡核苷酸探針的3′端的環(huán)狀區(qū)域。在圖21步驟B中的靶寡核苷酸的5′端不與寡核苷酸探針互補，從而形成適于核酸酶裂解的側(cè)翼。靶寡核苷酸和探針寡核苷酸之間的這些非互補性區(qū)域不影響形成環(huán)化核酸構(gòu)建體的整體過程。寡核苷酸探針的其它部分(顯示為粗黑條)可以含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列和/或可裂解連接(在粗條內(nèi)標(biāo)記為“U”)(圖19，步驟B和圖21，步驟B，左圖)。所述寡核苷酸探針還可以在一端上含有阻斷基團(例如，圖19，步驟B和圖21，步驟B，右圖顯示阻斷基團在寡核苷酸探針的5’端上)。如圖19的步驟C和圖21的步驟C中所示，聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。在此實施方案中使用的聚合酶可以包含核酸外切酶活性，例如，5′至3′核酸外切酶活性或3′至5′核酸外切酶活性。在延伸后，5′-核酸酶在靶DNA的匹配的5′-重疊堿基處裂解移除5′接頭區(qū)域，從而留下可連接的5′-磷酸根。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針的3′端(圖19，步驟C和圖21，步驟C)。所述探針的5′上的阻斷基團(圖19，步驟C和圖21，步驟C，右側(cè))未裂解。在圖19的步驟D和圖21的步驟D(左圖)中，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間以及延伸的寡核苷酸探針的3′端和5′端之間的連接結(jié)，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。在環(huán)化寡核苷酸探針的可裂解連接(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)處引入缺口，以使得寡核苷酸探針易發(fā)生核酸外切酶消化(圖19，步驟E和圖21，步驟E，左圖)。如圖19的步驟D和圖21的步驟D(右圖)中所示，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間的連接結(jié)；然而，寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖19的步驟E和圖21的步驟E中所示，核酸外切酶消化所有未連接的或有缺口的寡核苷酸產(chǎn)物(即，寡核苷酸探針)，只留下連接至含有例如獨特標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列或患者標(biāo)識符序列的其它部分的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。如上所述，所得環(huán)化產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。圖20和圖22中所描繪的過程基本上分別與圖19和圖21中所示的過程相同；然而，寡核苷酸探針包含在其3′端上的阻斷基團(3’-Blk)、一個或多個可裂解連接(“r”)、引物結(jié)合序列和任選的5′捕獲基團(“Z”)(如圖20的步驟B和圖22的步驟B中所示)。聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交短接頭3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。DNA區(qū)段的5′端在重疊匹配堿基處的核酸酶裂解產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根(圖20，步驟C和圖22，步驟C)。在圖20的步驟D和圖22的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封靶標(biāo)的延伸的3′端至其5′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針的3′阻斷基團防止寡核苷酸探針的延伸。隨后，通過在可裂解連接處的裂解，例如核糖核苷酸“r”的RNA酶(實心三角形)裂解，移除阻斷基團。如圖20的步驟E和圖22的步驟E中所示，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的自由的3′端以啟動滾環(huán)擴增。通過滾環(huán)擴增形成的初級延伸產(chǎn)物適用于測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖23和圖25示出了用于產(chǎn)生如上參照圖13、15、17、19和21所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸“靶”構(gòu)建體的類似過程。靶基因組DNA衍生自平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA。在圖23和圖25的實施方案中，沒有將3′或5′接頭或尾巴添加到基因組DNA片段上。如圖23的步驟B和圖25的步驟B中所示，含有與DNA區(qū)段的5′和3′端互補的序列的寡核苷酸探針雜交至靶DNA區(qū)段。在圖23步驟B中所描繪的實施方案中，DNA寡核苷酸的3′和5′端不與寡核苷酸探針互補，從而形成兩個非雜交側(cè)翼。在圖25步驟B的實施方案中，DNA寡核苷酸的3′和5′端與寡核苷酸探針互補。寡核苷酸探針的其它部分(顯示為粗黑條)可以含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列和/或可裂解連接(在粗條內(nèi)標(biāo)記為“U”(圖23，步驟B和圖25，步驟B，左圖)。所述寡核苷酸探針還可以在一端上含有阻斷基團(例如，圖23，步驟B和圖25，步驟B，右圖；阻斷基團在寡核苷酸探針的5’端上)。如圖23的步驟C中所示，具有3’核酸酶活性的聚合酶(實心菱形)去除靶寡核苷酸的單鏈3′端，然后延伸DNA區(qū)段的3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。由聚合酶介導(dǎo)的靶寡核苷酸的3′端的延伸也發(fā)生在圖25步驟B的過程中。延伸后，在圖23步驟C和圖25步驟C的過程中，5′-核酸酶在靶DNA的匹配的5′-重疊堿基處裂解移除5′接頭區(qū)域，從而留下可連接的5′-磷酸根。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針的3′端(圖23，步驟C和圖25，步驟C)。所述探針的5′上的阻斷基團(圖23，步驟C和圖25，步驟C，右側(cè))未裂解。在圖23的步驟D和圖25的步驟D(左圖)中，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間以及延伸的寡核苷酸探針的3′端和5′端之間的連接結(jié)，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。在環(huán)化寡核苷酸探針的可裂解連接(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)處引入缺口，以使得寡核苷酸探針易發(fā)生核酸外切酶消化(圖23，步驟E和圖25，步驟E，左圖)。如圖23的步驟D和圖25的步驟D(右圖)中所示，連接酶(實心圓)共價地密封延伸的靶基因組DNA區(qū)段的3′端和5′端之間的連接結(jié)；然而，寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖23的步驟E和圖25的步驟E中所示，核酸外切酶消化所有未連接的或有缺口的寡核苷酸產(chǎn)物(即，寡核苷酸探針)，只留下連接至含有例如獨特標(biāo)識符序列、引物結(jié)合序列或患者標(biāo)識符序列的其它部分的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。如上所述，所得環(huán)化產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。寡核苷酸探針(例如，在圖25中所描繪的過程中使用的寡核苷酸探針)的3′和5′靶標(biāo)特異性部分可以被設(shè)計為包含與靶基因組DNA區(qū)段的一個或多個核苷酸錯配。這種設(shè)計特征確保了可連接的環(huán)化核酸構(gòu)建體的靶基因組DNA區(qū)段可以與可連接的環(huán)化核酸構(gòu)建體的聚合酶延伸部分區(qū)分開來(即，在圖25E中，環(huán)化構(gòu)建體的實線可以與構(gòu)建體的虛線區(qū)分開來)。圖24和圖26中所描繪的過程基本上分別與圖23和圖25中所示的過程相同；然而，寡核苷酸探針包含在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接、引物結(jié)合序列和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖24的步驟B和圖26的步驟B)。聚合酶(實心菱形)延伸DNA區(qū)段的雜交3′端以拷貝寡核苷酸探針的其它部分。在圖24步驟C的實施方案中，聚合酶在延伸之前裂解靶寡核苷酸的3′非互補側(cè)翼。DNA區(qū)段的5′端在重疊匹配堿基處的核酸酶裂解產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根(圖24，步驟C和圖26，步驟C)。在圖24的步驟D和圖26的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封DNA區(qū)段的延伸的3′端至其5′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針的3′阻斷基團防止寡核苷酸探針的延伸。隨后，通過在可裂解連接處的裂解，例如核糖核苷酸“r”的RNA酶(實心三角形)裂解，移除阻斷基團。如圖24的步驟E和圖26的步驟E中所示，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的自由的3′端以啟動滾環(huán)擴增。通過滾環(huán)擴增形成的初級延伸產(chǎn)物適用于測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖27示出了形成含有相鄰甲基化HinP1I位點(GCGC)的單鏈環(huán)化核酸構(gòu)建體的過程。所述環(huán)化核酸構(gòu)建體適用于甲基化HinP1I位點的檢測和/或測序。如圖27的步驟A中所示，過程開始于在未甲基化HinP1I識別位點處利用HinP1I裂解cfDNA或基因組DNA，以形成約160bp的基因組DNA區(qū)段。靶寡核苷酸片段內(nèi)的甲基化HinP1I位點由‘m’表示。如圖27的步驟B中所示，具有獨特標(biāo)識符序列(粗黑線)和靠近寡核苷酸探針的3′和5′端的未甲基化HinP1I序列(即，與cfDNA的HinP1I位點互補)的寡核苷酸探針與具有甲基化HinP1I位點(左圖)或未甲基化HinP1I位點(右圖)的靶cfDNA寡核苷酸雜交。寡核苷酸探針的5′端包含阻斷基團且3′端與靶寡核苷酸錯配以防止聚合酶延伸。在圖27步驟C中，雜交至基因組靶區(qū)段的寡核苷酸探針經(jīng)受HinP1I(實心三角形)裂解。如果探針和靶寡核苷酸都不包含甲基化HinP1I位點，則HinP1I裂解靶寡核苷酸和探針寡核苷酸，從而使未甲基化靶序列不經(jīng)受進一步測定。如果靶寡核苷酸含有甲基化HinP1I位點，但探針寡核苷酸不含甲基化HinP1I位點(如圖27步驟C的左圖中所示)，則HinP1I只裂解探針寡核苷酸，從而在探針上產(chǎn)生可延伸3′-OH和可連接的5′-磷酸根。聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的自由3′端，且連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針的3′延伸端和5′端，從而形成共價閉合的連接產(chǎn)物(圖27，步驟D)。HinP1I的熱失活或聚合酶合并修飾的核苷酸防止HinP1I再裂解。如圖27步驟E中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或裂解的產(chǎn)物，從而只留下包含靶DNA的補體和獨特標(biāo)識符序列的所需單鏈環(huán)狀DNA構(gòu)建體。該環(huán)化連接產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。圖28示出了用于發(fā)現(xiàn)在整個基因組中的相鄰HinP1I位點(GCGC)處的甲基化的過程。該過程包括用HinP1I裂解基因組DNA并將具有阻斷型5′端的短接頭(粗黑線)連接到裂解的基因組片段上(如圖28步驟A中所示)?！癿”指示甲基化HinP1I位點。在圖28的步驟B中，利用5′阻斷引物進行的有限PCR擴增產(chǎn)生未甲基化產(chǎn)物。當(dāng)被HinP1I(實心三角形)裂解時，只有在原始靶中甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGG)產(chǎn)生未被阻斷的片段。如圖28步驟C中所示，連接(實心圓)在含有任選的獨特標(biāo)識符序列(灰色填充雙線)、任選的患者標(biāo)識符序列(灰色填充雙線)，且具有阻斷的3′端或含硫代硫酸的主鏈(****)的接頭(雙線)上，以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都連接有接頭的片段仍將為雙鏈。在圖28的步驟D中，接頭的游離端通過以下方式具備連接能力：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除阻斷的3′基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5′-磷酸根；或其任何組合。在圖28的步驟E中，連接條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。連接產(chǎn)物包含最初在靶DNA中甲基化的相鄰HinP1I序列以及可選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖29示出了用于產(chǎn)生適于在始于平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA(“靶寡核苷酸”或“DNA區(qū)段”)的已知基因組區(qū)域中檢測在相鄰AciI位點(GCGG)處的甲基化的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖29的步驟A中所示，所述過程開始于將耐亞硫酸氫鹽的接頭(粗黑線)附接在基因組DNA區(qū)段的3′和5′端上(例如，通過連接)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA會將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，從而產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物(圖29步驟A中的“m”代表甲基化AciI位點)。進行有限PCR以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物，并用AciI(實心三角形)裂解所得的PCR產(chǎn)物。只有原始靶區(qū)段中的甲基化位點仍為GCGG并經(jīng)受AciI裂解以產(chǎn)生可連接的末端。如圖29的步驟B中所示，含有與裂解的靶核苷酸的5′和3′側(cè)互補的序列和任選的5’阻斷基團的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的互補靶核苷酸互補。除了靶標(biāo)特異性部分，寡核苷酸探針還包含其它部分。該其它部分是可以包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和一個或多個引物結(jié)合位點的核苷酸序列部分。如圖29步驟C中所示，缺乏5′-3′的活性的聚合酶(實心菱形)延伸靶寡核苷酸的3′端，以拷貝探針的其它部分并產(chǎn)生與靶寡核苷酸的5′端的可連接結(jié)。聚合酶還使用靶寡核苷酸作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解該探針的5′阻斷基團(如果存在)。在圖29步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封靶寡核苷酸的3′和5′端以形成含有靶(亞硫酸氫鹽處理和拷貝)DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針鏈的環(huán)化。如圖29步驟E中所示，核酸外切酶消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶DNA的補體和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于使用任何上述方法進行環(huán)形測序。圖30示出了用于產(chǎn)生適于在始于平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA的已知基因組區(qū)域中檢測在相鄰AciI位點(GCGG)處的甲基化的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖30A中所示，所述過程開始于將耐亞硫酸氫鹽的接頭(粗黑線)附接到基因組DNA區(qū)段的3′和5′端上(例如，通過連接)?；蚪MDNA區(qū)段中的“m”表示甲基化AciI位點。用亞硫酸氫鹽處理cfDNA和/或基因組DNA區(qū)段會將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’，并產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物。進行有限PCR以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物，并用AciI(實心三角形，只有原始靶中的甲基化位點仍為GCGG)裂解所得的PCR產(chǎn)物，以產(chǎn)生可連接的末端。如圖30的步驟B中所示，含有與裂解的靶PCR產(chǎn)物的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針雜交至其相應(yīng)的互補靶核苷酸。所述寡核苷酸探針可以具有在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接和/或任選的5′捕獲基團(“Z”)。除了靶標(biāo)特異性部分，寡核苷酸探針還包含其它部分。該其它部分是可以包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和一個或多個引物結(jié)合位點的核苷酸序列部分。如圖30步驟C中所示，缺乏5′-3′的活性的聚合酶(實心菱形)延伸靶寡核苷酸的3′端，以拷貝探針的其它部分并產(chǎn)生與靶寡核苷酸的5′端的可連接結(jié)。在圖30步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封靶寡核苷酸的3′和5′端以形成含有靶(亞硫酸氫鹽處理，拷貝)DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的3′阻斷基團防止寡核苷酸探針鏈的延伸和環(huán)化。隨后通過在可裂解連接處形成缺口(例如，核糖核苷酸r的RNA酶裂解)去除3′阻斷基團允許由聚合酶介導(dǎo)的寡核苷酸探針的延伸(圖30，步驟D)。如圖30的步驟E中所示，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)延伸自由的3′端以進行滾環(huán)擴增。該延伸產(chǎn)物適用于使用任何本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖31示出了用于產(chǎn)生適于在始于平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA的已知基因組區(qū)域中檢測在相鄰AciI位點(GCGG)處的甲基化的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程(m代表甲基化AciI位點)。如圖31的步驟A中所示，所述過程開始于將耐亞硫酸氫鹽的接頭(粗黑線)附接到基因組DNA區(qū)段的3′和5′端上(例如，通過連接)。用亞硫酸氫鹽處理cfDNA和/或基因組DNA區(qū)段會將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’，并產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物。進行有限PCR以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物，并用AciI(實心三角形)裂解所得的PCR產(chǎn)物。只有原始靶中的甲基化位點仍為GCGG并經(jīng)受AciI裂解以產(chǎn)生可連接的末端。如圖31步驟B中所示，雙鏈體寡核苷酸探針與裂解的靶DNA區(qū)段雜交。所述雙鏈體探針包含第一寡核苷酸探針鏈，其含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列彼此被其它部分隔開。所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一個或多個引物結(jié)合序列。雙鏈體寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針(具有圓環(huán)的粗黑線)含有與第一寡核苷酸探針的其它部分互補的序列。第二寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域表示非互補區(qū)。如圖31步驟C中所示，雙鏈體探針與裂解的基因組DNA區(qū)段的雜交在DNA區(qū)段的3′端和第二寡核苷酸探針的5′端之間以及在第二寡核苷酸探針的3′端和裂解的基因組區(qū)段的5′之間形成兩個可連接結(jié)。連接酶(實心圓)共價地密封所述連接結(jié)以形成含有靶(亞硫酸氫鹽處理，拷貝)DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖31，步驟C)。如圖31步驟D中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下適用于使用任何本文所述的方法進行環(huán)形測序的所需單鏈環(huán)狀連接產(chǎn)物。圖32示出了基本上與圖31中所示和所述相同的用于產(chǎn)生適用于檢測相鄰AciI位點處的甲基化的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。在圖32中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針的第一寡核苷酸探針具有任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖32，步驟B)。在連接第二寡核苷酸探針和靶(經(jīng)亞硫酸氫鹽處理，拷貝)DNA片段以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖32，步驟C)后，使用鏈置換聚合酶延伸第一寡核苷酸探針的3′端。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列(圖32，步驟D)且適用于使用本文所述的方法測序的第一初級延伸產(chǎn)物。圖33示出了從已剪切至150bp的平均尺寸或從平均尺寸為160bp的cfDNA開始的用于發(fā)現(xiàn)整個基因組中的相鄰AciI位點(GCGG)處的甲基化的過程。如圖33的步驟A中所示，所述過程開始于將短接頭附接(例如，經(jīng)由連接)到DNA區(qū)段的3′和5′端上(粗黑線)。5′接頭含有阻斷基團。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA會將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’，并產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物。如圖33的步驟B中所示，利用5′阻斷引物進行的有限PCR擴增產(chǎn)生未甲基化產(chǎn)物。當(dāng)被AciI(實心三角形)裂解時，只有在原始靶中甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)產(chǎn)生未被阻斷的片段。如圖33步驟C中所示，附接包含獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的接頭(灰色雙線)(例如，通過連接到AciI裂解產(chǎn)物)。所述接頭含有3′阻斷基團或含硫代磷酸根的主鏈(****)以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都附接有接頭的片段仍為雙鏈(圖33，步驟C，下圖)。如圖33的步驟D中所示，接頭端通過以下方式具備連接能力(實心圓)：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除阻斷的3′基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼以產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根；或(iv)這些技術(shù)的任何組合。連接條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。圖33步驟E示出了由被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的靶DNA(主要由CpG島引起)的補體組成的具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的連接產(chǎn)物。最終產(chǎn)物適用于另外的步驟和后續(xù)測序。圖34示出了用于產(chǎn)生適于在始于平均長度為160bp的cfDNA或剪切至約160bp片段的基因組DNA的基因組的限定區(qū)域中檢測未甲基化相鄰HinP1I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖34的步驟A中所示，所述過程開始于基因組DNA在GCGC識別位點(實心三角形)處的HinP1I裂解，生成可連接的3′和5′端。如圖34的步驟B中所示，含有與裂解的靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針雜交至其相應(yīng)的裂解的靶DNA區(qū)段。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列。在圖34的實施方案中，寡核苷酸探針還具有在一端(例如，5′端)上的阻斷基團。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與所述靶的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)(圖34中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖34的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。或者，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖34步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。圖35示出了基本上與圖34中所示和所述相同的用于產(chǎn)生適用于檢測在基因組的限定區(qū)域內(nèi)的未甲基化相鄰HinP1I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。在圖35中所描繪的實施方案中，寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接被描繪成“r”)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖35，步驟B)。利用聚合酶延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以形成與靶DNA區(qū)段的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)。在連接靶DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖35，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖35，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖35，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖35，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖36和圖37示出了用于產(chǎn)生適于檢測位于cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的HaeIII位點之間的甲基化AciI位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用AciI(實心三角形，GCGG)和HaeIII(實心三角形，GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的3′和5′端；m代表裂解區(qū)段內(nèi)的甲基化位點(圖36，步驟A和圖37，步驟A)。在圖36的實施方案中，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖36，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖36步驟B中所示的5’阻斷基團)。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與所述靶的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)(圖36中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖36的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。或者，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖36步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在圖37中所描繪的實施方案中，寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接描繪在“r”處)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖37，步驟B)。在連接靶DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖37，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖37，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖37，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖37，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖38示出了用于產(chǎn)生適于檢測位于cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的HaeIII位點之間的甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用Bsh1236I(CGCG)和HaeIII(實心三角形，GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的3′和5′端；m代表裂解區(qū)段內(nèi)的甲基化位點(圖38，步驟A)。在圖38的實施方案中，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖38，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖38步驟B中所示的5’阻斷基團)。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與所述靶的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)(圖38中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖38的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化?；蛘?，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖38步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于在BstUI(CGCG)的存在下使用Bst聚合酶進行滾環(huán)擴增，以確保原始靶中的甲基化位點不被裂解，且隨后通過測序加以識別。這個實例展現(xiàn)了BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的利用。然而，在該方法中還可以利用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解摻混的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA的其它核酸內(nèi)切酶。這些包括但不限于嗜熱酶BstHHI(識別GCGC；HhaI的同裂酶)、BsiSI(識別CCGG；HpaII的同裂酶)和TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。圖39和圖36示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近基因組DNA的已知區(qū)域中的5’-HaeIII位點的甲基化AciI位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。該方法適用于檢測在剪切至160bp的平均尺寸的基因組DNA或具有160bp的平均尺寸的cfDNA中的甲基化AciI位點。用AciI(GCGG)和HaeIII(GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的5′端(圖39，步驟A和圖40，步驟A)。在圖39中所描繪的實施方案中，含有與靶基因組DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖39，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖39步驟B中所示的5’阻斷基團)。具有3′-5′核酸酶活性但缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)移除單鏈3′端，然后延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與所述靶的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)(圖39中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖39的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。或者，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖39步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在圖40中所描繪的實施方案中，寡核苷酸探針含有與裂解的靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接描繪在“r”處)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖40，步驟A)。在連接靶DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖40，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖40，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖40，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖40，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖41示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近基因組DNA的已知區(qū)域中的5’-HaeIII位點的甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。該方法適用于檢測在剪切至150bp的平均尺寸的基因組DNA或具有160bp的平均尺寸的cfDNA中的甲基化Bsh1236I位點。用Bsh1236I(CGCG)和HaeIII(GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的5′端(圖41，步驟A)。在圖41中所描繪的實施方案中，含有與靶基因組DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖41，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖41步驟B中所示的5’阻斷基團)。具有3’-5’核酸酶活性但缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)移除靶DNA區(qū)段的單鏈3′端，然后延伸雜交的靶DNA區(qū)段的裂解3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與所述靶的5′端上的可連接的磷酸根的連接結(jié)(圖41中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖41的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化?；蛘?，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖41步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于在BstUI(CGCG)的存在下使用Bst聚合酶進行滾環(huán)擴增，以確保原始靶中的甲基化位點隨后通過測序被識別。這個實例展現(xiàn)了BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的利用。然而，可替代地可以利用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解摻混的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA的其它核酸內(nèi)切酶。這些包括但不限于嗜熱酶BstHHI(識別GCGC；HhaI的同裂酶)、BsiSI(識別CCGG；HpaII的同裂酶)和TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。圖42和圖43示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的3’-HaeIII位點的甲基化AciI位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用AciI(GCGG)和HaeIII(GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可延伸3′端(圖42，步驟A和圖43，步驟A)。在圖42的實施方案中，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖42，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖42B中所示的5’阻斷基團)。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分。聚合酶的5′核酸酶活性裂解靶DNA區(qū)段的匹配的5′重疊堿基，從而產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖42，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖42的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成含有原始基因組DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化?；蛘撸诎谒銎渌糠种械目闪呀膺B接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖42步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在圖43的實施方案中，寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接描繪在“r”處)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖43，步驟B)。在連接靶DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖43，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖43，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖43，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖43，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團摘獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖44示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的3’-HaeIII位點的甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用Bsh1236I(CGCG)和HaeIII(GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可延伸3′端(圖44，步驟A)。在圖44的實施方案中，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖44，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖44步驟B中所示的5’阻斷基團)。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分。聚合酶的5′核酸酶活性裂解靶DNA區(qū)段的匹配的5′重疊堿基，從而產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖44，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖44的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成含有原始基因組DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。或者，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖44步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于在BstUI(CGCG)的存在下使用Bst聚合酶進行滾環(huán)擴增，以確保原始靶中的甲基化位點隨后通過測序被識別。這個實例展現(xiàn)了BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的使用。然而，可以使用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解摻混的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA的其它核酸內(nèi)切酶。這些包括但不限于嗜熱酶BstHHI(識別GCGC；HhaI的同裂酶)、BsiSI(識別CCGG；HpaII的同裂酶)和TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。圖45示出了用于產(chǎn)生適于檢測在基因組DNA的已知區(qū)域中的相鄰甲基化Bsh1236I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。該方法適用于檢測在剪切至150bp的平均尺寸的基因組DNA或具有160bp的平均尺寸的cfDNA中的甲基化Bsh1236I位點。用Bsh1236I(CGCG)在靶DNA中的未甲基化識別位點處裂解基因組DNA(圖45，步驟A)。在圖45中所描繪的實施方案中，含有與靶基因組DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與DNA區(qū)段雜交(圖45，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖44步驟B中所示的5’阻斷基團)。具有3′-5活性的聚合酶(實心菱形)移除靶標(biāo)的單鏈3′端，然后延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分。聚合酶的5′-3′核酸酶活性裂解靶DNA區(qū)段的匹配的5′重疊堿基，從而產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖45，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖45的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化?；蛘撸诎谒銎渌糠种械目闪呀膺B接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖45步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于在BstUI(CGCG)的存在下使用Bst聚合酶進行滾環(huán)擴增。因此，原始靶中的甲基化位點被擴增且隨后通過測序被識別。這個實例展現(xiàn)了BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的利用。然而，可以使用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解摻混的甲基化/未甲基化DNA，也不裂解未甲基化單鏈DNA的其它核酸內(nèi)切酶。這些包括但不限于嗜熱酶BstHHI(識別GCGC；HhaI的同裂酶)、BsiSI(識別CCGG；HpaII的同裂酶)和TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。圖46示出了用于產(chǎn)生適于檢測靠近基因組DNA的已知區(qū)域中的Bsh1236I位點的所有甲基化CpG位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。該方法適用于檢測在剪切至150bp的平均尺寸的基因組DNA或具有160bp的平均尺寸的cfDNA中靠近甲基化Bsh1236I位點的所有甲基化CpG位點。用Bsh1236I(CGCG)在未甲基化識別位點處裂解基因組DNA(圖46，步驟A)。亞硫酸氫鹽處理將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’并使所述鏈為非互補性。在圖46中所描繪的實施方案中，含有與經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化靶基因組DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與DNA區(qū)段雜交(圖46，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖46步驟B中所示的5’阻斷基團)。具有3′-5′活性的聚合酶(實心菱形)移除經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的靶標(biāo)的單鏈3′端，然后延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端以拷貝探針的其它部分。聚合酶的5′-3′核酸酶活性裂解經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的靶DNA區(qū)段的匹配的5′重疊堿基，從而產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖46，步驟C)。聚合酶還使用經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖46的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖46步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的包含經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于在BstUI(CGCG)的存在下使用Bst聚合酶進行滾環(huán)擴增，以確保未被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的位點在原始靶中是甲基化的，且所有其它甲基化CpG位點通過測序被識別。這個實例展現(xiàn)了BstUI限制性核酸內(nèi)切酶的使用。然而，可以使用裂解雙鏈DNA(如果未甲基化)，但不裂解摻混的甲基化/未甲基化DNA或未甲基化單鏈DNA，并且保留甲基化位點的限制性識別的其它核酸內(nèi)切酶。這包括但不限于嗜熱酶TaiI(識別ACGT；MaeII的同裂酶)。圖47和圖48示出了用于產(chǎn)生適于檢測cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用HinP1I(GCGC)(實心三角形)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的3′和5′端(圖47，步驟A和圖48，步驟A)。如圖47步驟B中所示，雙鏈體寡核苷酸探針與裂解的靶DNA區(qū)段雜交。所述雙鏈體探針包含第一寡核苷酸探針鏈，其含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列被其它部分隔開。所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一個或多個引物結(jié)合序列。雙鏈體寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針(具有圓環(huán)的粗黑線)含有與第一寡核苷酸探針的其它部分互補的序列。第二寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域表示非互補區(qū)。如圖47步驟C中所示，雙鏈體探針與裂解的基因組DNA區(qū)段的雜交形成兩個可連接結(jié)(即，在DNA區(qū)段的3′端和第二寡核苷酸探針的5′端之間，以及在第二寡核苷酸探針的3′端和裂解的基因組區(qū)段的5′之間)。連接酶(實心圓)共價地密封所述連接結(jié)以形成含有基因組DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖47，步驟C)。如圖47步驟D中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下適用于使用任何本文所述的方法進行環(huán)形測序的所需單鏈環(huán)狀連接產(chǎn)物。在圖48中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針的第一寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。此外，第一寡核苷酸探針還具有任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖48，步驟B)。在靶DNA片段和第二寡核苷酸探針之間的兩個連接結(jié)處連接形成圖48步驟C的環(huán)化連接產(chǎn)物后，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)使用含DNA的環(huán)化連接產(chǎn)物作為模板延伸第一寡核苷酸探針(圖48，步驟D)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖48，步驟D)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖49和圖50示出了用于產(chǎn)生適于檢測位于cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的HaeIII位點之間的甲基化(“m”)AciI位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。用AciI(實心三角形，GCGG)和HaeIII(實心三角形，GGCC)裂解基因組DNA，以產(chǎn)生可連接的3′和5′端(圖49，步驟A和圖50，步驟A)。如圖49步驟B和圖50步驟B中所示，雙鏈體寡核苷酸探針與裂解的靶DNA區(qū)段雜交。在圖49中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針包含第一寡核苷酸探針鏈，其含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列被其它部分隔開。所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一條或多條引物結(jié)合序列(步驟49，步驟B)。雙鏈體寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針(具有圓環(huán)的粗黑線)含有與第一寡核苷酸探針的其它部分互補的序列(步驟49，步驟B)。第二寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域表示非互補區(qū)。如圖49步驟C中所示，雙鏈體探針與裂解的基因組DNA區(qū)段的雜交形成兩個可連接結(jié)(即，在DNA區(qū)段的3′端和第二寡核苷酸探針的5′端之間，以及在第二寡核苷酸探針的3′端和裂解的基因組區(qū)段的5′之間)。連接酶(實心圓)共價地密封所述連接結(jié)以形成含有甲基化基因組DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖49，步驟C)。如圖49步驟D中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下適用于使用任何本文所述的方法進行環(huán)形測序的所需單鏈環(huán)狀連接產(chǎn)物。在圖50中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針的第一寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。此外，第一寡核苷酸探針還具有任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖50，步驟B)。在靶DNA片段和第二寡核苷酸探針之間的兩個連接結(jié)處連接形成環(huán)化甲基化連接產(chǎn)物(圖50，步驟C)后，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)使用含DNA的環(huán)化連接產(chǎn)物作為模板延伸第一寡核苷酸探針(圖50，步驟D)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖50，步驟D)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖51示出了用于發(fā)現(xiàn)基因組DNA的已知區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點(GCGC)的過程?；蚪MDNA(無論是從全細(xì)胞分離的，還是作為血漿中的cfDNA)包含通過天然酶促過程或剪切形成的末端。需要通過將短接頭附接至DNA末端的3′和5′端(例如，經(jīng)由連接附接接頭)來阻斷這些末端用于后續(xù)步驟。如圖51步驟A中所示，5′端接頭包含阻斷基團(粗黑線)。用HinP1I(GCGC)(實心三角形)裂解附接有接頭的DNA(圖51，步驟A)。當(dāng)被HinP1I裂解時，只有在原始基因組DNA中未甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGG)產(chǎn)生未被阻斷的片段。如圖51步驟B中所示，將包含獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的長接頭(部分灰色的雙線)附接至HinP1I裂解的DNA片段。所述長接頭含有3′端阻斷基團或含硫代磷酸根的主鏈(****)以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都附接有接頭的片段仍將為雙鏈。如圖51的步驟C中所示，接頭的游離端通過以下方式具備連接能力：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除3′阻斷基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼以產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根；或(iv)：(i)、(ii)、(iii)的任何組合。連接(實心圓)條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。如圖51步驟D中所示，連接產(chǎn)物是由連接至獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的最初在基因組DNA中未甲基化的相鄰HinP1I序列組成。最終產(chǎn)物適用于后續(xù)測序。圖52示出了用于發(fā)現(xiàn)整個基因組的已知區(qū)域中的甲基化相鄰AciI位點(GCGG)的過程。用AciI(實心三角形)裂解基因組DNA；m代表甲基化位點。如圖52步驟A中所示，通過例如連接將具有5′端阻斷基團的短接頭(粗黑線)附接到被AciI消化的DNA。用HaeIII(GGCC)裂解附接有接頭的DNA。當(dāng)被HaeIII裂解時，只有在原始基因組DNA中具有甲基化AciI位點的相鄰HaeIII位點(GGCC)產(chǎn)生未被阻斷的片段。在圖52的步驟B中，將包含獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的長接頭(部分灰色的雙線)附接至HaeIII裂解的DNA片段。所述長接頭含有3′端阻斷基團或含硫代磷酸根的主鏈(****)以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都附接有接頭的片段仍將為雙鏈。如圖52的步驟C中所示，接頭的游離端通過以下方式具備連接能力：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除3′阻斷基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼以產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根；或(iv)：(i)、(ii)、(iii)的任何組合。連接(實心圓)條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。如圖52步驟D中所示，連接產(chǎn)物是由連接至獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的最初在基因組DNA中的AciI位點處甲基化的相鄰HaeIII序列組成。最終產(chǎn)物適用于后續(xù)測序。圖53和圖54示出了用于產(chǎn)生適于檢測cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖53步驟A和圖54步驟A中所示，用HinP1I(GCGC)裂解基因組DNA以產(chǎn)生可連接的3′和5′端。被HinP1I消化的DNA的亞硫酸氫鹽處理將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’。在圖53的實施方案中，含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖53，步驟B)。所述寡核苷酸含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和在一端上的可選阻斷基團。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段的3′端，以使其與靶的5′端上的可連接的磷酸根齊平(圖53，步驟C)。聚合酶還在靶上延伸寡核苷酸探針，但不裂解5′阻斷基團。在圖53的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封延伸的靶DNA區(qū)段末端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖53步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化型原始靶DNA和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在圖54的實施方案中，寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接描繪在“r”處)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖54，步驟B)。在連接靶DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖54，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖54，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖54，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖54，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序。可以在滾環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團摘獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖55和圖56示出了用于產(chǎn)生適于檢測cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖55步驟A和圖56步驟A中所示，用HinP1I(GCGC)(實心三角)裂解基因組DNA以產(chǎn)生可連接的3′和5′端。被HinP1I消化的DNA的亞硫酸氫鹽處理將未甲基化的C’轉(zhuǎn)化為U’(圖55，步驟A和圖56，步驟A)。如圖55步驟B和圖56步驟B中所示，雙鏈體寡核苷酸探針與裂解的靶DNA區(qū)段雜交。在圖55中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針包含第一寡核苷酸探針鏈，其含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列被其它部分隔開。所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一條或多條引物結(jié)合序列(步驟55，步驟B)。雙鏈體寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針(具有圓環(huán)的粗黑線)含有與第一寡核苷酸探針的其它部分互補的序列(步驟55，步驟B)。第二寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域表示非互補區(qū)。如圖55步驟C中所示，雙鏈體探針與被HinP1I消化和亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的雜交形成兩個可連接結(jié)(即，在DNA區(qū)段的3′端和第二寡核苷酸探針的5′端之間，以及在第二寡核苷酸探針的3′端和DNA區(qū)段的5′之間)。連接酶(實心圓)共價地密封所述連接結(jié)以形成含有經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖55，步驟C)。如圖55步驟D中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下適用于使用任何本文所述的方法進行環(huán)形測序的所需單鏈環(huán)狀連接產(chǎn)物。在圖56中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針的第一寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。此外，第一寡核苷酸探針還具有任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖56，步驟B)。在靶DNA片段和第二寡核苷酸探針之間的兩個連接結(jié)處連接形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖56，步驟C)后，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)使用含DNA的環(huán)化連接產(chǎn)物作為模板延伸第一寡核苷酸探針(圖56，步驟D)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖56，步驟D)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖57示出了用于發(fā)現(xiàn)在cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HinP1I位點(GCGC)的過程。基因組DNA(無論是從全細(xì)胞分離的，還是作為血漿中的cfDNA)包含通過天然酶促過程或剪切形成的末端。需要通過將短接頭附接至DNA末端的3′和5′端(例如，經(jīng)由連接附接接頭)來阻斷這些末端用于后續(xù)步驟。如圖57步驟A中所示，5′端接頭包含阻斷基團(粗黑線)。用HinP1I(GCGC)(實心三角形)裂解附接有接頭的DNA(圖57，步驟A)。當(dāng)被HinP1I裂解時，只有在原始基因組DNA中未甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGG)產(chǎn)生未被阻斷的片段。如圖57步驟B中所示，將包含獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的長接頭(部分灰色的雙線)附接至HinP1I裂解的DNA片段。所述長接頭含有3′端阻斷基團或含硫代磷酸根的主鏈(****)以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都附接有接頭的片段仍將為雙鏈。如圖57的步驟C中所示，接頭的游離端通過以下方式具備連接能力：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除3′阻斷基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼以產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根；或(iv)：(i)、(ii)、(iii)的任何組合。連接(實心圓)條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。如圖57步驟D中所示，連接產(chǎn)物的亞硫酸氫鹽處理將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’。連接產(chǎn)物包含被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA，最初在靶DNA中未甲基化的相鄰HinP1I序列連接至獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列。最終產(chǎn)物適用于另外的步驟和后續(xù)測序。圖58和圖59示出了用于產(chǎn)生適于檢測cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰“HphI”位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖58步驟A和圖59步驟A中所示，將短接頭附接(例如，通過連接)到cfDNA片段或剪切的基因組DNA上。用亞硫酸氫鹽處理附接有接頭的DNA以將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’。進行有限PCR，并用HphI裂解所得的PCR產(chǎn)物(只有未甲基化GGCGA->GGTGA)，以產(chǎn)生可連接的末端(圖58步驟A和圖59步驟A)。在圖58的實施方案中，含有與消化的靶PCR區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的5’和3’端序列的寡核苷酸探針與裂解的DNA區(qū)段雜交(圖58，步驟B)。所述寡核苷酸探針還包含其它核苷酸部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或一個或多個引物結(jié)合位點中的一個或多個。所述寡核苷酸探針還可以在一個末端上具有阻斷基團(例如，如圖58步驟B中所示的5’阻斷基團)。缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′端，以拷貝探針的其它部分并形成與雜交靶DNA區(qū)段的5′端的連接結(jié)(圖58中，步驟C)。聚合酶還使用靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針，但不裂解在其5′端上的阻斷基團。在圖58的步驟D中，連接酶(實心圓)共價地密封DNA區(qū)段的3′延伸端和5′端之間的結(jié)以形成含有由PCR產(chǎn)生的HphI消化型DNA區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止寡核苷酸探針的環(huán)化?；蛘?，在包含于所述其它部分中的可裂解連接處引入缺口，例如所述其它部分含有使用UDG裂解的尿嘧啶核苷酸。如圖58步驟E中所示，所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物的核酸外切酶消化只留下包含連接至其它識別核苷酸序列(例如，獨特標(biāo)識符序列)的由PCR產(chǎn)生的HphI消化型DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在圖59的實施方案中，寡核苷酸探針還含有與消化的靶PCR區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。另外，所述寡核苷酸探針還具有在其3′端上的阻斷基團(3′-Blk)、一個或多個可裂解連接(其中可裂解連接描繪在“r”處)和任選的5′捕獲基團(“Z”)(圖59，步驟B)。在連接靶PCR區(qū)段的3′延伸端和5′端以形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖59，步驟C)后，寡核苷酸探針上的3′阻斷基團被去除(例如，核糖核苷酸連接的RNA酶H裂解)(圖59，步驟D)，且缺乏5′-3′活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化DNA連接產(chǎn)物作為模板延伸寡核苷酸探針(圖59，步驟E)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖58，步驟E)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序?？梢栽跐L環(huán)擴增之前或之后將任選的5′Z基團捕獲在固體載體上。一旦被捕獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖60和圖61示出了用于產(chǎn)生適于檢測cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰“HphI”位點的嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體的過程。如圖60步驟A和圖61步驟A中所示，將短接頭附接(例如，通過連接)到cfDNA片段或剪切的基因組DNA上。用亞硫酸氫鹽處理附接有接頭的DNA以將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’。進行有限PCR，并用HphI裂解所得的PCR產(chǎn)物(只有未甲基化GGCGA->GGTGA)，以產(chǎn)生可連接的末端(圖60步驟A和圖61步驟A)。如圖60步驟B和圖61步驟B中所示，雙鏈體寡核苷酸探針與裂解的靶DNA區(qū)段雜交。在圖60中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針包含第一寡核苷酸探針鏈，其含有與靶PCR區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的核苷酸序列。第一寡核苷酸探針的這些靶標(biāo)特異性部分被其它部分隔開，所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一條或多條引物結(jié)合序列(步驟60，步驟B)。雙鏈體寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針(具有圓環(huán)的粗黑線)含有與第一寡核苷酸探針的其它部分互補的序列(步驟60，步驟B)。第二寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域表示非互補區(qū)。如圖60步驟C中所示，雙鏈體探針與被HphI消化的PCR產(chǎn)物的雜交形成兩個可連接結(jié)(即，在DNA區(qū)段的3′端和第二寡核苷酸探針的5′端之間，以及在第二寡核苷酸探針的3′端和DNA區(qū)段的5′之間)。連接酶(實心圓)共價地密封所述連接結(jié)以形成含有HphI消化區(qū)段的環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖60，步驟C)。如圖60步驟D中所示，核酸外切酶消化會移除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下適用于使用任何本文所述的方法進行環(huán)形測序的所需單鏈環(huán)狀連接產(chǎn)物。在圖61中所描繪的實施方案中，雙鏈體探針的第一寡核苷酸探針含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′側(cè)互補的序列，所述序列被其它核苷酸部分隔開。此外，第一寡核苷酸探針還具有任選的5′摘獲基團(“Z”)(圖61，步驟B)。在HphI消化PCR片段和第二寡核苷酸探針之間的兩個連接結(jié)處連接形成環(huán)化連接產(chǎn)物(圖61，步驟C)后，具有鏈置換活性的聚合酶(實心菱形)使用環(huán)化連接產(chǎn)物作為模板延伸第一寡核苷酸探針(圖61，步驟D)。滾環(huán)擴增產(chǎn)生包含與環(huán)化連接產(chǎn)物互補的串聯(lián)線性序列的初級延伸產(chǎn)物(圖61，步驟D)。初級延伸產(chǎn)物適用于使用本文所述的方法測序。可以在滾環(huán)擴增之前或之后將5′Z基團摘獲在固體載體上。一旦被摘獲，與引物結(jié)合的環(huán)狀連接產(chǎn)物或其延伸物可以經(jīng)由在可裂解連接處的裂解從固體載體釋放，無論是在滾環(huán)擴增之前或之后。圖62示出了用于發(fā)現(xiàn)在cfDNA或剪切的總基因組DNA的已知基因組區(qū)域中的未甲基化相鄰HphI位點的過程。基因組DNA(無論是從全細(xì)胞分離的，還是作為血漿中的cfDNA)包含通過天然酶促過程或剪切形成的末端。需要通過將短接頭附接至DNA末端的3′和5′端(例如，經(jīng)由連接附接接頭)來阻斷這些末端用于后續(xù)步驟。如圖62步驟A中所示，5′端接頭包含阻斷基團(粗黑線)。用亞硫酸氫鹽處理附接有接頭的DNA以將未甲基化C’轉(zhuǎn)化為U’。如圖62步驟B中所示，利用5′阻斷型引物進行的有限PCR擴增產(chǎn)生未甲基化雙鏈產(chǎn)物。當(dāng)被HphI(實心三角形)裂解時，只有在原始靶中未甲基化的相鄰HphI位點(未甲基化GGCGA->GGTGA)產(chǎn)生未被阻斷的片段。如圖62步驟C中所示，將包含獨特標(biāo)識符序列和/或患者標(biāo)識符序列的接頭(灰色填充雙線)附接至HphI裂解的DNA片段。所述接頭含有3′端阻斷基團或含硫代磷酸根的主鏈(****)以抑制隨后被3′-核酸外切酶(實心三角形)消化。只有兩側(cè)都附接有接頭的片段仍將為雙鏈。如圖62的步驟D中所示，接頭的游離端通過以下方式具備連接能力：(i)使5′端磷酸化；(ii)去除3′阻斷基團；或(iii)使用5′核酸酶活性裂解掉匹配的5′重疊堿基或側(cè)翼以產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根；或(iv)：(i)、(ii)、(iii)的任何組合。連接(實心圓)條件被設(shè)計成有利于寡聚作用。如圖62步驟E中所示，連接產(chǎn)物包含在最初在基因組DNA中未甲基化的相鄰HphI序列內(nèi)的被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA未甲基化的補體，具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生集合的不同環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體的另一種合適的方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異或一個或多個甲基化殘基的一個或多個靶基因組DNA區(qū)段的樣品以及將核苷酸接頭序列附接至所述靶基因組DNA區(qū)段的3′和5′端。附接的核苷酸接頭任選地包含：(i)患者標(biāo)識符序列；(ii)第一固體載體引物特異性部分；(iii)第二固體載體引物特異性部分；和/或(iv)獨特標(biāo)識符序列。提供一個或多個第一寡核苷酸探針，其中每個第一寡核苷酸探針包含：(a)與所述附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段的3′接頭部分互補的部分；(b)與所述附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段的5′接頭部分互補的部分；和(c)任選的其它部分。所述其它部分任選地包含：(i)患者標(biāo)識符序列；(ii)第一固體載體引物特異性部分；(iii)第二固體載體引物特異性部分；和/或(iv)獨特標(biāo)識符序列。在有效地使第一寡核苷酸探針的3′和5′部分以堿基特異性方式與所述附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段(如果存在于所述樣品中)的互補接頭雜交的條件下，使所述樣品與所述一個或多個第一寡核苷酸探針接觸。產(chǎn)生了適用于連接雜交至第一寡核苷酸探針的附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段的3′和5′端的一個或多個可連接結(jié)。所述附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段在一個或多個連接結(jié)處的連接形成所述集合的不同的環(huán)狀嵌合單鏈核酸構(gòu)建體。圖63示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的示例性相關(guān)過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條，圖63，步驟A)。描繪于圖63的右圖中的過程的附接接頭包含可連接的5’磷酸根基團，而描繪于圖63的左圖中的過程的附接接頭不包含可連接的5’磷酸根基團。含有與靶DNA區(qū)段的5′和3′接頭互補的核苷酸序列和5′阻斷基團的寡核苷酸探針(粗黑線)與它們的相應(yīng)靶DNA區(qū)段雜交(圖63，步驟A)。所述寡核苷酸探針的接頭特異性部分被其它部分隔開。該其它部分包含任選的獨特標(biāo)識符部分和/或患者標(biāo)識符部分和/或一條或多條引物結(jié)合序列。聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′接頭端，形成與靶DNA區(qū)段的5′接頭端的連接結(jié)(圖63，步驟B)。在圖63步驟C中所示的實施方案中，具有5′-核酸酶活性的聚合酶在延伸后裂解5′接頭上的匹配的5′-重疊堿基，生成可連接的5′-磷酸根。在圖63步驟C的右圖中所描繪的實施方案中，可以利用缺乏5′→3′核酸酶活性的聚合酶，因為靶DNA區(qū)段的5′接頭包含可連接的5′端。聚合酶還使用雜交的環(huán)化靶DNA區(qū)段作為模板來延伸寡核苷酸探針的3′端，直到其達到所述探針的5′阻斷基團。如圖63的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封DNA區(qū)段的延伸的3′端和5′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。寡核苷酸探針上的5′阻斷基團防止聚合酶延伸的寡核苷酸探針的環(huán)化。如圖63的步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下所需的單鏈環(huán)化DNA連接產(chǎn)物。這些環(huán)化連接產(chǎn)物適于任選用獨特或重復(fù)序列(例如，四核苷酸重復(fù))捕獲，或使用獨特靶向引物進行滾環(huán)延伸，以及后續(xù)測序。圖64示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在此實施方案中，靶基因組DNA區(qū)段是具有適于連接或延伸的5′和3′端的雙鏈靶基因組DNA區(qū)段(圖64，步驟B)。靶基因組DNA區(qū)段附接有核苷酸接頭序列。根據(jù)這個實施方案，所述核苷酸接頭包括第一和第二接頭寡核苷酸，其中(i)第一接頭寡核苷酸包含5′單鏈部分、一個或多個可裂解核苷酸或核苷酸類似物、獨特標(biāo)識符序列、與第二接頭寡核苷酸互補的3′端和3′-OH；以及(ii)第二接頭寡核苷酸包含5′-OH端、與第一接頭寡核苷酸互補的5′部分和任選的3′-阻斷端。第二接頭寡核苷酸與第一接頭寡核苷酸的其互補部分雜交形成適于附接至靶基因組DNA區(qū)段的復(fù)合接頭。如圖64步驟C-D中所示，在適用于以下目的的條件下?lián)交焖鲭p鏈靶基因組DNA與所述復(fù)合接頭、連接酶和聚合酶：(i)所述復(fù)合接頭的第一接頭寡核苷酸的3′-OH連接至所述雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的5′端；(ii)聚合酶延伸所述雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的3′端，以形成所述復(fù)合接頭的第一接頭寡核苷酸的互補拷貝；和(iii)裂解所述一個或多個可裂解核苷酸或核苷酸類似物，以形成附接有接頭的靶基因組DNA區(qū)段。含有與靶DNA區(qū)段的接頭的5′和3′單鏈部分互補的核苷酸序列的寡核苷酸探針(細(xì)黑雙線)與它們的相應(yīng)靶DNA區(qū)段雜交(圖64，步驟F)。所述寡核苷酸探針包含患者標(biāo)識符序列、引物結(jié)合位點和在3′端上的錯配尾。聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′接頭端，形成與靶DNA區(qū)段的5′接頭端的連接結(jié)(圖64，步驟G)。如圖64的步驟H中所示，連接酶(實心圓)共價密封附接有接頭的DNA區(qū)段的3′和5′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。這些環(huán)化連接產(chǎn)物適于任選用獨特或重復(fù)序列(例如，四核苷酸重復(fù))摘獲，或使用獨特靶向引物進行滾環(huán)延伸，以及后續(xù)測序。圖65示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的示例性相關(guān)過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。所述過程開始于將包含單鏈部分(細(xì)黑雙線)和雙鏈部分(粗黑條)的復(fù)合接頭連接到DNA區(qū)段的3′和5′端上(圖65，步驟A)。描繪于圖65步驟B(右圖)中的過程的附接接頭包含可連接的5’磷酸根基團，而描繪于圖65步驟B(左圖)中的過程的附接接頭不包含可連接的5’磷酸根基團。含有與靶DNA區(qū)段的接頭的5′和3′單鏈部分互補的核苷酸序列的寡核苷酸探針(細(xì)黑雙線)與它們的相應(yīng)靶DNA區(qū)段雜交。聚合酶(實心菱形)延伸雜交的靶DNA區(qū)段的3′接頭端，形成與靶DNA區(qū)段的5′接頭端的連接結(jié)(圖65，步驟C)。在圖65步驟C中所示的實施方案中，具有5′-核酸酶活性的聚合酶在延伸后裂解5′接頭上的匹配的5′-重疊堿基，生成可連接的5′-磷酸。如圖65的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封附接有接頭的DNA區(qū)段的3′和5′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。如圖65的步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下所需的單鏈環(huán)化DNA連接產(chǎn)物。這些環(huán)化連接產(chǎn)物適于任選用獨特或重復(fù)序列(例如，四核苷酸重復(fù))捕獲，或使用獨特靶向引物進行滾環(huán)延伸，以及后續(xù)測序。用于附接接頭的標(biāo)準(zhǔn)方法圖解說明于圖66中并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。利用具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶(諸如T4聚合酶或DNA聚合酶I大(克列諾(Klenow))片段)修復(fù)DNA片段的末端，這延伸凹陷的3’端或降解3’懸突端，直到它們與5’端齊平(圖66，步驟A)。用T4激酶使5’端磷酸化，并用缺乏3’-＞5’核酸酶活性的DNA聚合酶I大(克列諾)片段將額外的A堿基附接至3’端(圖66，步驟B和C)。使用T4連接酶連接在具有3′T懸突的接頭上(圖66，步驟D)。在這幅圖中，使用接頭的引物部分1和3分別確定任選的患者標(biāo)識符序列和獨特標(biāo)識符序列1和2。使用引物部分2和3’分別測定正向和反向靶DNA的序列。這個產(chǎn)物適用于使原始靶上鏈或下鏈環(huán)化，如上文圖63和65中所示。雖然標(biāo)準(zhǔn)方法提供在接頭的單鏈部分上引入獨特序列的機會，但這些序列不允許上鏈序列與下鏈序列精確匹配。為得到這類構(gòu)建體，如圖67中所示修改標(biāo)準(zhǔn)方法。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。利用具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶(諸如T4聚合酶或DNA聚合酶I大(克列諾)片段)修復(fù)DNA片段的末端，這延伸凹陷的3’端或降解3’懸突端，直到它們與5’端齊平(圖67，步驟A)。任選地用T4激酶使5’端磷酸化(圖67，步驟B)，并利用缺乏3’→5’核酸酶活性的DNA聚合酶I大(克列諾)片段將A堿基懸突添加至3’端。在此實施方案中，接頭序列包含第一、第二和第三寡核苷酸。第一寡核苷酸包含第一固體載體引物特異性部分、一條或多條第一患者標(biāo)識符序列、第一測序引物結(jié)合位點和與第三寡核苷酸互補的3′端。第二寡核苷酸包含與第三寡核苷酸的5’端互補的區(qū)域，且第三寡核苷酸包含與第二寡核苷酸互補的5’端、第二測序引物結(jié)合位點、與第一寡核苷酸的3’端互補的部分、第二患者標(biāo)識符序列和第二固體載體引物特異性部分。第三寡核苷酸與第一和第二寡核苷酸的互補部分雜交形成復(fù)合接頭。如圖67，步驟D中所示，雙鏈靶基因組DNA區(qū)段與復(fù)合接頭、連接酶和聚合酶在適用于將復(fù)合接頭的第二和第三寡核苷酸分別連接至雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的5’和3’端的條件下?lián)交?。聚合酶延伸?fù)合接頭的第一寡核苷酸的3’端，以產(chǎn)生與復(fù)合接頭的第二寡核苷酸的5’端上的連接結(jié)(圖67，步驟E)。如果復(fù)合接頭的第二寡核苷酸的5’端未被磷酸化，聚合酶應(yīng)具有5’-3’核酸酶活性，以釋放適合連接的5’磷酸根。如果第二寡核苷酸的5’端被磷酸化，聚合酶應(yīng)缺乏5’-3’核酸酶活性，從而允許一直延伸到接頭，隨后以連接酶密封缺口。如圖67步驟E中所示，連接酶在所述連接結(jié)處共價密封復(fù)合接頭的第一和第二寡核苷酸，以形成附接接頭的雙鏈靶基因組DNA。在這個實施方案中，使用接頭的引物部分1和3分別確定任選的患者標(biāo)識符序列1和2(參見圖67，步驟F)。使用接頭的引物部分2和3’分別測定正向和反向靶DNA以及獨特標(biāo)識符序列1和2的序列。這個產(chǎn)物適用于使原始靶鏈的每條鏈環(huán)化，如上文圖63和65中所示。在測定這些鏈的序列時，獨特標(biāo)識符序列1和2將能夠使得上鏈序列與下鏈序列精確匹配，因而允許獨立地驗證原始靶分子的兩條鏈上的低豐度突變。圖68例示另一種將引物序列附接至靶DNA，使得它適用于產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體，并允許上鏈序列與下鏈序列精確匹配的方法。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。利用具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶(諸如T4聚合酶或DNA聚合酶I大(克列諾)片段)修復(fù)DNA片段的末端，這延伸凹陷的3’端或降解3’懸突端，直到它們與5’端齊平(圖68，步驟A)。任選地用T4激酶使5’端磷酸化(圖68，步驟B)。逆轉(zhuǎn)錄酶如莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLVRT，NewEnglandBiolabs)或SuperscriptII或III逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)將三個C堿基附接至每個靶的3’端(圖68，步驟C)。在這個實施方案中，接頭序列包含(i)在3’端包含第一固體載體引物特異性部分、一條或多條第一患者標(biāo)識符序列、第一測序引物結(jié)合位點和核糖鳥苷堿基的第一接頭寡核苷酸，和(ii)包含第二測序引物結(jié)合位點、第二患者標(biāo)識符序列、第二固體載體引物特異性部分和與所述第一寡核苷酸互補的5’部分的第二接頭寡核苷酸。雙鏈靶基因組DNA區(qū)段與接頭序列、逆轉(zhuǎn)錄酶和連接酶摻混形成逆轉(zhuǎn)錄連接反應(yīng)混合物。第一接頭寡核苷酸的核糖鳥苷堿基與雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的3’胞嘧啶懸突雜交(圖68，步驟D)。逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)歷鏈轉(zhuǎn)換，且雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的3’雜交端經(jīng)過延伸產(chǎn)生與第一接頭寡核苷酸的第一患者標(biāo)識符序列互補的序列和與第二接頭寡核苷酸的5’端的連接結(jié)(圖68，步驟D)。雙鏈靶基因組DNA區(qū)段的延伸3’端連接至第二寡核苷酸的5’端的連接結(jié)。RNA酶H2裂解第一接頭寡核苷酸的核糖鳥苷堿基，從而釋放適合聚合酶介導(dǎo)的延伸的3’OH(圖68，步驟E)。延伸第一接頭寡核苷酸的3’端，并連接至雙鏈靶基因組DNA的5’端(圖68，步驟F)。如果第二接頭或靶DNA的5’端未被磷酸化，聚合酶應(yīng)具有5’-3’核酸酶活性，以釋放適合連接的5’磷酸根。如果第二接頭和靶被磷酸化，如圖68中所示，聚合酶應(yīng)缺乏5’-3’核酸酶活性，從而允許分別一直延伸至第二引物或靶的5’端，隨后以連接酶密封缺口。如圖68，步驟G中所示，使用接頭的引物部分1和3分別測定任選的患者標(biāo)識符序列1和2。使用接頭的引物部分2和3’分別測定正向和反向靶DNA以及獨特標(biāo)識符序列1和2的序列。這個產(chǎn)物適用于使原始靶鏈的每條鏈環(huán)化，如上文圖63和65中所示。在測定這些鏈的序列時，獨特標(biāo)識符序列1和2將能夠使得上鏈序列與下鏈序列精確匹配，因而允許獨立地驗證原始靶分子的兩條鏈上的低豐度突變。圖69例示另一種將引物序列附接至靶DNA，使得它適用于產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體。在這個實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。使片段變性，以使靶成為單鏈(圖69，步驟A)。使用dATP和ATP的混合物，利用末端轉(zhuǎn)移酶給3’端加上尾，以使得平均添加50-100個堿基，且在最初的30個堿基中并入至少一個可裂解rATP(圖69，步驟B)。根據(jù)這個實施方案，提供一組或多組寡核苷酸，其中每個組包含i)包含第二固體載體引物特異性部分、一條或多條患者標(biāo)識符序列、測序引物結(jié)合位點和與靶基因組DNA區(qū)段的延伸區(qū)域互補的包含一個或多個可裂解核苷酸的單核苷酸重復(fù)區(qū)域的引物寡核苷酸，和(ii)包含第一固體載體引物特異性部分、一條或多條患者標(biāo)識符序列、測序引物結(jié)合位點的第一接頭寡核苷酸。第一接頭寡核苷酸在其3’具有兩個核糖鳥苷堿基和鎖核酸尿苷堿基(rGrG+G)。如圖69，步驟B中所描繪，所述過程涉及使含有5’引物結(jié)合位點(3和4)、任選的患者和獨特標(biāo)識符(2)、3’端的(T，dU)30VN序列和可裂解連接處(dU)的引物寡核苷酸與靶基因組DNA的末端轉(zhuǎn)移酶延伸區(qū)域雜交(圖69，步驟B)。逆轉(zhuǎn)錄酶如莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLVRT，NewEnglandBiolabs)或SuperscriptII或III逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)延伸引物，以得到靶的全長拷貝，并將三個C堿基附接至延伸靶序列的3’端(圖68，步驟C)。具有3'rGrG+G的第一接頭寡核苷酸與延伸靶序列的三個C堿基雜交，如圖68，步驟C中所示。逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)歷鏈轉(zhuǎn)換，并拷貝第一接頭寡核苷酸(圖69，步驟D)。RNA酶H2裂解RNA堿基，釋放A尾巴中以及鄰近第一接頭寡核苷酸的rGrG+G的DNA的3’OH(圖69，步驟D).具有5’→3’核酸酶活性的聚合酶復(fù)制引物寡核苷酸區(qū)域，延伸第一接頭寡核苷酸并釋放靶DNA上的5’磷酸根(圖69，步驟F)。連接酶密封第一接頭寡核苷酸的缺口，以將第一接頭連接至原始靶鏈(圖69，步驟G)。隨后，將缺口引入引物寡核苷酸的可裂解連接處(例如dU的UDG裂解)，使得靶的拷貝將不會經(jīng)歷進一步擴增，因其缺乏第一引物結(jié)合區(qū)域。在這幅圖中，使用引物部分1和3分別測定任選的患者標(biāo)識符序列和獨特標(biāo)識符序列1和2(圖69，步驟H)。使用引物部分2和3’分別測定正向和反向靶DNA的序列。當(dāng)使用引物3’時，對于初始環(huán)，使用沒有終止子的TTP，使得儀器不耗費時間來給T30區(qū)域測序。這個產(chǎn)物適用于使原始靶上鏈或下鏈環(huán)化，如上文圖63和65中所示。圖70示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條，圖70，步驟A)。所附接的接頭的5′端任選地包含可連接的磷酸根。含有與靶DNA區(qū)段的獨特或重復(fù)部分(即，AGAT重復(fù))以及接頭的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖70步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還包含其它部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、可連接的5’磷酸根和可裂解連接(dU)中的一個或多個。聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段和寡核苷酸探針的雜交3′端(圖70，步驟C)，以分別形成與靶DNA區(qū)段和探針的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶片段或探針上不存在可連接的5’磷酸根的情況下，聚合酶5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。如圖70的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針和靶區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)引入缺口。如圖70的步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含連接至獨特標(biāo)識符序列的原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖71示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或獨特序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條/白條，圖71，步驟A)。所附接的接頭的5′端任選地包含可連接的磷酸根。含有與靶DNA區(qū)段的獨特序列以及接頭的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖71步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還包含其它部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、任選的可連接的5’磷酸根和任選的可裂解連接(dU)中的一個或多個。在一個實施方案中，所述寡核苷酸探針的3′端進一步包括一些額外的堿基和一個阻斷基團，其被釋放，以形成只有在與作為阻斷基團的靶標(biāo)(例如核糖核苷酸堿基)和作為裂解核酸酶的RNA酶H2(星)雜交時被核酸酶裂解的游離3’OH(圖71，步驟C)。聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段和寡核苷酸探針的雜交3′端(圖71，步驟C)，以分別形成與靶DNA區(qū)段和探針的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶片段或探針上不存在可連接的5’磷酸根的情況下，聚合酶5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。如圖71的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針和靶區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)引入缺口。如圖71的步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含連接至任選的患者標(biāo)識符序列或獨特標(biāo)識符序列的原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖72示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或獨特序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條/白條，圖72，步驟A)。所附接的接頭的5′端任選地包含可連接的磷酸根。含有與靶DNA區(qū)段的獨特序列以及接頭的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖71步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還包含其它部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、可連接的5’磷酸根和任選的可裂解連接(dU)中的一個或多個。在一個實施方案中，所述寡核苷酸探針的3′端進一步包括一些額外的堿基和一個阻斷基團，其被釋放，以形成只有在與作為阻斷基團的靶(例如核糖核苷酸堿基)和作為裂解核酸酶的RNA酶H2(星)雜交時被核酸酶裂解的游離3’OH。當(dāng)寡核苷酸探針雜交到靶上時，釋放的3′OH端現(xiàn)在適用于直接連接到5′磷酸化末端(圖72，步驟C)。聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段的雜交3′端(圖72，步驟C)，以形成與靶DNA區(qū)段的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶片段的接頭上不存在可連接的5’磷酸根的情況下，聚合酶5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。如圖72的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封靶區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)引入缺口。如圖72的步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含連接至任選的患者標(biāo)識符序列或獨特標(biāo)識符序列的原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖73示出以雜交的靶-特異性寡核苷酸產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的示例性過程，所述產(chǎn)物適于引發(fā)如上文所述的滾環(huán)擴增和測序。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或獨特序列。所述過程開始于將包含單鏈部分(細(xì)黑雙線)和雙鏈部分(粗黑條)的復(fù)合接頭連接到DNA區(qū)段的3′和5′端上(圖73，步驟A)。圖73左圖中所描繪的過程的附接接頭含有可連接的5’磷酸根基團，而圖73右圖中所描繪的過程的附接接頭不含可連接的5’磷酸根基團。含有與靶DNA區(qū)段(粗黑線)的獨特序列以及附接至靶DNA區(qū)段的接頭(細(xì)黑雙線)的5′和3′單鏈部分互補的核苷酸序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖73步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還含有任選的獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、在5′端上的任選磷酸以及一個或多個可裂解連接(dU)。在一個實施方案中，所述寡核苷酸探針的3′端進一步包括一些額外的堿基和一個阻斷基團，其被釋放，以形成只有在與作為阻斷基團的靶(例如核糖核苷酸堿基)和作為裂解核酸酶的RNA酶H2(星)雜交時被核酸酶裂解的游離3’OH。聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段和寡核苷酸探針的雜交3′端(圖73，步驟C)，以分別形成與靶DNA區(qū)段和探針的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶片段或探針上不存在可連接的5’磷酸根的情況下，聚合酶5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。如圖73的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針和靶區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)引入一個或多個缺口。如圖73的步驟E中所示，裂解的寡核苷酸片段從靶DNA上脫落，只留下具有靶標(biāo)特異性雜交引物的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增、任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖74描繪以雜交的靶-特異性寡核苷酸產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一個示例性過程，所述產(chǎn)物適于引發(fā)如上文所述的滾環(huán)擴增和測序。這個實施方案的步驟與圖73，步驟A-E中所示實施方案類似。然而，在這個實施方案中，寡核苷酸探針還包含將產(chǎn)物捕獲在固體載體(即鏈霉親和素涂覆的固體載體)上的捕獲基團(Z)(即生物素)。如圖74的步驟E中所示，裂解的寡核苷酸片段從靶DNA上脫落，只留下具有靶標(biāo)特異性雜交引物的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體，所述靶標(biāo)特異性雜交引物還含有用于后續(xù)捕獲步驟的捕獲基團(Z)。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增、任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖75示出以雜交的靶-特異性寡核苷酸產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一個示例性過程，所述產(chǎn)物適于引發(fā)如上文所述的滾環(huán)擴增和測序。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或獨特序列。所述過程開始于將包含單鏈部分(細(xì)黑雙線)和雙鏈部分(粗黑條)的復(fù)合接頭連接到DNA區(qū)段的3′和5′端上(圖75，步驟A)。圖75左側(cè)所描繪的過程的附接接頭含有可連接的5’磷酸根基團，而圖75右側(cè)所描繪的過程的附接接頭不含可連接的5’磷酸根基團。含有與靶DNA區(qū)段(粗黑線)的獨特序列以及靶DNA區(qū)段的附接接頭(細(xì)黑雙線)的5′和3′單鏈部分互補的核苷酸序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖75步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還任選地含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、在5′端上的任選磷酸以及一個或多個可裂解連接(dU)。在一個實施方案中，所述寡核苷酸探針的3′端進一步包括一些額外的堿基和一個阻斷基團，其被釋放，以形成只有在與作為阻斷基團的靶(例如核糖核苷酸堿基)和作為裂解核酸酶的RNA酶H2(星)雜交時被核酸酶裂解的游離3’OH。因為寡核苷酸探針的末端在RNA酶H2裂解之后彼此相鄰，所以它們適用于用連接酶密封(圖75，步驟C)。聚合酶(實心菱形)延伸靶DNA區(qū)段的雜交3′端(圖75，步驟C，右圖)，以形成與靶DNA區(qū)段的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶片段上不存在可連接的5’磷酸根的情況下，聚合酶5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。如圖75的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封靶區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)引入一個或多個缺口。如圖75的步驟E中所示，裂解的寡核苷酸片段從靶DNA上脫落，只留下具有靶標(biāo)特異性雜交引物的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增、任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖76是以雜交的靶-特異性寡核苷酸產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一個示例性過程，所述產(chǎn)物適于如上文所述的滾環(huán)擴增和測序。該實施方案的步驟類似于在圖75步驟A-E中所描繪的那些。然而，在這個實施方案中，寡核苷酸探針還包含將產(chǎn)物捕獲在固體載體(即鏈霉親和素涂覆的固體載體)上的摘獲基團(Z)(即生物素)。如圖76的步驟E中所示，裂解的寡核苷酸片段從靶DNA上脫落，只留下具有靶標(biāo)特異性雜交引物的包含原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體，所述靶標(biāo)特異性雜交引物還含有用于后續(xù)捕獲步驟的摘獲基團(Z)。最終產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增、任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖77示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條，圖77，步驟A)。所附接的接頭的5′端任選地包含可連接的磷酸(圖77，步驟B，左圖)。含有與靶DNA區(qū)段的獨特或重復(fù)部分(即，AGAT重復(fù))以及附接接頭的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交(如圖77步驟B中所示)。所述寡核苷酸探針還包含其它部分，其含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、可連接的5’磷酸根和可裂解連接(dU)中的一個或多個。圖77，步驟C示出了3個dNTP(即dTTP、dCTP、dATP)用于聚合酶(實心菱形)介導(dǎo)靶DNA區(qū)段和寡核苷酸探針的3’端的延伸的用途。靶DNA區(qū)段的3′端的延伸形成與靶DNA區(qū)段的相應(yīng)5′端的連接結(jié)。在靶DNA區(qū)段上不存在可連接的5’磷酸根的情況下(圖77，步驟C)，聚合酶的5′-核酸酶活性裂解匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生可連接的5′-磷酸根。在圖77的步驟D中，連接酶(實心圓)共價密封靶DNA區(qū)段的相鄰末端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含連接至獨特標(biāo)識符序列的原始靶DNA區(qū)段的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖78示出了用于產(chǎn)生如上所述的適于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這些實施方案中，原始基因組區(qū)段包括cfDNA的區(qū)段(～160bp)或剪切基因組DNA的區(qū)段(～160bp)，它們含有例如腫瘤特異性突變、SNP或多態(tài)性重復(fù)序列。所述過程開始于將短接頭連接到DNA區(qū)段的3’和5’端上(粗黑條，圖78，步驟A)。所述過程的附接接頭含有獨特標(biāo)識符序列，以及任選的患者標(biāo)識符序列和可連接的5’磷酸根基團。如圖78步驟B中所示，含有與靶DNA區(qū)段的獨特或重復(fù)部分(即，AGAT重復(fù))以及附接接頭的5′和3′側(cè)互補的序列的寡核苷酸探針與其相應(yīng)的靶DNA區(qū)段雜交。所述寡核苷酸探針還包含任選的可裂解連接(dU)和5′可連接的磷酸根基團。當(dāng)附接靶DNA區(qū)段的接頭的5′端和/或寡核苷酸探針的5′端不含有可連接的5′端(圖78，左圖)，而是包含側(cè)翼或重疊堿基(圖78，步驟B，右圖)，5′-核酸酶活性(實心菱形)在匹配5′-重疊堿基或側(cè)翼處裂解，留下可連接的-5′-磷酸根(圖78，步驟C)。如圖78的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針和靶DNA區(qū)段的相鄰末端，形成環(huán)狀互鎖連接產(chǎn)物。隨后，在寡核苷酸探針的可裂解連接(例如，dU的UDG裂解，實心三角形)處引入缺口，且核酸外切酶消化去除所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含連接至獨特標(biāo)識符序列的原始基因組靶DNA的所需單鏈環(huán)狀DNA。最終產(chǎn)物適用于任選的額外步驟和后續(xù)測序。圖63、65和70-78中例示用于產(chǎn)生適用于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的程序，以及圖66、67、68和69中例示用于在產(chǎn)生嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的過程中將接頭附接至靶DNA上的程序的共同點是否將原始靶DNA摘獲進入單鏈環(huán)中。在一些實施方案中，寡核苷酸探針提供了一些靶選擇性(圖70-78)，并且在一些情況下，產(chǎn)品既包括單鏈環(huán)中的原始靶DNA以及適用于滾環(huán)擴增或直接捕獲和后續(xù)測序的靶標(biāo)特異性雜交引物(圖73-76)。對于其中最終產(chǎn)物是嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶沒有雜交的引物的那些方法，圖79-81舉例說明了三種用于以非常高的特異性雜交靶標(biāo)特異性引物，接著摘獲，洗去非靶核酸，以及隨后滾環(huán)擴增的不同方法。圖79示出了用于富集如上所述的適于測序的所需靶標(biāo)特異性嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的示例性過程。靶標(biāo)特異性寡核苷酸引物經(jīng)設(shè)計包含阻斷3’基團，如果且只有與靶雜交時，所述基團通過可裂解核糖核苷酸連接處的RNA酶H2裂解釋放(Dobosy等人，“RNA酶H-DependentPCR(rhPCR)：ImprovedSpecificityandSingleNucleotidePolymorphismDetectionUsingBlockedCleavablePrimers，”BMCBiotechnol.11：80(2011)，該文獻以引用的方式整體并入本文中)以及任選的5’捕獲基團(例如，生物素部分)(參見圖79，步驟B)。包含所需靶的環(huán)狀DNA通過引物上的摘獲基團將雜交引物/環(huán)構(gòu)建體捕獲在固體載體上富集，例如，鏈霉親和素捕獲生物素部分。通過洗滌移除不含靶的環(huán)。在可裂解連接處引入缺口(例如核糖核苷酸r的RNA酶裂解)，以從固體載體釋放含靶的環(huán)，并在引物上產(chǎn)生3’-OH基團。具有鏈置換活性的聚合酶延伸引物的釋放3’端，以進行滾環(huán)擴增(參見圖80，步驟B)。該延伸產(chǎn)物適用于后續(xù)測序。圖80示出了用于富集如上所述的適于測序的所需靶標(biāo)特異性嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這個實施方案中，靶標(biāo)特異性寡核苷酸引物經(jīng)設(shè)計以包含5’15-20個堿基的錨序列、3-5個錯配堿基、6-10個與靶互補的匹配堿基(Chun等人，“DualPrimingOligonucleotideSystemfortheMultiplexDetectionofRespiratoryVirusesandSNPGenotypingofCYP2C19Gene，”NucleicAcidsRes.35(6)：e40(2007)，該文獻以引用的方式整體并入本文中)。如圖79中所示，寡核苷酸引物還包含阻斷3’基團，如果且只有在于靶雜交時，所述基團才在可裂解核糖核苷酸連接處通過RNA酶H2裂解釋放；以及任選的5’捕獲基團(即生物素部分)(參見圖80，步驟B)。包含所需靶的環(huán)狀DNA通過捕獲基團將雜交引物/環(huán)構(gòu)建體捕獲在固體載體上富集，例如，鏈霉親和素捕獲生物素部分。通過洗滌移除不含靶的環(huán)。在可裂解連接處引入缺口(例如核糖核苷酸r的RNA酶裂解)，以從固體載體釋放含靶的環(huán)，并在引物上產(chǎn)生3’-OH基團(圖80，步驟C)。具有鏈置換活性的聚合酶延伸引物的釋放3’端，以進行滾環(huán)擴增(圖80，步驟D)。該延伸產(chǎn)物適用于后續(xù)測序。圖81示出了用于富集如上所述的適于測序的所需靶標(biāo)特異性嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的另一種示例性過程。在這個實施方案中，兩個相鄰寡核苷酸與環(huán)狀構(gòu)建體的靶標(biāo)特異性部分雜交。上游寡核苷酸引物包含任選的5’捕獲基團(例如，生物素部分)。下游寡核苷酸引物經(jīng)設(shè)計包含5’磷酸根和阻斷3’基團，如果且只有與靶雜交時，阻斷3’基團通過可裂解核糖核苷酸連接處的RNA酶H2裂解釋放(圖81，步驟B)。在靶存在下，連接酶將兩個寡核苷酸彼此共價連接(圖81，步驟B)。包含所需靶的環(huán)狀DNA可以通過摘獲基團將雜交引物/環(huán)狀構(gòu)建體捕獲在固體載體上富集，例如，鏈霉親和素捕獲生物素部分。通過洗滌移除不含靶的環(huán)。在可裂解連接處引入缺口(例如核糖核苷酸r的RNA酶裂解)，以從固體載體釋放含靶的環(huán)，并在下游寡核苷酸上產(chǎn)生3’-OH基團(圖81，步驟C)。具有鏈置換活性的聚合酶延伸釋放3’端，以進行滾環(huán)擴增(圖81，步驟D)。該延伸產(chǎn)物適用于后續(xù)測序。因此，圖55、56、65、70和71-78中例示用于產(chǎn)生適用于測序的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體的程序，以及圖79-81中例示的程序提供用于產(chǎn)生具有雜交的靶標(biāo)特異性或引物結(jié)合位點引物的嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體，且適用于滾環(huán)擴增，隨后接著測序的實施例。圖82-89例示用于捕獲或進一步富集所需靶的不同策略。圖82示出了用于靶富集的示例性過程。在這個實施方案中，利用鏈置換聚合酶延伸與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體雜交的靶標(biāo)特異性引物，以產(chǎn)生包含兩個或更多個串聯(lián)拷貝的串聯(lián)拷貝的嵌合環(huán)狀單鏈構(gòu)建體的單鏈延伸產(chǎn)物(圖82，步驟B)。與延伸產(chǎn)物互補的寡核苷酸雜交。這些寡核苷酸任選地含有阻斷或錯配3’端，并在5’端含有捕獲基團Z(例如，生物素部分)(圖82，步驟C)。將靶標(biāo)特異性串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物捕獲在固體載體上，并洗滌掉其它核酸。將寡核苷酸捕獲在固體載體上使串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物變性(圖82，步驟C)。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖83示出了用于靶標(biāo)特異性富集的另一個示例性過程。在這個實施方案中，靶標(biāo)特異性寡核苷酸引物與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶雜交，且在5’端包含捕獲基團Z(即生物素部分)。嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體被捕獲在固體載體上，且其它核酸被洗掉(圖83，步驟A)。利用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶延伸原始雜交引物，以在聚合酶裂解含有捕獲基團的雜交寡核苷酸的5’部分時產(chǎn)生從固體載體如聚合酶裂解的帶缺口環(huán)(圖83，步驟B)。原始聚合酶通過加熱或蛋白酶失活。以鏈置換聚合酶延伸帶缺口環(huán)的3’端，以產(chǎn)生靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈(圖83，步驟C)。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖84示出了用于靶標(biāo)特異性富集的另一個示例性過程。在這個實施方案中，兩個靶標(biāo)特異性寡核苷酸與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶雜交，如圖84步驟B中所示。寡核苷酸的3’端任選地被阻斷或錯配，且在5’端含有捕獲基團Z(即生物素部分)。嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體被捕獲在固體載體上，且其它核酸被洗掉。使用具有鏈置換活性的聚合酶延伸一個雜交引物，以產(chǎn)生靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈，并從固體載體釋放延伸產(chǎn)物，如圖84，步驟C中所示。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖85示出了用于靶標(biāo)特異性富集的另一個示例性過程。在本實施例中，第一靶標(biāo)特異性寡核苷酸與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶雜交。該寡核苷酸的3’端任選地被阻斷或錯配，且在5’端含有捕獲基團Z(即生物素部分)。嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體被捕獲在固體載體上，且其它核酸被洗掉。第二靶標(biāo)特異性引物與捕獲的環(huán)狀構(gòu)建體雜交(圖85，步驟B)。引入具有鏈置換活性的聚合酶，以延伸第二引物，產(chǎn)生含有靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈延伸產(chǎn)物，并從固體載體釋放延伸產(chǎn)物(圖85，步驟C)。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖86和87示出了用于靶標(biāo)特異性富集的示例性過程。在這些實施方案中，引物結(jié)合位點引物與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶雜交，并利用鏈置換聚合酶延伸產(chǎn)生含有靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈延伸產(chǎn)物(圖86，步驟A-B和圖87，步驟A-B)。與延伸產(chǎn)物互補的靶標(biāo)特異性寡核苷酸雜交。所述雜交寡核苷酸的3’端任選地被阻斷或錯配，且在5’端含有捕獲基團Z(即生物素部分)。將靶標(biāo)特異性串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物捕獲在固體載體上，并洗滌掉其它核酸(圖86，步驟C和圖87，步驟C)。在圖86中，將寡核苷酸捕獲在固體載體上使串聯(lián)重復(fù)延伸產(chǎn)物變性(圖86，步驟D)。該延伸產(chǎn)物適用于測序。在圖87中，與延伸產(chǎn)物互補的其它靶標(biāo)特異性引物雜交。以鏈置換聚合酶延伸從固體載體釋放原始延伸產(chǎn)物，同時制備其它拷貝(圖87，步驟D)。原始延伸產(chǎn)物和其它拷貝適用于測序。圖88示出了用于靶標(biāo)特異性富集的另一個示例性過程。在這個實施方案中，第一靶標(biāo)特異性引物和第二引物結(jié)合位點特異性寡核苷酸與嵌合環(huán)狀單鏈核酸構(gòu)建體(參見圖88，步驟A-B)。第二寡核苷酸的3’端任選地被阻斷或錯配，且在5’端含有捕獲基團Z(即生物素部分)。嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體被捕獲在固體載體上，且其它核酸被洗掉。利用具有鏈置換活性的聚合酶延伸第一靶標(biāo)特異性雜交引物，以產(chǎn)生含有靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈延伸產(chǎn)物，并從固體載體釋放延伸產(chǎn)物。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖89示出了用于靶標(biāo)特異性富集的另一個示例性過程。在這個實施方案中，引物結(jié)合位點特異性寡核苷酸起初與嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體雜交。該寡核苷酸的3’端任選地被阻斷或錯配，且在5’端含有捕獲基團Z(即生物素部分)。嵌合環(huán)狀單鏈核酸靶構(gòu)建體被捕獲在固體載體上，且其它核酸被洗掉(圖89，步驟A)。第二靶標(biāo)特異性引物與捕獲的環(huán)狀構(gòu)建體雜交。使用具有鏈置換活性的聚合酶產(chǎn)生含有靶DNA的串聯(lián)拷貝的單鏈延伸產(chǎn)物，并從固體載體釋放所述延伸產(chǎn)物。該延伸產(chǎn)物適用于測序。圖90-99示出不同的寡核苷酸探針結(jié)構(gòu)的重疊效果。每幅圖中的寡核苷酸探針的5’(上游)靶標(biāo)特異性部分、3’(下游)靶標(biāo)特異性部分、間隙長度和只有3’-或者5’-和3’-錨定末端存在差異，以覆蓋160核苷酸cfDNA靶區(qū)段。靶基因組DNA片段以10堿基增量移動，模擬通過核小體保護產(chǎn)生的所有可能160nt靶的“家族”。圖90示出適用于檢測源自cfDNA的附接所有可能的160個核苷酸接頭(黑條)的片段的寡核苷酸探針。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭附接末端，且含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、20堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、10堿基接頭特異性部分(黑條)和20堿基標(biāo)識符序列(5’靶標(biāo)特異性部分與接頭部分之間的細(xì)線，其示出在上游和下游特異性部分之下)。為了說明性目的使用20個堿基作為標(biāo)識符序列；當(dāng)如圖1中所示擴增和測序嵌合環(huán)狀DNA時，其可以含有12個堿基的獨特標(biāo)識符序列和8個堿基的患者標(biāo)識符序列?？商娲?，當(dāng)如圖4-12中所示使用患者標(biāo)識符、適用于固相捕獲的第一和第二引物特異性部分和測序引物結(jié)合區(qū)域時，標(biāo)識符部分可在40至80個堿基的范圍內(nèi)。圖13中提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖90中所示寡核苷酸探針上的3’靶標(biāo)特異性部分與接頭部分之間的長度變化的極細(xì)線對應(yīng)接近圖13-16中所示靶區(qū)段的3’端的成環(huán)區(qū)域的長度。由此可知，探針區(qū)域和與接頭區(qū)域互補的區(qū)域彼此物理連接。圖91中所示寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖90。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭附接末端，且含有80堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、20堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分、10堿基接頭特異性部分(粗黑條)和20-160堿基標(biāo)識符序列。圖13-16中也提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖92示出適用于檢測源自cfDNA的附接所有可能的核苷酸接頭(黑條)的片段的寡核苷酸探針的一種變型。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭附接末端，且含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、50堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、10堿基接頭特異性部分(黑條)和20-160堿基標(biāo)識符序列(5’靶標(biāo)特異性部分與接頭部分之間的細(xì)線)。使用20個堿基作為標(biāo)識符序列只是為了說明目的；如上文參照圖90所述的替代性長度也合適。圖13和15中提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖92中所示cfDNA片段的3’接頭與cfDNA的3’端之間的變化長度的極細(xì)線對應(yīng)圖13-16中所示寡核苷酸探針的成環(huán)區(qū)域的長度。由此可知，探針區(qū)域和與接頭區(qū)域互補的區(qū)域彼此物理連接。圖93中所示寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖92。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭附接末端，且含有80堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、50堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分、10堿基接頭特異性部分(粗黑條)、40堿基間隔基段和20-160堿基標(biāo)識符序列。圖13-16中提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖94示出適用于檢測源自cfDNA的附接所有可能的160個核苷酸接頭(黑條)的片段的寡核苷酸探針的一種輕微變型。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭附接末端，且含有50堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、50堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分(灰條)、10堿基3’接頭特異性部分(黑條)、10堿基5’接頭特異性部分(黑條)和20-80堿基標(biāo)識符序列(5’與3’靶標(biāo)特異性部分之間的細(xì)線，示出在灰條和接頭部分之下)。圖14中提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖94中示出的靶cfDNA片段的變化長度的極細(xì)線對應(yīng)圖14的寡核苷酸探針中的成環(huán)區(qū)域，且圖94的寡核苷酸探針的變化長度的極細(xì)線對應(yīng)圖17和18的靶DNA片段的成環(huán)區(qū)域。由此可知，探針區(qū)域和與接頭區(qū)域互補的區(qū)域彼此物理連接。圖95中所示寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖94。在這個實施方案中，寡核苷酸探針錨定至示出的cfDNA片段家族的3’-接頭和5’接頭附接末端。所述探針含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、60堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分、10堿基3’接頭特異性部分、10堿基5’接頭特異性部分和20-80堿基標(biāo)識符序列。圖17和18中也提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖96示出適用于檢測源自cfDNA的所有可能160個核苷酸非接頭附接片段的寡核苷酸探針設(shè)計的另一變型(深灰條)。在這個實施方案中，寡核苷酸探針含有50堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分(灰條和黑線)、50堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分(灰條和黑線)和20-80堿基標(biāo)識符序列(5’與3’靶標(biāo)特異性部分之間的細(xì)線，且示出在灰條之下)。灰色探針區(qū)域內(nèi)的短豎直黑線象征與原始靶單堿基錯配，使得可容易鑒定真正靶DNA和探針拷貝。圖23-26中提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖97中所示寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖96。在這個實施方案中，寡核苷酸探針含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、60堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基標(biāo)識符序列。圖23、24、25和26中也提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖98中所示的寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖96。在這個實施方案中，寡核苷酸探針含有70堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、70堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基標(biāo)識符序列。圖23、24、25和26中也提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖99中所示寡核苷酸探針設(shè)計類似于圖96。在這個實施方案中，寡核苷酸探針含有80堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、80堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基標(biāo)識符序列。圖23-26中也提供這幅圖的與其靶cfDNA片段雜交的寡核苷酸探針的例證。圖100至103示出具有3’和/或5’接頭區(qū)域的靶標(biāo)特異性寡核苷酸探針在覆蓋相鄰160bp靶區(qū)域時對靶區(qū)域的覆蓋。具體地說，圖100說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大的連續(xù)區(qū)域(作為實例顯示約500個堿基)測序。所檢測的靶區(qū)域序列以深灰色部分繪出。未檢測的靶區(qū)域序列繪成淺灰色部分，且接頭繪成黑色部分。這幅圖中的每個連續(xù)縱向分組示出通過移動隨機生成的cfDNA片段(或隨機剪切片段)中找到的160bp靶區(qū)域獲得的探針覆蓋。靶區(qū)域以10堿基增量連續(xù)移動，以展示單個探針對靶區(qū)域的覆蓋。從左到右的每個連續(xù)縱向分組示出第二、第三和第四不同探針的靶區(qū)域覆蓋和探針重疊。這里示出的寡核苷酸探針結(jié)構(gòu)(每個縱向分組之下)含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性探針部分、50堿基3’或下游探針、10堿基接頭部分和20-160bp標(biāo)識符區(qū)域(細(xì)線)。圖101示出了如圖100中所示的如何以重疊拼接策略設(shè)計用于對更大連續(xù)區(qū)域測序的寡核苷酸探針的類似說明。這里示出的寡核苷酸探針結(jié)構(gòu)含有80堿基5’或上游靶標(biāo)特異性探針部分、50堿基3’或下游探針、10堿基接頭部分和20-160bp標(biāo)識符區(qū)域(細(xì)線)。圖102示出了如圖100中所示的如何以重疊拼接策略設(shè)計用于對更大連續(xù)區(qū)域測序的寡核苷酸探針的類似說明。這里示出的寡核苷酸探針結(jié)構(gòu)含有50堿基5’或上游靶標(biāo)特異性探針部分、50堿基3’或下游探針、10堿基5’和3’接頭部分和20-160bp標(biāo)識符區(qū)域(細(xì)線)。圖103示出了如圖100中所示的如何以重疊拼接策略設(shè)計用于對更大連續(xù)區(qū)域測序的寡核苷酸探針的類似說明。這里示出的寡核苷酸探針結(jié)構(gòu)含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性探針部分、60堿基3’或下游探針、10堿基5’和3’接頭部分和20-160bp標(biāo)識符區(qū)域(細(xì)線)。圖104至107示出沒有3’或5’接頭的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記的寡核苷酸在覆蓋相鄰160bp靶基因區(qū)域時對靶區(qū)域的覆蓋(代表圖20和22中所示過程)。具有50堿基5’-和3’-靶標(biāo)特異性區(qū)域的寡核苷酸探針含有單個堿基錯配/10堿基(縱向散列標(biāo)記)。所檢測的靶區(qū)域序列(深灰色)；未檢測的靶區(qū)域序列(淺灰色)。具體地說，圖104示出在一大片基因組DNA中覆蓋相鄰160bp基因靶(未附接接頭的靶區(qū)段)的靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記的寡核苷酸。5’-和3’-靶標(biāo)特異性探針具有單個堿基錯配/10堿基(縱向散列標(biāo)記)。圖中的每個連續(xù)分組示出模擬移動cfDNA中找到的160bp靶區(qū)域的探針覆蓋。靶區(qū)域以10堿基增量連續(xù)移動，以展示單個探針對靶區(qū)域的覆蓋。從左到右的每個連續(xù)分組示出第二、第三和第四不同探針的靶區(qū)域覆蓋和探針重疊。這幅圖中所示的寡核苷酸探針含有50堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、50堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基序列標(biāo)識符區(qū)域。圖105示出了如圖104中所示的跨越相鄰的160bp基因靶拼接靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸的類似方法。這幅圖中所示的寡核苷酸探針含有60堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、60堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基序列標(biāo)識符區(qū)域。圖106示出了如圖104中所示的跨越相鄰的160bp基因靶拼接靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸的類似方法。這幅圖中所示的寡核苷酸探針含有70堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、70堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基序列標(biāo)識符區(qū)域。圖107示出了如圖104中所示的跨越相鄰的160bp基因靶拼接靶標(biāo)特異性相位標(biāo)記寡核苷酸的類似方法。這幅圖中所示的寡核苷酸探針含有80堿基5’或上游靶標(biāo)特異性部分、80堿基3’或下游靶標(biāo)特異性部分和20-160堿基序列標(biāo)識符區(qū)域。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶核糖核酸分子的樣品，以及在樣品中生成所述一個或多個靶核糖核酸分子(如果存在于樣品中)的cDNA。所述方法進一步包括提供一個或多個第一寡核苷酸探針，每個第一寡核苷酸探針包含：(a)3′cDNA靶標(biāo)特異性序列部分；(b)5′cDNA靶標(biāo)特異性部分；以及其它部分，所述其它部分包含(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。在有效地使所述第一寡核苷酸探針的3′和5′靶標(biāo)特異性部分以堿基特異性方式與所述cDNA的互補區(qū)域雜交的條件下，使所述樣品與所述一個或多個第一寡核苷酸探針接觸。產(chǎn)生適于連接雜交至其互補cDNA的第一寡核苷酸探針的3′和5′端的一個或多個可連接結(jié)，并連接在所述一個或多個連接結(jié)處的第一寡核苷酸探針以形成包含連接至第一寡核苷酸探針的其它部分的靶核糖核酸序列的脫氧核糖核酸拷貝的環(huán)狀連接產(chǎn)物。所述方法進一步包括檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，以識別與樣品中的其它核糖核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶核糖核酸分子的存在。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，圖108示出以靶標(biāo)特異性捕獲用于測序的mRNA或lncRNA轉(zhuǎn)錄物的過程。如圖108步驟A中所示，使含有所需靶區(qū)域的mRNA或lncRNA逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄一實心菱形)，以產(chǎn)生互補DNA(cDNA)分子。如圖108步驟B中所示，含有與cDNA靶區(qū)域互補的5’和3’序列的寡核苷酸探針與cDNA分子雜交。所述寡核苷酸探針的靶標(biāo)特異性部分被其它部分隔開。所述其它部分包含獨特標(biāo)識符部分、任選的患者標(biāo)識符部分和任選的5’磷酸根。如果有必要的話，聚合酶(實心菱形)延伸寡核苷酸探針的雜交3’端，以產(chǎn)生滑到寡核苷酸探針的5’端的3’端(圖108，步驟C)。在5′端上沒有可連接的磷酸的情況下，具有5′核酸酶活性的聚合酶裂解5′端上的匹配的5′-重疊堿基，產(chǎn)生5′-磷酸(圖108，步驟C，左圖)。如圖108的步驟D中所示，連接酶(實心圓)共價密封延伸的或可連接的末端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。最后，如圖108步驟E中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含與獨特標(biāo)識符序列或患者標(biāo)識符序列連接的靶核糖核酸序列的cDNA拷貝的所需單鏈環(huán)狀構(gòu)建體。該產(chǎn)物適用于使用任何本文所述的方法進行滾環(huán)擴增和測序。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個核酸分子的方法，所述核酸分子可能包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域(例如，推定的基因融合)。該方法包括提供可能含有包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域的一個或多個核酸分子的樣品，并提供一個或多個寡核苷酸探針組，每個探針組包含：(i)包含5′第一靶標(biāo)特異性部分、3′第二靶標(biāo)特異性部分和其它部分的第一寡核苷酸探針，以及(ii)包含5′第二靶標(biāo)特異性部分、3′第一靶標(biāo)特異性部分和其它部分的第二寡核苷酸探針，其中探針組的第一或第二寡核苷酸探針的其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。該方法進一步包括在有效地使探針組的第一和第二寡核苷酸探針以堿基特異性方式與其相應(yīng)的核酸分子(如果存在于樣品中)的第一和第二靶區(qū)域雜交的條件下，使樣品與一個或多個寡核苷酸探針組接觸；以及產(chǎn)生適于在探針組與互補的核酸分子的第一和第二靶區(qū)域雜交時將所述探針組的第一寡核苷酸探針的3′端連接至第二寡核苷酸探針的5′端以及將所述探針組的第一寡核苷酸探針的5′端連接至第二寡核苷酸探針的3′端的一個或多個可連接結(jié)。在所述一個或多個可連接結(jié)處連接探針組的所述第一和第二寡核苷酸，以形成包含連接至其它部分的對應(yīng)于核酸分子的所述第一和第二不同靶區(qū)域的核苷酸序列的環(huán)狀連接產(chǎn)物。檢測并區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而確定樣品中存在(如果有的話)一個或多個包含彼此連接的不同的第一靶和第二靶區(qū)域的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，圖109，步驟A-E示出用于檢測mRNA中的特異性推定基因融合。含有推定基因融合的mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子(圖109，步驟A)。對于每個潛在靶，提供包含第一和第二寡核苷酸探針的第二寡核苷酸探針。第一探針具有5’第一靶標(biāo)特異性部分和3’第二靶標(biāo)特異性部分，而第二探針具有5’第二靶標(biāo)特異性部分和3’第一靶標(biāo)特異性部分。每個探針的靶標(biāo)特異性部分被核苷酸序列隔開，所述核苷酸序列含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列或其任何組合。寡核苷酸探針與其靶cDNA分子的相應(yīng)互補部分雜交，如圖109，步驟B中所示。如果寡核苷酸探針含有可連接的5’端，連接酶共價密封雜交寡核苷酸的相鄰末端，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物，如圖109，步驟D中所示(左圖)。如果寡核苷酸探針含有5’側(cè)翼或重疊核苷酸堿基，5’核酸酶裂解5’端，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖109，步驟C)，然后連接(圖109，步驟D，右圖)。核酸外切酶消化移除所有未連接的或線性產(chǎn)物，只留下包含與獨特識別序列、患者識別序列和/或捕獲序列(例如，引物結(jié)合序列)連接的來自基因融合產(chǎn)物的上游和下游序列的所需單鏈環(huán)化DNA構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。圖110示出圖109中描繪用于檢測mRNA中的特異性推定基因融合的方法的變型。在這個實施方案中，第一和第二寡核苷酸探針與其cDNA分子的相應(yīng)互補區(qū)域的雜交，如圖110，步驟B中所示。聚合酶延伸每個第一和第二探針的雜交3’端，以形成與第二和第一探針的雜交5’端的連接結(jié)，分別如圖110，步驟C中所示。當(dāng)寡核苷酸探針具有5’-OH(圖110的左側(cè)，步驟C)，聚合酶的5’-核酸酶活性裂解匹配的5’重疊堿基，留下可連接的5’磷酸根。連接酶(實心圓)共價密封雜交的第一和第二寡核苷酸探針的相鄰末端，形成環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖110，步驟D)。核酸外切酶消化移除未連接的或線性產(chǎn)物，只留下包含與獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或捕獲序列(即，引物結(jié)合序列)連接的來自基因融合產(chǎn)物的上游和下游序列的所需單鏈環(huán)狀DNA構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。圖111示出按照本發(fā)明的這個方面的另一個過程，其適用于檢測和量化mRNA或lncRNA中的特異性外顯子。在這個實施方案中，含有所需外顯子的mRNA或lncRNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(圖111，步驟A)。如圖111，步驟B中所示，對于每個潛在靶，提供兩個寡核苷酸探針，每個探針含有與cDNA分子的每個外顯子的獨特部分互補的3’和5’靶標(biāo)特異性序列。每個探針的靶標(biāo)特異性部分被核苷酸序列隔開，所述核苷酸序列含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列或其任何組合。探針雜交，在靶的cDNA上彼此相鄰，如圖111，步驟B中所示。如果寡核苷酸探針含有可連接的5’端，連接酶共價密封雜交寡核苷酸的相鄰末端，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物，如圖111，步驟D中所示(左圖)。如果寡核苷酸探針含有5’側(cè)翼或重疊核苷酸堿基，5’核酸酶裂解5’端，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖111，步驟C)，然后連接(圖111，步驟D，右圖)。核酸外切酶消化移除所有未連接的或線性產(chǎn)物，只留下包含與獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或捕獲序列(例如，引物結(jié)合序列)連接的所需外顯子的cDNA序列的所需單鏈環(huán)化DNA構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。圖112示出圖111中描繪用于檢測和量化mRNA或lncRNA的中特異性外顯子的方法的變型。在這個實施方案中，第一和第二寡核苷酸探針與其cDNA分子的相應(yīng)互補區(qū)域的雜交，如圖112，步驟B中所示。聚合酶延伸每個第一和第二探針的雜交3’端，以形成與第二和第一探針的雜交5’端的連接結(jié)，分別如圖112，步驟C中所示。當(dāng)寡核苷酸探針具有5’-OH(圖110的左側(cè)，步驟C)，聚合酶的5’-核酸酶活性裂解匹配的5’重疊堿基，留下可連接的5’磷酸根。連接酶(實心圓)共價密封雜交的第一和第二寡核苷酸探針的相鄰延伸末端，形成環(huán)狀連接產(chǎn)物(圖112，步驟D)。核酸外切酶消化移除未連接的或線性產(chǎn)物，只留下包含與獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或捕獲序列(即，引物結(jié)合序列)連接的所需外顯子的cDNA序列的所需單鏈環(huán)狀DNA構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。圖113示出了根據(jù)本發(fā)明的這個方面的另一種方法，其適用于檢測基因組DNA的相同鏈上的已知多態(tài)性。如圖113，步驟A中所示，靶基因組DNA片段的上游和下游區(qū)域含有多態(tài)性。如圖113，步驟B中所示，對于每個潛在靶，提供兩個寡核苷酸探針，每個探針含有與含有多態(tài)性的DNA的上游和下游部分互補的3’和5’靶標(biāo)特異性序列。每個探針的靶標(biāo)特異性部分被核苷酸序列隔開，所述核苷酸序列含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列或其任何組合。探針雜交，在靶基因組DNA序列上彼此相鄰，如圖113，步驟B中所示。如果寡核苷酸探針含有可連接的5’端，連接酶共價密封雜交寡核苷酸的相鄰末端，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物，如圖113，步驟D中所示(左圖)。如果寡核苷酸探針含有5’側(cè)翼或重疊核苷酸堿基，5’核酸酶裂解5’端，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖113，步驟C)，然后連接(圖113，步驟D，右圖)。核酸外切酶消化移除所有未連接或線性產(chǎn)物，只留下包含與獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列和/或捕獲序列(例如，引物結(jié)合序列)連接的包含多態(tài)性的基因組DNA的上游和下游序列的所需單鏈環(huán)化DNA構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和后續(xù)測序。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶miRNA分子的方法，所述靶miRNA分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶miRNA分子的樣品，并將核苷酸接頭附接至樣品中的靶miRNA分子的3’和5’端。該方法進一步包括提供一個或多個寡核苷酸探針，每個寡核苷酸探針包括：(a)與靶miRNA分子的3′核苷酸接頭互補的3′部分；(b)與靶miRNA分子的5′核苷酸接頭互補的5′部分；以及(c)其它部分，所述其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。在有效地使所述寡核苷酸探針的3′和5′部分以堿基特異性方式與靶miRNA分子(如果存在于樣品中)上的互補核苷酸接頭雜交的條件下，使所述樣品與所述一個或多個寡核苷酸探針接觸。延伸雜交寡核苷酸探針的3’端以產(chǎn)生一個或多個靶miRNA分子的互補序列，并將寡核苷酸探針的3’延伸序列連接至寡核苷酸探針的5’端，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物，其包含與靶miRNA分子的3’核苷酸接頭互補的序列、與靶miRNA分子的5’核苷酸接頭互補的序列、一個或多個靶miRNA分子的互補序列和寡核苷酸探針的其它部分。該方法進一步包括檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別與樣品中的其它核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶miRNA分子的存在。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，圖114示出了用于檢測miRNA的通用群體的過程。用于所述過程的起始材料是從血清或血漿或外來體分離的miRNA(圖114，步驟A)。如圖114，步驟B中所示，將核苷酸接頭附接至樣品中靶核糖核酸分子的3’和5’端。如在圖114，步驟B中所示，3′接頭在其3′端包含阻斷基團且在其5′端包含磷酸根基團，以促進使用T4RNA連接酶(實心圓)連接至靶miRNA分子的3′端。在其5’端也包含阻斷基團的5’接頭使用T4RNA連接酶類似地連接至miRNA分子的5’端。含有與靶miRNA的3′核苷酸接頭互補的3′部分和與靶miRNA的5′核苷酸接頭互補的5′部分的寡核苷酸探針與其接頭所附靶miRNA分子雜交(圖114，步驟C)。所述寡核苷酸探針還含有包含獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列或其任何組合的核苷酸序列。缺乏5’-3’活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(實心菱形)延伸雜交寡核苷酸探針的3’端，拷貝miRNA序列，直到其與寡核苷酸探針的可連接的5’端相鄰(圖114，步驟D)。如圖114的步驟E中所示，T4DNA連接酶(實心圓)共價密封寡核苷酸探針的延伸的3′端以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。UDG和AP核酸內(nèi)切酶(實心三角形)使miRNA缺口(圖114，步驟E)，且核酸外切酶消化所有未連接的或帶缺口的產(chǎn)物，只留下包含與獨特識別序列連接的miRNA靶的拷貝的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶miRNA分子的方法，所述靶miRNA分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶miRNA分子的樣品，并將核苷酸接頭連接至樣品中的靶miRNA分子的3’和5’端。所述核苷酸接頭通過其它部分彼此連接，所述其它部分包含：(i)獨特標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)一條或多條引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合，由此所述連接形成包含靶miRNA分子、3′和5′核苷酸接頭序列和其它部分的環(huán)狀連接產(chǎn)物。此方法還包括提供一個或多個第一寡核苷酸引物，其包含與環(huán)形連接產(chǎn)物的3′或5′核苷酸接頭序列互補的核苷酸序列，并以堿基特異性方式使所述一個或多個第一寡核苷酸引物與環(huán)形連接產(chǎn)物雜交。延伸第一寡核苷酸引物的3’端，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物的互補序列，并檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別與樣品中的其它核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶miRNA分子的存在。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，圖115示出了用于檢測特定miRNA序列的過程。從血清或外來體分離的miRNA(圖115，步驟A)的5’端被磷酸化。如圖115步驟B中所示，將連接核苷酸接頭連接至樣品中靶核糖核酸分子的3’和5’端。所述核苷酸接頭通過含有獨特標(biāo)識符序列、3′核糖核苷酸、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列或其任何組合的核苷酸序列而連接。如圖115步驟B中所示的具有與偶聯(lián)接頭的3′端互補的3′序列、與偶聯(lián)接頭的5′端互補的5′序列以及與靶miRNA互補的序列的寡核苷酸探針促進偶聯(lián)核苷酸接頭的連接。核苷酸接頭與miRNA分子的連接形成含有靶miRNA分子的環(huán)化連接產(chǎn)物。如圖115的步驟C中所示，核酸外切酶消化去除所有未連接的產(chǎn)物(例如，寡核苷酸探針)，只留下含有靶miRNA的所需單鏈環(huán)化構(gòu)建體。如圖115，步驟D中所示，5’磷酸化引物與環(huán)化構(gòu)建體雜交，且具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性(菱形)，但缺乏5’-3’活性的聚合酶延伸在環(huán)化構(gòu)建體周圍的雜交引物，從而產(chǎn)生miRNA分子的互補拷貝。連接酶(實心圓)共價密封延伸引物的3’端和磷酸化5’端，以產(chǎn)生第二環(huán)化連接產(chǎn)物，如圖115，步驟E中所示。UDG和AP核酸內(nèi)切酶(實心三角形)使原始miRNA分子缺口，且核酸外切酶消化移除所有未連接或缺口產(chǎn)物，只留下包含與獨特識別序列連接的miRNA靶的拷貝的所需單鏈環(huán)狀核酸構(gòu)建體。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。圖116示出圖115中描繪用于檢測特異性miRNA序列的方法的變型。在這個變型中，利用序列內(nèi)具有3’阻斷基團和內(nèi)部間隔基(“X”)，且與靶miRNA序列互補的寡核苷酸探針將偶聯(lián)核苷酸接頭連接至靶miRNA(圖116，步驟B，左圖)。偶聯(lián)接頭連接至靶miRNA形成環(huán)化連接產(chǎn)物，如圖116，步驟B中所示(左圖)。含有硫代磷酸根的5’OH引物與環(huán)化連接產(chǎn)物雜交，如圖116，步驟C中所示。具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和5’-3’核酸酶活性(實心菱形)的聚合酶延伸雜交引物的3’端，以形成環(huán)化連接產(chǎn)物和其中所含靶miRNA分子的互補拷貝(圖116，步驟C和圖116，步驟D，左圖)。聚合酶的5’-核酸酶活性裂解引物的匹配5’-重疊堿基，留下可連接的5’磷酸根(圖116，步驟D，左圖)。連接酶(實心圓)共價密封延伸末端，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物，如圖116，步驟E中所示。UDG和AP核酸內(nèi)切酶(實心三角形)使原始miRNA分子缺口(圖116，步驟E，左圖)，且核酸外切酶消化移除所有未連接或帶缺口的產(chǎn)物只留下包含與獨特識別序列偶聯(lián)的miRNA靶的拷貝的所需單鏈環(huán)狀DNA(圖116，步驟F，左圖)。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。在不存在靶miRNA時，如圖116，步驟B-E，右圖所示，用5′-3′核酸酶延伸引物，產(chǎn)生具有雙鏈斷裂的缺口。帶缺口產(chǎn)物不連接，且維持線性(圖116，步驟E，右圖)。這些線性產(chǎn)物通過核酸外切酶消化從分析中移除(圖116，步驟F)。本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于識別樣品中的一個或多個靶miRNA分子的方法，所述靶miRNA分子與樣品中的其它核酸分子的差異為一個或多個堿基。該方法包括提供包含可能含有一個或多個堿基差異的一個或多個靶miRNA分子的樣品，并提供一個或多個寡核苷酸探針組，每個組包含：(a)具有5′莖環(huán)部分和與靶miRNA分子的3′部分互補的3′部分的第一寡核苷酸探針；(b)具有與靶miRNA分子的5′端的拷貝互補的3′部分、與第一寡核苷酸探針的5′莖環(huán)部分互補的5′部分以及其它部分的第二寡核苷酸探針，所述其它部分包含：(i)獨特靶標(biāo)識符序列、(ii)患者標(biāo)識符序列、(iii)引物結(jié)合序列或(i)、(ii)和(iii)的任何組合。所述方法還包括摻混樣品、來自探針組的一個或多個第一寡核苷酸探針和逆轉(zhuǎn)錄酶，以形成逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，并延伸與其互補靶miRNA分子雜交的第一寡核苷酸探針的3′端，生成靶miRNA分子的互補序列，如果存在于樣品中。探針組的一個或多個第二寡核苷酸探針與包含靶miRNA序列的互補序列的延伸第一寡核苷酸探針雜交，并在每個與延伸第一寡核苷酸探針雜交的第二寡核苷酸的3’與5’端之間形成一個或多個可連接結(jié)。所述方法還包括連接每個第二寡核苷酸探針的3’和5’端，以形成環(huán)狀連接產(chǎn)物，每種產(chǎn)物包含與第二寡核苷酸探針的其它部分偶聯(lián)的靶miRNA序列的脫氧核糖核酸拷貝。檢測和區(qū)分樣品中的環(huán)狀連接產(chǎn)物，從而識別與樣品中的其它核酸分子的差異在于一個或多個堿基的一個或多個靶miRNA分子的存在。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，圖117示出了用于檢測特定miRNA序列的方法。從血清、血漿或外來體分離的miRNA與第一寡核苷酸探針雜交，所述探針具有與靶miRNA的3’端互補的序列和在其5’端上的莖-環(huán)(圖117，步驟B)。所述第一寡核苷酸探針的莖環(huán)區(qū)還含有可裂解連接(dU)。利用逆轉(zhuǎn)錄酶(實心菱形)延伸第一寡核苷酸探針，從而形成miRNA分子的互補拷貝。如圖117，步驟C中所示，含有與延伸第一寡核苷酸探針的3’端互補的3’序列和與第一寡核苷酸探針的5’莖-環(huán)互補的5’序列的第二寡核苷酸探針與第一寡核苷酸探針的互補區(qū)域雜交。所述第二寡核苷酸探針還可以含有獨特標(biāo)識符序列、患者標(biāo)識符序列、一條或多條引物結(jié)合序列、5’磷酸根或其任何組合。聚合酶(實心菱形)延伸第二寡核苷酸探針的3′端，產(chǎn)生miRNA序列的互補拷貝并且使所述探針的3′端鄰近其5′端，以形成連接結(jié)。(圖117，步驟D)。聚合酶還延伸第一寡核苷酸探針的3’端(利用雜交的第二寡核苷酸探針作為模板)，以產(chǎn)生與其5’端的連接結(jié)(圖117，步驟D)。如圖117，步驟E中所示，連接酶(實心圓)共價密封第一和第二寡核苷酸探針的3′和5′端的每個相應(yīng)連接結(jié)，以產(chǎn)生環(huán)化的連接產(chǎn)物。在第一寡核苷酸探針的可裂解連接處(例如，dU的UDG裂解，和AP核酸內(nèi)切酶-實心三角形)引入缺口。如圖117，步驟E中所示，核酸外切酶消化除去所有未連接或帶缺口的產(chǎn)物，只留下所需的單鏈環(huán)化核酸構(gòu)建體(即，第二寡核苷酸探針)，其包含與獨特識別序列連接的miRNA靶序列的拷貝。這種產(chǎn)物適用于如本文所述的滾環(huán)擴增和環(huán)形測序。實施例預(yù)測性實施例1-已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的高敏感性突變標(biāo)記(當(dāng)以1％至0.01％存在時)、單堿基突變、小片段插入和小片段缺失突變。致癌基因中的突變變化通常發(fā)生在不連續(xù)區(qū)域或位置中并且通常可以推進腫瘤進展。這些基因和其突變的列表可以參見公開數(shù)據(jù)庫例如桑格基因組中心(SangerGenomeCenter)“COSMIC”數(shù)據(jù)庫。血清中此類突變的存在是體內(nèi)一些腫瘤組織的強烈指標(biāo)。傳統(tǒng)上，此類突變已使用等位基因特異性PCR擴增加以識別。這種方法易于進行初始錯誤擴增，接著進行錯誤產(chǎn)物的擴增。其他人已使用數(shù)字PCR以試圖定量血清中的突變DNA。然而，腫瘤抑制基因(例如p53和APC)中的突變變化過多以致無法使用等位基因特異性PCR方法進行覆蓋。因此，所述方法已改為跨蛋白質(zhì)的所有外顯子的深度測序。當(dāng)輸入DNA有限時，重要的是實現(xiàn)不同區(qū)域的相等擴增以確保相同普遍覆蓋深度。已多次嘗試使用分子倒置探針(MIP)實現(xiàn)相等擴增，參見例如Akhras等人，“ConnectorInversionProbeTechnology：APowerfulOne-PrimerMultiplexDNAAmplificationSystemforNumerousScientificApplications，”PLoSOne2(9)：e915(2007)；Hiatt等人，“SingleMoleculeMolecularInversionProbesforTargeted，High-AccuracyDetectionofLow-FrequencyVariation，”GenomeRes.23(5)：843-54(2013)，這些文獻在此通過引用整體并入。然而，這些技術(shù)依賴于制造基因組DNA的拷貝，并因此具有引入額外錯誤的風(fēng)險。方法綜述：思路為精確捕獲覆蓋目標(biāo)區(qū)域或外顯子的靶DNA的每一個片段，附接獨特標(biāo)識符序列和任選患者標(biāo)識，環(huán)形測序并將它們環(huán)化以供后續(xù)測序例如環(huán)形測序。使原始靶DNA鏈環(huán)化并測序。這避免了由延伸(并且環(huán)化)雜交的寡核苷酸造成的聚合酶誘導(dǎo)型錯誤，這種錯誤將會導(dǎo)致假陽性。這種方法的優(yōu)勢在于獲得必要時的拷貝數(shù)量信息(即，病毒載量、腫瘤內(nèi)染色體失衡、無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的非整倍體檢測)和以所需最少測序獲得突變數(shù)據(jù)。變型1.1：(圖13-16).在所述變型中，將短接頭連接到DNA靶標(biāo)(平均長度約160個堿基的cfDNA)。為捕獲所需區(qū)域，使包含以下的寡核苷酸探針與靶標(biāo)進行雜交：與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、與接頭的3’端互補的序列以及與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域。所述寡核苷酸可以含有位于一個末端(所示5’端)上的任選的阻斷基團，或任選的可裂解接頭。取決于探針設(shè)計和靶片段的始末堿基，靶標(biāo)的一部分可以在3’接頭與與3’探針互補的靶標(biāo)的一部分之間環(huán)出(loopout)一個單鏈區(qū)域(圖13和14)，或者靶序列的5’端的一部分可以不雜交，或者來自所述寡核苷酸的3’探針序列的一部分可以環(huán)出(圖15和16)。聚合酶的添加允許寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸，以及3’端接頭延伸通過獨特標(biāo)識符序列和任選患者標(biāo)識符序列。選擇雜交條件使得與靶標(biāo)的3’側(cè)序列的互補的3’探針區(qū)域的雜交將靶標(biāo)上的接頭的3’端局部集中到其補體，使得其正確雜交并且容易通過聚合酶延伸。然而，如果寡核苷酸探針與靶DNA之間的互補性不夠充分，那么靶標(biāo)上的接頭的3’端將不會與其補體雜交，并且?guī)缀醪粫ㄟ^聚合酶進行延伸。寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸會增強探針與靶標(biāo)的締合，并且因此增加接頭的3’端與其補體正確雜交并且通過聚合酶延伸的能力。聚合酶(或Fen核酸酶)的5’→3’核酸酶裂解活性在靶標(biāo)的5’側(cè)與探針的5’部分互補的位置或其附近裂解靶標(biāo)的匹配的5’-重疊堿基，從而使真正靶標(biāo)留出可連接的5’-磷酸根。聚合酶還使寡核苷酸在靶標(biāo)上延伸，并且產(chǎn)生可連接的5’-磷酸根(圖13和15，步驟D的左側(cè))，或者不裂解寡核苷酸的5’端上的阻斷基團(圖13和15，步驟D的右側(cè))。連接酶共價密封延伸的3’端到可連接的5’-磷酸根以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。阻斷基團阻止寡核苷酸探針環(huán)化(圖13和15，步驟D，右側(cè))，或者可替代地在可裂解連接處引入缺口(例如，UDG裂解dU，接著以AP核酸內(nèi)切酶裂解脫嘌呤主鏈，圖13和15，步驟D，左側(cè))。任選地添加尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg，也稱為8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶，其充當(dāng)N-糖基化酶和AP-裂解酶)可以用于使含受損堿基的靶標(biāo)缺口。隨后添加核酸外切酶以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，從而只留下由原始靶DNA和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序。這種方法需要具有靶依賴性5’→3’核酸酶活性的酶，使得可連接的5’-磷酸根僅在5’探針區(qū)域和5’靶區(qū)域之間存在合適的雜交和互補性時產(chǎn)生。當(dāng)使用具有5’→3’核酸酶裂解活性的聚合酶時，挑戰(zhàn)在于避免聚合酶以其破壞5’靶區(qū)域(即，缺口-平移)的方式沿5’探針區(qū)域延伸短接頭而無需連接步驟。破壞原始靶DNA并用延伸的DNA來代替的缺口-平移可能無意引入聚合酶錯誤，其將會被增殖并且被錯誤稱為突變。這可以通過以下方式來最小化：在分布延伸的條件下在連接酶的存在下使用具有和不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的聚合酶的混合物(例如，以1∶20的比例)，使得大多數(shù)延伸是通過不具有核酸酶活性的聚合酶進行，直到需要具有核酸酶活性的聚合酶以產(chǎn)生可連接結(jié)，接著進行聚合酶解離和連接事件以產(chǎn)生所需環(huán)狀連接產(chǎn)物。cfDNA(具有140到170個核苷酸范圍的大小)反映圍繞核小體單元的染色體DNA的裂解。此類裂解事件可以稍微分階段，或更隨機，從而產(chǎn)生諸多可以均勻或不均勻分布的片段。因此，需要設(shè)計將提供與片段斷裂位置無關(guān)的覆蓋的寡核苷酸探針。圖90-93提供不同寡核苷酸探針設(shè)計以覆蓋跨250個堿基區(qū)域的片段的一些實例。在這些圖中，潛在靶片段(跨區(qū)域偏移10個堿基)由深灰色條表示，接頭由短黑色條表示，探針區(qū)域表示為淺灰色條，獨特序列標(biāo)識符和任選患者標(biāo)識符表示為黑色粗線，以及兩條序列之間的連接示意性繪示為細(xì)線。圖100和101說明了如何設(shè)計多個探針以覆蓋約500個堿基的連續(xù)區(qū)域。在圖90中，上游5’探針區(qū)域(60個堿基)與靶堿基50-110互補，而下游3’探針區(qū)域(20個堿基)與靶堿基140-160互補。出于所述實施例的目的，接頭是10個堿基，且復(fù)合標(biāo)識符序列是20個堿基(序列標(biāo)識符為12個堿基，且患者標(biāo)識符為8個堿基)。當(dāng)靶標(biāo)為位置1至160時，這個探針設(shè)計將允許140個堿基產(chǎn)物(其中110個堿基(即，位置50至160)提供靶序列信息)的環(huán)化。當(dāng)靶標(biāo)為位置11至170時，這個探針設(shè)計將允許150個堿基產(chǎn)物(其中120個堿基(即位置50至170)提供靶序列信息)的環(huán)化。利用這個設(shè)計，根據(jù)分別從位置51至81開始并在位置210至240結(jié)束的靶標(biāo)將推導(dǎo)出最大160個堿基的序列信息。在所述圖中，當(dāng)靶標(biāo)是從位置61至250時，不形成環(huán)化產(chǎn)物。然而由于5’探針區(qū)域和靶標(biāo)的5’側(cè)之間的互補性的更短區(qū)域，一些產(chǎn)物可能形成，所以存在它們不始終雜交的顧慮。另外，這個設(shè)計的顧慮之處在于3’側(cè)的90個堿基的靶“環(huán)出”區(qū)域可能過長以致無法使接頭的3’端與寡核苷酸上的補體(圖解右側(cè)的短黑色條)有效雜交。在圖91中，上游5’探針區(qū)域(80個堿基)與靶堿基30-110互補，而下游3’探針區(qū)域(20個堿基)與靶堿基140-160互補。所述圖類似于圖90，只是5’探針區(qū)域更長。對于前4個靶標(biāo)實例，更長寡核苷酸允許捕獲更多靶DNA，使得所得環(huán)含有原始靶DNA的20個額外堿基。圖100和101說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大連續(xù)區(qū)域(本文中顯示約500個堿基)測序。圖100描繪使用圖90中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針，而圖101描繪使用圖91中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針。描繪可在區(qū)域上產(chǎn)生的潛在160bp片段(偏移10個堿基)。在底層，顯示覆蓋其上方的所有那些片段的寡核苷酸。如果靶標(biāo)中的區(qū)域是呈淺灰色，那么將不提供可靠序列信息。如果靶標(biāo)中的區(qū)域是呈深灰色，那么將提供良好的序列信息。在所述圖中，所列探針依序命名為#1、#2、#3、#4等。對于多路延伸連接步驟，將奇數(shù)探針#1、#3、#5匯集于第一寡核苷酸池組中，并且隨后將偶數(shù)探針#2、#4、#6匯集于第二池組中。這種方法避免相鄰寡核苷酸(即#1和#2)競爭結(jié)合到相同靶鏈。一旦已發(fā)生延伸-環(huán)化，那么可合并這兩個池并且可進行核酸外切酶和后續(xù)步驟例如滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序。用于高敏感性檢測已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的單堿基突變、小片段插入或小片段缺失突變(當(dāng)以1％至0.01％存在時)的詳細(xì)方案(V1.1)：1.1.a.以cfDNA(或者例如從CTC分離的基因組DNA，剪切到約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，接著用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。任選地，從未連接的接頭純化靶DNA。1.1.b.在寡核苷酸探針(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、與接頭的3’端互補的序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)的存在下，使兩個末端均含有接頭的靶DNA變性(94℃1分鐘)，并且通過冷卻到所需溫度(例如，50℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與所需片段上的其互補區(qū)雜交。在退火步驟之后或在程序開始時，添加Taq聚合酶和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選自菌株AK16D)、dNTP和任選的KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。1.1.c.任選地，裂解在可裂解連接處的寡核苷酸探針鏈(例如使用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，僅留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列和任選患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，接著使用下一代測序或者可替代地使用接頭序列作為引物結(jié)合位點在共價閉合模板上進行直接SMRT測序來識別靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸探針可以在5’側(cè)含有任選阻斷基團以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得所述寡核苷酸探針不環(huán)化?？商娲兀闪呀膺B接可以包括在原始寡核苷酸探針中。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋4：連接延伸過程可以在兩個或更多個反應(yīng)管中進行，一組含有“奇數(shù)”編號探針，第二組含有“偶數(shù)”編號探針以避免探針競爭相同靶DNA鏈。可隨后匯集單獨的反應(yīng)物。變型1.2.(圖17-18).在所述變型中，目的在于捕獲所有靶DNA序列，與探針在何處結(jié)合靶標(biāo)無關(guān)。與之前一樣，將短接頭連接到DNA靶標(biāo)(平均長度約160個堿基的cfDNA)。為捕獲所需區(qū)域，使包含以下的寡核苷酸探針與靶標(biāo)進行雜交：與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、與接頭的5’端互補的序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、與接頭的3’端互補的序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域。所述寡核苷酸探針可以含有位于一個末端(所示5’端)上的任選的阻斷基團，或任選的可裂解接頭。取決于探針設(shè)計和靶片段的始末堿基，靶標(biāo)或探針序列的一部分可以在3’接頭和與3’探針互補的靶標(biāo)的部分之間以及在5’接頭和與5’探針互補的靶的部分之間環(huán)出單鏈區(qū)域(圖17)。聚合酶的添加允許寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸，以及3’端接頭延伸通過獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列，直到其鄰接到靶標(biāo)上的5’接頭。選擇雜交條件使得與靶標(biāo)的3’側(cè)序列的互補的3’探針區(qū)域的雜交將靶標(biāo)上的接頭的3’端局部集中，使得其正確雜交并且容易通過聚合酶延伸。接頭的5’端可以設(shè)計得稍微更長，以使得一旦聚合酶延伸3’接頭，其不正好延伸通過5’接頭互補序列，直到其命中與5’探針區(qū)域雜交的5’靶部分。然而，3’接頭和5’接頭區(qū)域與寡核苷酸探針上的各自補體的“組合”雜交效果應(yīng)仍具有低于雜交溫度的Tm，使得錯誤靶標(biāo)與寡核苷酸探針的隨機雜交(如果有的話)幾乎不導(dǎo)致延伸和連接以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。此變型要求寡核苷酸探針含有與3’和5’接頭鏈互補的序列，其中那些序列僅間隔約20個堿基。由于此序列與接頭鏈(其繼而彼此互補)互補，因此需要避免寡核苷酸探針的自我配對。一種解決方案是連接含有內(nèi)部泡(internalbubble)的接頭，使得兩個接頭在用于接頭連接的低溫(16℃或甚至4℃，利用T4連接酶)下保持雙鏈特性。另外，5’接頭可以設(shè)計得比3’接頭更長。最后，接頭內(nèi)的互補性的區(qū)域可以設(shè)計成具有細(xì)微錯配或核苷酸類似物(即，G：T和T：G；或I：A)，其在互補寡核苷酸探針中更不穩(wěn)定(即，C：A和A：C；或C：T)，使得所述寡核苷酸探針在總體雜交溫度(即，50℃)下較不可能以環(huán)的形式形成內(nèi)部自我配對。例如，與T：A匹配相比，接頭中A束中間的I：A錯配將使Tm降低2.4℃，但寡核苷酸中的互補錯配C：T使Tm降低10.1℃(7.7℃差異)。同樣地，與G：C匹配相比，接頭中A束中間的G：T錯配將使Tm降低10.2℃，但寡核苷酸中的互補錯配A：C使Tm降低18.0℃(7.8℃差異)。參見Kawase等人，“Studiesonnucleicacidinteractions.I.Stabilitiesofmini-duplexes(dG2A4XA4G2-dC2T4YT4C2)andself-complementaryd(GGGAAXYTTCCC)containingdeoxyinosineandothermismatchedbases，”NucleicAcidsRes.14(19)：7727-36(1986)，其在此通過引用整體并入)。因此，與接頭自我配對相比，預(yù)期將此類錯配放置在接頭內(nèi)將使寡核苷酸自我配對的Tm降低約15.5℃。精確量可以根據(jù)序列上下文來改變，然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白：在4℃或16℃連接溫度下保持雙鏈的接頭DNA雙鏈體中使用I：A和G：T錯配遠(yuǎn)足以確保寡核苷酸內(nèi)間隔約20個堿基的互補序列在50C的更高雜交溫度下將不會自我配對(即，具有20個堿基環(huán)的發(fā)夾)。寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸會增強探針與靶標(biāo)的締合，并且因此增加接頭的3’端與其補體正確雜交并通過聚合酶延伸的能力。聚合酶(或Fen核酸酶)的5’-＞3’核酸酶裂解活性裂解5’接頭的匹配的5’-重疊堿基，從而在接頭上留出可連接的5’-磷酸根。聚合酶還使寡核苷酸在靶標(biāo)上延伸，并且產(chǎn)生可連接的5’-磷酸根或者不裂解寡核苷酸的5’端上的阻斷基團。連接酶將延伸的3’端共價密封到可連接的5’-磷酸根以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。阻斷基團阻止寡核苷酸探針環(huán)化或者可替代地在可裂解連接引入缺口(例如，UDG裂解dU，接著以AP核酸內(nèi)切酶裂解脫嘌呤主鏈)。任選地添加尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg，也稱為8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶，其充當(dāng)N-糖基化酶和AP-裂解酶)可以用于使含受損堿基的靶標(biāo)缺口。隨后添加核酸外切酶以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，從而只留下由原始靶DNA和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序。此處的挑戰(zhàn)在于避免聚合酶以其破壞5’接頭(即，缺口-平移)的方式延伸3’接頭而無需連接步驟。這可以通過將硫代磷酸根鍵并入5’磷酸根末端(其將通過聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性來釋放)的第2位和第3位中來完成。為使由于聚合酶延伸一個堿基太多(其將不可能連接到下游接頭)導(dǎo)致的那些堿基的聚合酶位移最小化，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選在3’側(cè)富含AT和在5’側(cè)富含GC。一種替代方法是使用5’接頭，所述5’接頭在與所需5’磷酸根鄰接的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放此5’磷酸根。當(dāng)接頭結(jié)合到靶標(biāo)時，此酶裂解AP位點，從而留下5’磷酸根。核酸內(nèi)切酶還裂解單鏈接頭，但效率更低，因此與模板雜交的接頭將為優(yōu)選的底物。當(dāng)使用熱穩(wěn)定EndoIII時，所用的PCR聚合酶將缺乏5’-＞3’核酸外切酶活性。如上所述，缺口平移問題也可以如下最小化：通過使用具有和不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的聚合酶混合物(例如，比率為1∶20)在分配延伸條件下，在連接酶存在下，使得大多數(shù)延伸借助不具有核酸酶活性的聚合酶，直到需要具有核酸酶活性的聚合酶來產(chǎn)生可連接結(jié)，隨后聚合酶解離和連接事件，以產(chǎn)生所需環(huán)狀連接產(chǎn)物。圖94和95提供不同寡核苷酸探針設(shè)計以覆蓋跨250個堿基區(qū)域的片段的一些實例。在這些圖中，潛在靶片段(跨區(qū)域偏移10個堿基)由深灰色條表示，接頭由短黑色條表示，探針區(qū)域表示為淺灰色條，獨特序列標(biāo)識符和任選患者標(biāo)識符表示為黑色粗線，以及所述的兩條序列之間的連接示意性繪示為細(xì)線。圖102和103說明了如何設(shè)計多個探針以覆蓋約500個堿基的連續(xù)區(qū)域。在圖94中，上游5’探針區(qū)域(50個堿基)與靶堿基50-100互補，而下游3’探針區(qū)域(50個堿基)與靶堿基150-200互補。對于這個實例的目的，3’接頭為10個堿基，而復(fù)合標(biāo)識符序列為20個堿基(序列標(biāo)識符為12個堿基，且患者標(biāo)識符為8個堿基)，而5’接頭繪示為10個堿基，然而在另一個實施方案中，其將稍微更長，約12至18個堿基。當(dāng)靶標(biāo)為位置1至160時，此探針設(shè)計將允許200個堿基產(chǎn)物(其中160個堿基均提供靶序列信息)的環(huán)化。這些探針經(jīng)過設(shè)計使得與靶標(biāo)是1至160直到91至250無關(guān)，它們應(yīng)仍形成延伸產(chǎn)物，其環(huán)化以形成約200個堿基的產(chǎn)物。在圖95中，上游5’探針區(qū)域(60個堿基)與靶堿基40-100互補，而下游3’探針區(qū)域(60個堿基)與靶堿基140-200互補。此圖類似于圖94，除了3’和5’探針區(qū)域更長。此探針設(shè)計可以更有效在末端處捕獲靶標(biāo)(即，靶標(biāo)1至160；11至170；81至240；和91至250)。圖102和103說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大連續(xù)區(qū)域(本文中顯示約500個堿基)測序。圖102描繪使用圖94中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針，而圖103描繪使用圖95中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針。描繪可在區(qū)域上產(chǎn)生的潛在160bp片段(偏移10個堿基)。在底層，顯示覆蓋其上方的所有那些片段的寡核苷酸。在所述圖中，所列探針依序命名為#1、#2、#3、#4等。對于多路延伸連接步驟，將奇數(shù)探針#1、#3、#5匯集于第一寡核苷酸池組中，并且隨后將偶數(shù)探針#2、#4、#6匯集于第二池組中。這種方法避免相鄰寡核苷酸(即#1和#2)競爭結(jié)合到相同靶鏈。一旦已發(fā)生延伸-環(huán)化，那么可合并這兩個池并且可進行核酸外切酶和后續(xù)步驟例如滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序。用于高敏感性檢測已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的單堿基突變、小片段插入或小片段缺失突變(當(dāng)以1％至0.01％存在時)的詳細(xì)方案(V1.2)：1.2.a.以cfDNA(或者例如從循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)分離的基因組DNA，剪切到約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，接著用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下使用T4連接酶進行的連接將接頭附接在片段的兩個末端。任選地，從未連接的接頭純化靶DNA。1.2.b.在寡核苷酸探針(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、與接頭的5’端互補的序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、與接頭的3’端互補的序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)的存在下，使兩個末端均含有接頭的靶DNA變性(94℃，1分鐘)，并且通過冷卻到所需溫度(例如，50℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與所需片段上的其互補區(qū)雜交。在退火步驟之后或在程序開始時，添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選自菌株AK16D)、dNTP。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。1.2.c.任選地，裂解可裂解連接處的寡核苷酸探針(例如用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，僅留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，接著使用下一代測序識別靶標(biāo)，或者可替代地使用接頭序列作為引物結(jié)合位點，在共價閉合模板上進行直接SMRT測序。注釋1：寡核苷酸探針可以在5’側(cè)含有任選的阻斷基團以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化?？商娲?，可裂解接頭可以被包括在原始寡核苷酸探針中。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：5’端接頭可以經(jīng)過合成以將硫代磷酸根鍵包含在5’磷酸根末端(其將通過聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性來釋放)的第2位和第3位中。為使由于聚合酶延伸一個堿基太多(其將不可能連接到下游接頭)導(dǎo)致的那些堿基的聚合酶位移最小化，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選在3’側(cè)富含AT和在5’側(cè)富含GC。注釋4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以在與所需5’磷酸根鄰接的位置含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放此5’磷酸根。當(dāng)此酶結(jié)合到靶標(biāo)時，所述酶裂解AP位點，從而留下5’磷酸根。核酸內(nèi)切酶還裂解單鏈寡核苷酸，但效率更低，因此與模板雜交的接頭將為優(yōu)選的底物。注釋5：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根?？商娲?，5’磷酸根可以使用T4激酶在連接到靶DNA之前或在連接步驟之后添加。注釋6：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋7：連接延伸過程可以在兩個或更多個反應(yīng)管中進行，一組含有“奇數(shù)”編號的探針，第二組含有“偶數(shù)”編號的探針以避免探針競爭相同的靶DNA鏈。可隨后匯集單獨的反應(yīng)物。注釋8：含有單堿基3’“T”懸突的接頭的實例是以寡核苷酸iSx-003-ShAdT(上鏈)和iSx-004-pShAdB(下鏈)(參見表1)的形式提供的。以增強與接頭區(qū)域結(jié)合的稍長接頭的實例是以寡核苷酸iSx-006-MdAdT(上鏈)和iSx-007-pMdAdB(下鏈)(參見表1)的形式提供的。接頭iSx-003-ShAdT和iSx-006-MdAdT(參見表1)可以在5’端附近含有任選的硫代磷酸根基團以防止缺口-平移和促進具有接頭末端的靶標(biāo)的環(huán)化。接頭iSx-004-pShAdB和iSx-007-pMdAdB(參見表1)可以在3’端附近或3’端處含有任選的硫代磷酸根基團以防止降解(如果使用具有校對活性的聚合酶)和促進具有接頭末端的靶標(biāo)的環(huán)化。注釋9：如果沒有額外堿基添加到靶DNA(即，跳過克列諾步驟)，那么使用平端連接。為避免接頭與接頭連接，接頭的平端未經(jīng)磷酸化。含有平端的接頭的實例是以寡核苷酸iSx-003-ShAdT(上鏈)和iSx-005-ShAdB(下鏈)(參見表1)的形式提供。注釋10：當(dāng)設(shè)計與更長接頭序列一起使用的寡核苷酸(包含與商用儀器一起使用的“條碼”和“索引”序列)時，可以必要地使用PCR、鏈置換擴增或其組合來組裝寡核苷酸。在PCR期間，使用dUTP代替TTP并入尿嘧啶，其適用于后續(xù)通過UDG裂解。反鏈引物可被磷酸化，從而允許使用λ核酸外切酶或類似的5’-＞3’核酸外切酶將其消化。dA30序列可以附接到正向引物的5’端，從而實現(xiàn)鏈置換擴增。適用于組裝擴增以測序含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的區(qū)域的寡核苷酸的實例顯示于表1(下文)中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-016-bkA30-KRSF11、iSx-017-pKRSF12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-018-pKRSF13和iSx-018-pKRSR14)和(iSx-015-pKRSF10、iSx-017-pKRSF12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-018-pKRSF13、iSx-019-bkA30-KRSR15和iSx-001-bkA30)；(ii)BRAF正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-023-bkA30-BRF-F11、iSx-024-pBRF-F12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-025-pBRF-F13和iSx-026-pBRF-R14)和(iSx-022-pBRF-F10、iSx-024-pBRF-F12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-025-pBRF-F13、iSx-027-bkA30-pBRF-R15和iSx-001-bkA30)；(iii)TP53外顯子5上游正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-035-bkA30-pTP53e5F11、iSx-036-pTP53e5F12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-037-pTP53e5F13、iSx-038-pTP53e5R14)和(iSx-034-pTP53e5F10、iSx-036-pTP53e5F12、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-037-pTP53e5F13、iSx-039-bkA30-TP53e5R15和iSx-001-bkA30)；(iv)TP53外顯子5下游正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-043-bkA30-TP53e5F21、iSx-044-pTP53e5F22、iSx-008-701F.iSx-009-501R、iSx-045-pTP53e5F23和iSx-046-pTP53e5R24)和(iSx-042-pTP53e5F20、iSx-044-pTP53e5F22、iSx-008-701F.iSx-009-501R、iSx-045-pTP53e5F23、iSx-047-bkA30-TP53e5R25和iSx-001-bkA30)；(v)TP53外顯子6正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-053-bkA30-TP53e6F31、iSx-054-pTP53e6F32、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-055-pTP53e6F33和iSx-056-pTP53e6R34)和(iSx-052-pTP53e6F30、iSx-054-pTP53e6F32、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-055-pTP53e6F33、iSx-057-bkA30-TP53e6R35和iSx-001-bkA30)；(vi)TP53外顯子7正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-063-bkA30-TP53e7F41、iSx-064-pTP53e7F42、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-065-pTP53e7F43和iSx-066-pTP53e7R44)和(iSx-062-pTP53e7F40、iSx-064-pTP53e7F42、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-065-pTP53e7F43、iSx-067-pTP53e7R45和iSx-001-bkA30)；和(vii)TP53外顯子8正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-073-bkA30-TP53e8F51、iSx-074-pTP53e8F52、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-075-pTP53e8F53和iSx-076-pTP53e8R54)和(iSx-072-pTP53e8F50、iSx-074-pTP53e8F52、iSx-008-701F、iSx-009-501R、iSx-075-pTP53e8F53、iSx-077-bkA30-TP53e8R55和iSx-001-bkA30)。注釋11：在產(chǎn)生包含含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物后，這些區(qū)域可以使用靶標(biāo)特異性引物經(jīng)受滾環(huán)擴增以產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可以在固體載體上以靶標(biāo)特異性寡核苷酸捕獲所需靶標(biāo)之前或之后產(chǎn)生(參見下文注釋12)。引物可以含有內(nèi)部可裂解核苷酸堿基或脫堿基位點例如1’，2’-二脫氧核糖(dSpacer)，從而實現(xiàn)在滾環(huán)擴增期間并入dUTP以保護免于帶入污染。此類引物的實例顯示于下表1中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向引物(iSx-108-KRS-rcF26、iSx-109-KRS-rcR27)；(ii)BRAF正向和反向引物(iSx-118-BRF-rcF26、iSx-119-BRF-rcR27)；(iii)TP53外顯子5正向和反向引物(iSx-128-TP53e5-rcF66、iSx-129-TP53e5-rcR67；iSx-130-TP53e5-rcF68、iSx-131-TP53e5-rcR69)；(iv)TP53外顯子6正向和反向引物(iSx-138-TP53e6-rcF76、iSx-139-TP53e6-rcR77)；(v)TP53外顯子7正向和反向引物(iSx-148-TP53e7-rcF86、iSx-149-TP53e7-rcR87)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向引物(iSx-158-TP53e8-rcF96、iSx-159-TP53e8-rcR97)。注釋12：在產(chǎn)生包含含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物和/或產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物后，這些產(chǎn)物可以通過與更長寡核苷酸雜交來捕獲，所述更長寡核苷酸含有適用于在固體載體上后續(xù)捕獲的捕獲基團。含有適用于經(jīng)由涂覆有鏈霉親和素的固體表面捕獲的生物素基團的此類引物的實例顯示于下表1中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-013-KRS-bcF1、iSx-014-KRS-bcR2)；(ii)BRAF正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-020-BRF-bcF1、iSx-021-BRF-bcR2)；(iii)TP53外顯子5正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-030-TP53eS-bcF1、iSx-031-TP53e5-bcR2、iSx-032-TP53eS-bcF3、iSx-033-TP53e5-bcR4)；(iv)TP53外顯子6正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-050-TP53e6-bcF5、iSx-051-TP53e6-bcR6)；(v)TP53外顯子7正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-060-TP53e7-bcF7、iSx-061-TP53e7-bcR8)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-070-TP53e8-bcF9、iSx-071-TP53e8-bcR10)。注釋13：以利用以上引物和接頭設(shè)計產(chǎn)生的上述產(chǎn)物，在簇或珠粒擴增或在商業(yè)儀器上捕獲在流動池的孔、地址或表面后，可使用以下引物起始測序反應(yīng)：(i)iLx-003-PEsqP1，成對末端測序引物1；(ii)iLx-004-BrCdR1，索引引物，條碼讀段1；(iii)iLx-001-P5-BrCdR2，條碼讀段2；和(iv)iLx-005-PEsqP2，成對末端測序引物2(參見表1的引物序列)。變型1.3：(參見例如圖19-22).在此變型中，不是將短接頭連接到DNA靶標(biāo)，而是使用末端轉(zhuǎn)移酶附接短單核苷酸尾巴(平均長度約160個堿基的cfDNA)。剩余步驟與圖13和15中的一樣。通過末端轉(zhuǎn)移酶難以控制附接堿基數(shù)量。因此，寡核苷酸內(nèi)的同型核苷酸束(即polyA)的長度決定雜交Tm。還可以必要地使用具有3’-＞5’校對活性的聚合酶以移除一些過量的同型核苷酸束，直到其與其補體齊平，并且適用于以聚合酶進行延伸。變型1.4：(參見例如圖23-26).在此變型中，沒有任何東西附接到DNA靶標(biāo)(平均長度約160個堿基的cfDNA)。為捕獲所需區(qū)域，使包含以下的寡核苷酸與靶標(biāo)進行雜交：與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域。5’和3’探針區(qū)域含有規(guī)律間隔(即，10、12或15個堿基)的任選錯配。所述寡核苷酸可以含有位于一個末端(所示5’端)上的任選的阻斷基團，或任選的可裂解接頭。取決于探針設(shè)計和靶片段的始末堿基，靶序列的5’或3’端的一部分可以不雜交(圖23)。含有3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶或聚合酶組的添加允許寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸，以及靶標(biāo)的單鏈3’端的任選消化，直到其與寡核苷酸的3’探針區(qū)域齊平(圖23)，接著使靶標(biāo)的3’端延伸通過獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列。選擇雜交條件使得與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的雜交以及與靶標(biāo)的5’側(cè)序列的互補的5’探針區(qū)域的雜交在與僅一側(cè)雜交的靶標(biāo)上變得豐富(并且將形成不會環(huán)化的非生產(chǎn)性延伸產(chǎn)物)。寡核苷酸探針的3’端在靶標(biāo)上延伸會增強所述探針與所述靶標(biāo)的締合。聚合酶(或Fen核酸酶)的5’-＞3’核酸酶裂解活性在靶標(biāo)的5’側(cè)與探針的5’部分互補的位置處或其附近裂解靶標(biāo)的匹配的5’-重疊堿基，從而從真正靶標(biāo)留下可連接的5’-磷酸根。聚合酶還使用模板處的靶標(biāo)延伸寡核苷酸探針，并且產(chǎn)生可連接的5’-磷酸根(圖23和22的左側(cè))，或者不裂解所述寡核苷酸的5’端上的阻斷基團(圖23和25的右側(cè))。連接酶將延伸的3’端共價密封到可連接的5’-磷酸根以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。阻斷基團阻止寡核苷酸探針環(huán)化(右側(cè))，或者可替代地，在可裂解連接處引入缺口(例如，UDG裂解dU，接著以AP核酸內(nèi)切酶裂解脫嘌呤主鏈，左側(cè))。任選地添加尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg，也稱為8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶，其充當(dāng)N-糖基化酶和AP-裂解酶)可以用于使含受損堿基的靶標(biāo)缺口。隨后添加核酸外切酶以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，從而只留下由原始靶DNA和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序。這種方法要求酶或酶組具有靶標(biāo)依賴性5’-＞3’和3’-＞5’核酸酶活性，使得可連接的5’-磷酸根僅在5’探針區(qū)域和與5’靶區(qū)域之間存在合適雜交和互補性時產(chǎn)生。當(dāng)使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶時，挑戰(zhàn)在于避免聚合酶以其破壞5’靶區(qū)域(亦即，缺口-平移)的方式沿5’探針區(qū)域延伸短接頭而無需連接步驟。破壞原始靶DNA并用延伸的DNA來代替的缺口-平移可能無意引入聚合酶錯誤，其將會增殖并且被錯誤稱為突變。這可以通過以下方式來最小化：在分布延伸的條件下在連接酶的存在下使用具有和不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的聚合酶的混合物(例如，以1∶20的比例)，使得大多數(shù)延伸是通過不具有核酸酶活性的聚合酶進行，直到需要具有核酸酶活性的聚合酶以產(chǎn)生可連接結(jié)，接著進行聚合酶解離和連接事件以產(chǎn)生所需環(huán)狀連接產(chǎn)物。如圖25和26中所繪的寡核苷酸探針設(shè)計的使用可以不需要具有3’-＞5’核酸酶活性的聚合酶。在初始反應(yīng)中使用T4激酶以在靶標(biāo)的5’端附接磷酸根也可以用于產(chǎn)生可連接的5’磷酸根，并且無需具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。圖96-99提供不同寡核苷酸探針設(shè)計以覆蓋跨250個堿基區(qū)域的片段的一些實例。在這些圖中，潛在靶片段(跨區(qū)域偏移10個堿基)由深灰色條表示，探針區(qū)域表示為淺灰色條，其中灰色條中的黑色細(xì)線指示錯配堿基，以及獨特序列標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符表示為黑色粗線。圖104-107說明了如何設(shè)計多個探針以覆蓋約500個堿基連續(xù)區(qū)域。在圖96中，上游5’探針區(qū)域(50個堿基)與靶堿基40-90互補，而下游3’探針區(qū)域(50個堿基)與靶堿基150-200互補。對于這個實例的目的，每10個堿基中存在錯配，而復(fù)合標(biāo)識符序列為20個堿基(序列標(biāo)識符為12個堿基，且患者標(biāo)識符為8個堿基)。當(dāng)靶標(biāo)為位置1至160時，這個探針設(shè)計將允許180個堿基產(chǎn)物(其中110個堿基(即位置50至160)提供靶序列信息)的環(huán)化。當(dāng)靶標(biāo)為位置11至170時，這個探針設(shè)計將允許180個堿基產(chǎn)物(其中120個堿基(即位置50至170)提供靶序列信息)的環(huán)化。利用這個設(shè)計，分別從位置31至51開始并在位置190至210結(jié)束的靶標(biāo)推導(dǎo)出最大140個堿基的序列信息。在圖中，當(dāng)靶標(biāo)是從位置81至250時，無環(huán)狀產(chǎn)物形成。一些產(chǎn)物可以形成，然而因為5’探針區(qū)域和靶標(biāo)的5’側(cè)之間的互補性的短區(qū)域，所以存在它們不始終雜交的顧慮。在圖97中，上游5’探針區(qū)域(60個堿基)與靶堿基30-90互補，而下游3’探針區(qū)域(60個堿基)與靶堿基150-210互補。此圖類似于圖96，只是5’和3’探針區(qū)域更長。對于前5個靶標(biāo)實例，更長寡核苷酸允許捕獲更多靶DNA，使得所得環(huán)含有原始靶DNA的20個額外堿基。圖98和99延伸圖96和97的趨向，分別延伸70和80個堿基的探針區(qū)域。與之前一樣，更長探針區(qū)域確保覆蓋更多的靶標(biāo)。錯配有助于從探針的聚合酶拷貝中區(qū)分真正靶標(biāo)。當(dāng)討論的DNA含有野生型堿基時，其源自靶標(biāo)以及與其鄰接的DNA序列。當(dāng)所述DNA含有探針上錯配堿基的補體時，那么已知所述堿基產(chǎn)生自探針。圖104-107說明了如何以重疊拼接策略設(shè)計寡核苷酸探針以對更大連續(xù)區(qū)域(本文中顯示約500個堿基)測序。分別地，圖104描繪使用圖96中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針，而圖105-107描繪使用圖97-99中的設(shè)計的四種“連續(xù)”探針。描繪可在區(qū)域上產(chǎn)生的潛在160bp片段(偏移10個堿基)。在底層，顯示覆蓋其上方的所有那些片段的寡核苷酸。如果靶標(biāo)中的區(qū)域是呈淺灰色，那么將不提供可靠序列信息。如果靶標(biāo)中的區(qū)域是呈深灰色，那么將提供可靠序列信息。在此圖中，所列探針依序命名為#1、#2、#3、#4等。對于多路延伸連接步驟，將奇數(shù)探針#1、#3、#5匯集于第一寡核苷酸池組中，并且隨后將偶數(shù)探針#2、#4、#6匯集于第二池組中。這種方法避免相鄰寡核苷酸(即#1和#2)競爭結(jié)合到相同靶鏈。一旦已發(fā)生延伸-環(huán)化，可以合并這兩個池并且可以進行核酸外切酶和后續(xù)步驟(例如滾環(huán)擴增和環(huán)形測序)或者可替代地，使用任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點，在共價閉合模板上進行直接SMRT測序。用于高敏感性檢測已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的單堿基突變、小片段插入或小片段缺失突變(當(dāng)以1％至0.01％存在時)的詳細(xì)方案1.4.a.以cfDNA(或者例如從CTC分離的基因組DNA，剪切到約150bp)開始，在寡核苷酸(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)的存在下，使靶標(biāo)DNA變性(94℃1分鐘)，并且通過冷卻到所需溫度(例如，40℃或45℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸雜交到所需片段上的其互補區(qū)。降低所述反應(yīng)物的溫度，并且在退火步驟后添加DNA聚合酶(即，T4聚合酶具有強3′-＞5′校對活性)和DNA聚合酶1(具有弱3′-＞5′校對活性，但具有良好5′-＞3′活性)及任選克列諾片段(無5′-＞3′活性))、DNA連接酶(T4連接酶或大腸桿菌連接酶)和dNTP。使其在23℃或30℃下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如37℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。1.4.b.任選地，在可裂解連接處裂解寡核苷酸探針(例如，使用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解的U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，僅留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，接著使用下一代測序或者可替代地使用接頭序列作為引物結(jié)合位點在共價閉合模板上進行直接SMRT測序來識別靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸探針可以在5’側(cè)含有任選的阻斷基團以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化?？商娲兀闪呀膺B接可被包括在原始寡核苷酸中。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：T4聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和DNA聚合酶I(弱3’-＞5’校對，但良好5’-＞3’活性)和克列諾(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的DNA聚合酶I)的1∶20混合物可以在分布延伸(即更高鹽濃度)的條件下使用以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋4：連接延伸過程可以在兩個或更多個反應(yīng)管中進行，一組含有“奇數(shù)”編號的探針，第二組含有“偶數(shù)”編號的探針以避免探針競爭相同靶DNA鏈?？呻S后匯集單獨的反應(yīng)物。注釋5：在探針序列中以規(guī)律間隔(即，10、12或15個堿基)使用錯配堿基允許從通過拷貝探針鏈所產(chǎn)生的序列中區(qū)分真正靶DNA序列。下文注釋6中所列的寡核苷酸在靶序列區(qū)域中約每15個堿基含有錯配堿基。注釋6：當(dāng)設(shè)計與更長接頭序列一起使用的寡核苷酸(包含與商用儀器一起使用的“條碼”和“索引”序列)時，可以必要地使用PCR、鏈置換擴增或其組合來組裝寡核苷酸。在PCR期間，使用dUTP代替TTP并入尿嘧啶，其適用于后續(xù)通過UDG裂解。反鏈引物可以被磷酸化，從而允許使用λ核酸外切酶或類似5’-＞3’核酸外切酶將其消化。dA30序列可以附接到正向引物的5’端，從而實現(xiàn)鏈置換擴增。適用于組裝擴增以對含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的區(qū)域測序的寡核苷酸的實例顯示于表1(下文)中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-103-bkA30-KRSF21、iSx-104-pKRSF22、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-105-pKRSF23和iSx-106-pKRSR24)和(iSx-102-pKRSF20、iSx-104-pKRSF22、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-105-pKRSF23、iSx-107-bkA30-KRSR25和iSx-001-bkA30)；(ii)BRAF正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-113-bkA30-BRF-F21、iSx-114-pBRF-F22、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-115-pBRF-F23和iSx-116-pBRF-R24)和(iSx-112-pBRF-F20、iSx-114-pBRF-F22、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-115-pBRF-F23、iSx-117-bkA30-BRF-R25和iSx-001-bkA30)；(iii)TP53外顯子5正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-123-bkA30-TP53e5F61、iSx-124-pTP53e5F62、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-125-pTP53e5F63和iSx-126-pTP53e5R64)和(iSx-122-pTP53e5F60、iSx-124-pTP53e5F62、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-125-pTP53e5F63、iSx-127-bkA30-TP53e5F65和iSx-001-bkA30)；(iv)TP53外顯子6正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-133-bkA30-TP53e6F71、iSx-134-pTP53e6F72、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-135-pTP53e6F73和iSx-136-pTP53e6R74)和(iSx-132-pTP53e6F70、iSx-134-pTP53e6F72、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-135-pTP53e6F73、iSx-137-bkA30-TP53e6F75和iSx-001-bkA30)；(v)TP53外顯子7正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-143-bkA30-TP53e7F81、iSx-144-pTP53e7F82、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-145-pTP53e7F83和iSx-146-pTP53e7R84)和(iSx-142-pTP53e7F80、iSx-144-pTP53e7F82、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-145-pTP53e7F83、iSx-147-bkA30-TP53e7R85和iSx-001-bkA30)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向靶區(qū)域(iSx-001-bkA30、iSx-153-bkA30-TP53e8F91、iSx-154-pTP53e8F92、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-155-pTP53e8F93和iSx-156-pTP53e8R94)和(iSx-152-pTP53e8F90、iSx-154-pTP53e8F92、iSx-100-705F、iSx-101-502R、iSx-155-pTP53e8F93、iSx-157-bkA30-TP53e8R95和iSx-001-bkA30)。注釋7：在產(chǎn)生包含含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物后，這些區(qū)域可以經(jīng)受使用靶標(biāo)特異性引物的滾環(huán)擴增以產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可以在固體載體上以靶標(biāo)特異性寡核苷酸捕獲所需靶標(biāo)之前或之后產(chǎn)生(參見下文注釋8)。引物可以含有內(nèi)部可裂解核苷酸堿基或脫堿基位點例如1’，2’-二脫氧核糖(dSpacer)，從而實現(xiàn)在滾環(huán)擴增期間并入dUTP以保護免于帶入污染。此類引物的實例顯示于表1(下文)中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向引物(iSx-108-KRS-rcF26、iSx-109-KRS-rcR27)；(ii)BRAF正向和反向引物(iSx-118-BRF-rcF26、iSx-119-BRF-rcR27)；(iii)TP53外顯子5正向和反向引物(iSx-128-TP53e5-rcF66、iSx-129-TP53e5-rcR67；iSx-130-TP53e5-rcF68、iSx-131-TP53e5-rcR69)；(iv)TP53外顯子6正向和反向引物(iSx-138-TP53e6-rcF76、iSx-139-TP53e6-rcR77)；(v)TP53外顯子7正向和反向引物(iSx-148-TP53e7-rcF86、iSx-149-TP53e7-rcR87)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向引物(iSx-158-TP53e8-rcF96、iSx-159-TP53e8-rcR97)。注釋8：在產(chǎn)生包含含有熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物和/或產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物后，這些產(chǎn)物可以通過與更長寡核苷酸雜交來捕獲，所述更長寡核苷酸含有適用于在固體載體上后續(xù)捕獲的捕獲基團。含有適用于經(jīng)由涂覆有鏈霉親和素的固體表面捕獲的生物素基團的此類寡核苷酸的實例顯示于表1(下文)中并且包括以下：(i)KRAS正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-013-KRS-bcF1、iSx-014-KRS-bcR2)；(ii)BRAF正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-020-BRF-bcF1、iSx-021-BRF-bcR2)；(iii)TP53外顯子5正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-030-TP53e5-bcF1、iSx-031-TP53eS-bcR2；iSx-032-TP53e5-bcF3、iSx-033-TP53e5-bcR4)；(iv)TP53外顯子6正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-050-TP53e6-bcF5、iSx-051-TP53e6-bcR6)；(v)TP53外顯子7正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-060-TP53e7-bcF7、iSx-061-TP53e7-bcR8)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-070-TP53e8-bcF9、iSx-071-TP53e8-bcR10)。注釋9：以利用以上引物和接頭設(shè)計產(chǎn)生的上述產(chǎn)物，在簇或珠粒擴增或在商業(yè)儀器上捕獲在流動池的孔、地址或表面后，可使用以下引物起始測序反應(yīng)：(i)iLx-003-PEsqP1，成對末端測序引物1；(ii)iLx-004-BrCdR1，索引引物，條碼讀段1；(iii)iLx-001-P5-BrCdR2，條碼讀段2；和(iv)iLx-005-PEsqP2，成對末端測序引物2(引物序列在下表1中提供)。預(yù)測性實施例2-血漿DNA中的啟動子高甲基化(當(dāng)以1％至0.01％存在時)的高靈敏度甲基化標(biāo)記物檢測啟動子甲基化在調(diào)節(jié)基因表達中起到重要作用?；虻膯幼油ǔ＞哂懈逤pG含量的區(qū)域，稱為“CpG島”。當(dāng)具有啟動子CpG島的基因如腫瘤抑制基因關(guān)閉時，通常伴隨著啟動子內(nèi)的大多數(shù)CpG序列和第一外顯子區(qū)域甲基化。有兩種傳統(tǒng)方法來檢測甲基化變化。第一種方法利用甲基敏感性限制酶，其中基因組DNA在未甲基化時裂解，且隨后利用位于所述位點側(cè)翼的引物進行PCR擴增。如果DNA被甲基化，其應(yīng)該被擴增，如果未甲基化，不應(yīng)該擴增。這種技術(shù)的缺點是消化并不總是完全，且另外在相同序列的大部分未甲基化時，尋找低水平的甲基化DNA并不準(zhǔn)確，在血漿檢測下也是這種情況。第二種方法稱為“甲基特異性PCR”，并基于DNA的亞硫酸氫鹽處理，這就將未甲基化的C’轉(zhuǎn)化為U’。如果堿基被甲基化，那么它未被轉(zhuǎn)化。甲基特異性PCR基于使用引物和TaqMan探針，所述探針具有針對本應(yīng)被甲基化但未被甲基化的所得被轉(zhuǎn)化序列的特異性。甲基特異性PCR的優(yōu)點是能夠檢測極低水平的甲基化DNA。這種技術(shù)的另一改進是使用阻斷寡核苷酸，其與以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的未甲基化DNA的序列雜交，因此富集擴增以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的甲基化DNA。缺點是亞硫酸氫鹽處理通過產(chǎn)生缺口破壞原始DNA完整性的50％至90％。當(dāng)以來自血漿的DNA(平均長度為約160個堿基)開始時，這可成為重大問題。另外，C’轉(zhuǎn)化為U’將序列復(fù)雜性從4種堿基減少為3種堿基。因為被轉(zhuǎn)化的序列現(xiàn)在富含更多A：T，因此也需要更長的PCR引物。因此，可出現(xiàn)非特異性擴增，因為引物更有可能在密切相關(guān)但不正確的序列處誤引發(fā)。這通常使嵌套式-PCR方法成為必要，這帶來攜帶污染風(fēng)險，且通常對于多重擴增來說并不理想。方法概述：理念是忠實拷貝在目標(biāo)區(qū)域的相鄰限制位點含有甲基化的靶DNA的每個片段，附接獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符，并使它們成環(huán)以進行隨后的測序。使寡核苷酸DNA鏈成環(huán)并測序。這種方法提供以下優(yōu)點：獲得拷貝數(shù)信息(需要時)，以及以所需的最少測序獲得甲基化數(shù)據(jù)。檢測相鄰位置處的甲基化變型2.1：(參見例如圖27)。在這個變型中，起初以HinP1I裂解DNA，以顯著減少未甲基化靶標(biāo)的量。為捕獲所需甲基化區(qū)域，使包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)的序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸與靶標(biāo)雜交。所述寡核苷酸在接近上游探針的3’端和下游探針的阻斷的5’端或不可連接端兩處包含未甲基化HinP1I序列。3’端含有與靶標(biāo)的錯配，或被阻斷以防止通過聚合酶延伸。如果靶DNA被甲基化，HinP1I將使探針靶雜交體的未甲基化鏈缺口，從而釋放可延伸3’OH端和可連接的5’-磷酸根(圖27的左側(cè))。如果靶標(biāo)未甲基化，兩條鏈均裂解，從而破壞靶模板(圖27的右側(cè))。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸甲基化靶標(biāo)上的探針的釋放的3’端，然后連接至所述探針的釋放的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：2.1a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的cfDNA或富含甲基的DNA。在這個實施例中，使用HinP1I。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)，并使DNA變性(94℃1分鐘)。2.1b.使靶DNA在寡核苷酸探針(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合位點和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸含有在靠近探針的3’和5’端含有未甲基化HinP1I序列，所述寡核苷酸經(jīng)設(shè)計以含有錯配、阻斷基團或缺乏磷酸化，使得它們不是聚合酶或連接酶的底物。冷卻至37℃并添加HinP1I，如果靶DNA被甲基化，HinP1I將使探針靶雜交體的未甲基化鏈缺口，從而釋放可延伸3’OH端和可連接的5’-磷酸根。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)。在退火步驟之后或在限制性核酸內(nèi)切酶缺口步驟之后，添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP。允許在50℃下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。2.1.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1：寡核苷酸可能缺乏5’磷酸根，或在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的5’端不適用于連接。寡核苷酸可在3’側(cè)含有3’錯配、3’發(fā)夾或任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的3’端不適用于在靶標(biāo)上延伸。在兩種情況下，阻斷基團只在與甲基化靶標(biāo)雜交時通過探針的限制性酶缺口釋放。注釋2：以上實施例使用KlenTaq，一種缺乏鏈置換活性以及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。如果寡核苷酸在3’側(cè)具有阻斷基團，那么可以使用具有3’-＞5’核酸酶活性的聚合酶，而如果阻斷基團在5’側(cè)，那么可使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。注釋3：在該實施例中，限制性核酸內(nèi)切酶(HinP1I)通過在65℃下孵育15分鐘熱滅活。替代方法(或在使用熱不敏感酶如BstUI時)是以提供對同源核酸內(nèi)切酶的重新裂解有抗性的限制位點的核苷酸類似物(即5-甲基-dCTP或α-硫代磷酸dCTP)延伸。如果寡核苷酸的5’側(cè)上的限制位點未通過使用核苷酸類似物(即HinP1I)轉(zhuǎn)化為抗性形式，那么這種情況可通過使用5’側(cè)上具有阻斷基團的寡核苷酸以及含有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶解決。起初，通過限制性核酸內(nèi)切酶的缺口活性移除阻斷基團。隨后在使用核苷酸類似物的延伸步驟期間，含有5’-＞3’核酸酶活性缺口的聚合酶通過識別位點平移，用提供難以進一步裂解的位點的核苷酸置換。注釋4：在以上實施例中，進一步最小化通過識別序列的缺口平移路徑，寡核苷酸與5’探針部分的限制位點直接相鄰的部分可經(jīng)合成以含有硫代磷酸根鍵。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋5：寡核苷酸探針的靶標(biāo)特異性部分經(jīng)設(shè)計使得它們甚至在釋放非生產(chǎn)性3’和5’端后仍將與靶標(biāo)雜交。如果靶標(biāo)含有與探針部分重疊的額外限制位點，那么探針可經(jīng)合成以在那些位置具有5-甲基-dC。如果靶標(biāo)在那些位置處被甲基化，那么所述位點將在靶標(biāo)和寡核苷酸探針處被甲基化，且因此難以有缺口。然而，如果靶標(biāo)在那些位置處不被甲基化，那么所述位點將在靶鏈上將缺口，從而干擾探針與(縮短的)靶標(biāo)雜交。注釋6.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生與所需序列互補的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代的直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋7.如果寡核苷酸探針還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適合于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。相鄰甲基敏感性限制位點處甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫。當(dāng)前TCGA數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于許多不同組織位點的人類基因組上的約450,000個CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息，正常信息和腫瘤信息。然而，它并未涵蓋相鄰HinP1I位點的所有甲基化狀態(tài)，也不會區(qū)分同一條基因組DNA上的兩個位點都被甲基化。因此，為使以上測定方法最有用，創(chuàng)建相鄰甲基敏感性限制位點處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫將是有幫助的。一種這樣的方法示出在圖28中。方法概述：理念是生成只有片段的兩端都含有在原始基因組DNA中被甲基化的限制位點才能形成的小片段的文庫。所述片段具有附接有任選的獨特標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭，所述接頭現(xiàn)在能夠連接產(chǎn)生片段多聚體，所述多聚體則是附加步驟和后續(xù)測序的底物。變型2.1.1：(參見例如圖28)。這種方法示出如何發(fā)現(xiàn)整個基因組的相鄰HinP1I位點(GC*GC)處的甲基化。起始材料可為平均長度為約160bp的完整基因組DNA或cfDNA。用HinP1I裂解基因組DNA，以使DNA在未甲基化HinP1I位點斷裂。將非連接端含阻斷的5’端的短接頭連接在靶片段的兩端：補平HinP1I裂解端和修復(fù)端。(這些接頭不在連接結(jié)重新產(chǎn)生HinP1I位點)。使用未甲基化dNTP和5’阻斷的引物進行幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在剩余的HinP1I位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用HinP1I裂解這些產(chǎn)物。當(dāng)用HinP1I裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGC)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。將含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭連接至這些新產(chǎn)生的補平HinP1I裂解端。這些新接頭含有阻斷的3’端(在其非連接側(cè))或含硫代磷酸根的主鏈(在圖28中示為****)。添加雙鏈3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)后，一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有具有連接至兩側(cè)的新接頭的片段仍將為雙鏈，因為3’阻斷基團或硫代磷酸根抑制3’核酸外切酶消化。使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用5’-核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化，例如通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。連接產(chǎn)物由最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生相鄰甲基敏感性限制位點處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)方案：2.1.1a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的基因組DNA或富含甲基的DNA。在這個實施例中，使用HinP1I。任選地，加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)。連接在非連接端的5’端被阻斷的接頭上。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶標(biāo)端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。(參見下文注釋1。)2.1.1b.添加5’阻斷的引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生剩余HinP1I位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。2.1.1.c.添加HinP1I以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HinP1I裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGC)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。移除dNTP(經(jīng)由離心柱)，只回添dATP以產(chǎn)生單堿基3’A懸突。2.1.1.d.使用T4連接酶，使連接端具有單堿基3’T懸突的接頭(含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列)附接至裂解并補平的靶序列的單堿基A懸突。接頭的5’非連接側(cè)含有5’懸突，且任選地未被磷酸化。接頭的3’非連接側(cè)含有3’阻斷基團和/或硫代磷酸根以抑制3’核酸外切酶消化。2.1.1.e.添加3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)并在37℃下消化。一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有新接頭連接至兩側(cè)的片段仍將為雙鏈。核酸外切酶也將使接頭成為單鏈。任選地，用離心柱移除所需片段的消化產(chǎn)物。2.1.1.f.使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使用T4激酶使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化。連接產(chǎn)物由具有最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列的靶片段的多聚體組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1：關(guān)于接頭連接：作為在接頭與含單堿基T懸突的接頭連接之前進行補平、修復(fù)末端和A加尾(tailing)的替代方式，可利用由HinP1I產(chǎn)生的5’CpG懸突?？衫每肆兄Z(外-)和dCTP產(chǎn)生單堿基3’C懸突。接頭具有單堿基3’C懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端?？商娲兀芍苯邮褂镁哂蠧G懸突的接頭，不補平位點，但所述接頭經(jīng)設(shè)計，使得如果它們自身連接，它們產(chǎn)生AclI位點(AA^CGTT)。因此，在37℃下，在接頭和T4連接酶存在下以HinP1I(G^CGC)、AclI位點(AA^CGTT)裂解基因組DNA。片段彼此的連接被HinP1I裂解，接頭彼此的連接被AclI裂解，然而接頭與片段末端的連接不被任一酶裂解，所以這種3-酶連接混合物充當(dāng)“生化選擇”，以富集所需產(chǎn)物。注釋：2：阻斷的接頭的3’端可經(jīng)合成以在阻斷內(nèi)部位置處含有尿嘧啶或脫嘌呤(AP)位點，并在用UDG和AP核酸內(nèi)切酶處理后釋放可連接的3’端。注釋3：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋4：連接將有利于形成多聚體，方式是通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。利用亞硫酸氫鹽處理檢測相鄰位置處的甲基化以上方法對于識別和枚舉含有相鄰甲基化HinP1I位點作為此DNA片段內(nèi)的甲基化替代品的片段是理想的。然而，對于一些應(yīng)用，重要的是識別給定區(qū)域內(nèi)的個別CpG位點的甲基化狀態(tài)。因此，可能有必要用亞硫酸氫鹽處理輸入DNA，將常規(guī)C而不是甲基-C’轉(zhuǎn)化為U’。利用亞硫酸氫鹽的方法概述：理念是忠實拷貝在目標(biāo)區(qū)域的在序列的相鄰AciI限制位點(G*CGG)處被甲基化的靶DNA的每個片段，用亞硫酸氫鹽處理，附接獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符，并使它們成環(huán)，以進行隨后的測序。使寡核苷酸DNA鏈成環(huán)并測序。這種方法提供以下優(yōu)點：獲得拷貝數(shù)信息(需要時)，以及以所需的最少測序獲得甲基化數(shù)據(jù)。所述理念利用識別序列對AciI的獨特性質(zhì)。所述酶裂解一個方向上的3.5堿基識別序列G^CGG，和第二方向上的C^CGC。如果用亞硫酸氫鹽在第一方向(G*CGG)上處理甲基化的AciI位點，那么所述位點將保持不變(G*CGG)，而在第二方向(C*CGC)上處理時，它將發(fā)生變化(U*CGU，其中*C表示5-meC)。幾輪PCR擴增后，將5-甲基C轉(zhuǎn)化為C，同時將U轉(zhuǎn)化為T。因此，第一方向上的甲基化的AciI位點保持GCGG，第一方向上的未甲基化的AciI位點被轉(zhuǎn)化為GTGG，第二方向上的甲基化的AciI位點被轉(zhuǎn)化為TCGT，且第二方向上的未甲基化的AciI位點被轉(zhuǎn)化為TTGT。當(dāng)用AciI裂解時，只有原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點將產(chǎn)生3’和5’端都是可連接的片段。這種方法的一個獨特特征在于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化產(chǎn)生兩條非互補鏈。因此，上鏈將具有相鄰G*CGG序列，且即使存在間插C*CGC序列也無關(guān)緊要，因為它被轉(zhuǎn)化為U*CGU，在PCR后轉(zhuǎn)化為不被認(rèn)為是AciI位點的TCGT。另外，即使存在間插G*CGG或GCGG(即未甲基化)位點，它也不會被AciI缺口，因為它將在為單鏈的區(qū)域中。甚至更好地，形式C*CGC的上鏈上的序列將為下鏈上的G*CGG。下鏈也可以用于詢問甲基化狀態(tài)，且因為兩個序列現(xiàn)在極為不同，上鏈和下鏈的寡核苷酸探針將不會彼此雜交，只會與轉(zhuǎn)化的靶標(biāo)雜交。因此，這種方法允許利用上鏈和下鏈的信息獲得關(guān)于啟動子的詳細(xì)甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理DNA以將未甲基化的DNA轉(zhuǎn)化為不可被限制性酶裂解的序列(但如果被甲基化，它仍可被相同限制性酶裂解)的原理可擴展至一些附加的限制位點。例如，BstUI位點(CG^CG)在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后保留其相同序列，只要兩個CG位點都被甲基化(即*CG*CG)。同樣，Hpy99I位點(CGWCG^)在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后也保留其相同序列，只要兩個CG位點都被甲基化(即*CGW*CG)。在不同類型的實施例中，HpyCH2IV(A^CGT)將裂解形式A*CGT和A*CGC在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的序列，因為它們都變成A*CGT。因此，下文針對AciI考慮的變型同樣有效，但不限于限制性核酸內(nèi)切酶BstUI、Hpy99I、HpyCH2IV和它們的同裂酶。變型2.2：(參見例如圖29-30).在這個變型中，將含5-甲基C的短接頭連接至DNA末端。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得所述鏈不互補，所以它們變成單鏈。幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在剩余的AciI位點未甲基化的產(chǎn)物。然后用AciI裂解這些產(chǎn)物。只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生現(xiàn)在兩端可連接的片段。為捕獲所需區(qū)域，包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)的序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸探針與靶標(biāo)雜交。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸未甲基化靶標(biāo)的3’端，然后連接至所述靶標(biāo)的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：2.2.a.連接在含有5-甲基C的接頭上，以在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后保留序列。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補且解開鏈。2.2.b.添加引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余AciI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。2.2.c.添加AciI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用AciI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。2.2.d.使靶DNA在寡核苷酸探針(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合位點和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP，以允許在50℃下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。2.2.e.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.寡核苷酸可缺乏5’磷酸根，或在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的5’端不適用于連接。注釋2.以上實施例使用KlenTaq，一種缺乏鏈置換活性以及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。如果寡核苷酸在5’側(cè)具有阻斷基團，那么可以使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。注釋3.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋4.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。在變型2.2中，使用聚合酶和連接酶形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的共價閉合環(huán)。這也可以只使用連接酶完成。變型2.3：(參見例如圖31-32).在這個變型中，將含5-甲基C的短接頭連接至DNA末端。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得所述鏈不互補，所以它們變成單鏈。幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在剩余的AciI位點未甲基化的產(chǎn)物。然后用AciI裂解這些產(chǎn)物。只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生現(xiàn)在兩端可連接的片段。為捕獲所需的未甲基化區(qū)域，部分雙鏈寡核苷酸對與靶標(biāo)雜交，所述部分雙鏈寡核苷酸對包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一寡核苷酸探針鏈互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一寡核苷酸探針鏈互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針。添加連接酶允許靶標(biāo)的3’端連接至第二寡核苷酸探針的5’端，且允許靶標(biāo)的5’端連接至第二寡核苷酸探針的3’端，以形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈且不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：2.3.a.連接在含有5-甲基C的接頭上，以在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后保留序列。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。2.3.b.添加引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余AciI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。2.3.c.添加AciI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用AciI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。2.3.d.使靶DNA在部分雙鏈寡核苷酸對(包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一寡核苷酸探針互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一寡核苷酸探針互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)與所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，以允許在60℃下連接產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。2.3.e.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋2.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。相鄰甲基敏感性限制位點(AciI位點)處甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫。當(dāng)前TCGA數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于許多不同組織位點的人類基因組上的約450,000個CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息，正常信息和腫瘤信息。然而，它并未涵蓋相鄰AciI位點的所有甲基化狀態(tài)，也不會區(qū)分同一條基因組DNA上的兩個位點都被甲基化。因此，為使以上測定方法最有用，創(chuàng)建相同方向的相鄰AciI限制位點(GCGG)處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫將是有幫助的。這種方法也將包括另一方向的相鄰AciI限制位點(CCGC)，因為它們在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后在相反鏈上將為GCGG。一種這樣的方法示出在圖33中。方法概述：理念是生成只有片段的兩端都含有在原始基因組DNA中被甲基化的限制位點才能形成的小片段的文庫。這種理念利用識別序列對AciI的獨特性質(zhì)。所述酶裂解一個方向上的3.5堿基識別序列G^CGG，和另一方向上的C^CGC。以甲基化AciI位點開始并用亞硫酸氫鹽處理。在第一方向(G*CGG)上，所述位點將保持不變，而在第二方向上，它將發(fā)生變化(U*CGU，其中*C表示5-meC)。幾輪PCR擴增后，第一位點轉(zhuǎn)化為GCGG，被AciI識別，而第二位點轉(zhuǎn)化為TCGT，不被裂解。因此，AciI也可用于在亞硫酸氫鹽處理后識別獨特甲基化的序列。所述片段具有附接有任選的獨特標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭，所述接頭現(xiàn)在能夠連接產(chǎn)生片段多聚體，所述多聚體則是附加步驟和后續(xù)測序的底物。變型2.3.1：(參見例如圖33)。這種方法示出如何發(fā)現(xiàn)整個基因組的相鄰AciI位點(GC*GG)處的甲基化。起始材料可為平均長度為約160bp的完整基因組DNA或cfDNA。將非連接端含有阻斷的5’端的短接頭連接至DNA末端上。亞硫酸氫鹽處理DNA，將常規(guī)C但非甲基-C轉(zhuǎn)化為U。使用未甲基化dNTP和5’阻斷引物進行幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在剩余的AciI位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用AciI裂解這些產(chǎn)物。當(dāng)用AciI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說可連接的)。將含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭連接至這些新產(chǎn)生的補平AciI裂解端上。這些新接頭含有在其非連接側(cè)的阻斷的3’端或含硫代磷酸根的主鏈(在圖33中示為****)。添加雙鏈3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)后，一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有具有連接至兩側(cè)的新接頭的片段仍將為雙鏈，因為3’阻斷基團或硫代磷酸根抑制3’核酸外切酶消化。使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用5’-核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化，例如通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。連接產(chǎn)物由最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相同方向的相鄰AciI序列(即GCGG)組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生相鄰AciI限制位點處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)方案：2.3.1.a.連接在非連接端的5’端被阻斷的接頭上。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端上。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。2.3.1.b.添加5’阻斷的引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余AciI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。2.3.1.c.添加AciI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用AciI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中被甲基化的相鄰AciI位點(GCGG)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。移除dNTP(經(jīng)由離心柱)，只回添dATP以產(chǎn)生單堿基3’A懸突。2.3.1.d.使用T4連接酶，使連接端具有單堿基3’T懸突的接頭(含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列)附接至裂解并補平的靶序列的單堿基A懸突。接頭的5’非連接側(cè)含有5’懸突，且任選地未被磷酸化。接頭的3’非連接側(cè)含有3’阻斷基團和/或硫代磷酸根以抑制3’核酸外切酶消化。2.3.1.e.添加3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)并在37℃下消化。一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有新接頭連接至兩側(cè)的片段仍將為雙鏈。核酸外切酶也將使接頭成為單鏈。任選地，用離心柱移除所需片段的消化產(chǎn)物。2.3.1.f.使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使用T4激酶使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化。連接產(chǎn)物由具有最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰AciI序列的靶片段的多聚體組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋：1：阻斷的接頭的3’端可經(jīng)合成以在阻斷內(nèi)部位置處含有尿嘧啶或脫嘌呤(AP)位點，并在用UDG和AP核酸內(nèi)切酶處理后釋放可連接的3’端。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：連接將有利于形成多聚體，方式是通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。預(yù)測性實施例3-總血漿DNA中的啟動子低甲基化(當(dāng)以1％至0.1％存在時)的高靈敏度未甲基化標(biāo)記物檢測.腫瘤中的大多數(shù)甲基化變化是由于低甲基化造成。當(dāng)此類低甲基化出現(xiàn)在先前被甲基化的啟動子區(qū)域時，可導(dǎo)致基因如癌基因表達增加。另外，重復(fù)元件區(qū)域和移動元件通常被總體甲基化沉默，但在腫瘤變得低甲基化時此類沉默失效。雖然甲基敏感性限制性酶可用于幫助選擇性擴增和識別低水平甲基化的序列，但這種方法無法識別低水平未甲基化的序列?？墒褂脕喠蛩釟潲}處理和針對亞硫酸氫鹽修飾的未甲基化DNA的PCR引物，但此類引物富含AT，且可能難以擴增所有所需片段，特別是在試圖進行多重PCR時。方法概述：理念是忠實拷貝在目標(biāo)區(qū)域的相鄰限制位點處未被甲基化的靶DNA的每個片段，附接獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符，并使它們成環(huán)，以進行隨后的測序。使寡核苷酸DNA鏈成環(huán)并測序。這種方法提供以下優(yōu)點：獲得拷貝數(shù)信息(需要時)，以及以所需的最少測序獲得未甲基化數(shù)據(jù)。變型3.1：(參見例如，圖34和35)。在這個變型中，用HinP1I(或其它甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶)裂解DNA，以產(chǎn)生可連接的3’端和5’端。為捕獲所需未甲基化的區(qū)域，包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸探針與靶標(biāo)雜交。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸未甲基化的靶標(biāo)的3’端，然后連接至所述靶標(biāo)的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：3.1a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的cfDNA。這個實施例說明了HinP1I的使用。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)，并使DNA變性(94℃1分鐘)。3.1b.使靶DNA在寡核苷酸(包含與靶標(biāo)5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合位點和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP，以允許在50℃下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.1.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.寡核苷酸可缺乏5’磷酸根，或在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的5’端不適用于連接。注釋2.以上實施例使用KlenTaq，一種缺乏鏈置換活性以及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。如果寡核苷酸在5’側(cè)具有阻斷基團，那么可以使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。注釋3.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。當(dāng)使用直接SMRT測序時，可直接確定原始模板DNA失去甲基化狀態(tài)。注釋4.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋5.可使用相同方法鑒定在啟動子區(qū)域處被甲基化的區(qū)域(參見例如，圖36和37)。用甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)的混合物以及甲基不敏感性酶(HaeIII和MspI)裂解分離的cfDNA。圖示出這種情況，其中甲基化AciI位點在兩個HaeIII位點內(nèi)部并且與所述兩個HaeIII位點側(cè)接。即使只有一個甲基不敏感限制位點，這種方法也有效(參見例如，圖39、40、42、43)。如果甲基不敏感性限制性核酸內(nèi)切酶釋放活性3’端，那么所述末端將通過Taq聚合酶(具有5’-3’核酸酶活性)在寡核苷酸上延伸，且所述聚合酶將延伸并裂解靶標(biāo)中的額外5’序列，從而在靶標(biāo)上產(chǎn)生適合連接以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物的可連接的5’磷酸根(圖39)。如果甲基不敏感限制性核酸內(nèi)切酶釋放活性5’磷酸根，那么使用具有3’-5’核酸酶活性的聚合酶將消化靶標(biāo)中的額外3’序列(如果需要)，那么一旦滑到寡核苷酸探針的互補序列，聚合酶將使靶鏈向上延伸至靶標(biāo)上的可連接的5’磷酸根，且缺口被連接酶密封以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物(圖40)。核酸外切酶消化后，從甲基敏感性限制性核酸內(nèi)切酶裂解存活下來的鏈?zhǔn)谴藚^(qū)域的甲基化標(biāo)記。另外，當(dāng)對共價閉合模板使用直接SMRT測序時，可確定原始模板DNA的甲基化狀態(tài)。注釋6.可使用相同方法鑒定啟動子區(qū)域中Bsh1236I位點處被甲基化的區(qū)域(參見例如，圖38、41、44、45、46)。用Bsh1236I(CGCG)以及甲基不敏感酶(HaeIII)裂解分離的cfDNA。圖38示出這種情況，其中甲基化Bsh1236I位點在兩個HaeIII位點內(nèi)部并且與所述兩個HaeIII位點側(cè)接。即使只有一個甲基不敏感限制位點，這種方法也有效(參見例如，41、44、45)。如果甲基不敏感限制性核酸內(nèi)切酶釋放活性3’端，那么所述末端將通過Taq聚合酶(具有5’-3’核酸酶活性)在寡核苷酸上延伸，且所述聚合酶將延伸并裂解靶標(biāo)中的額外5’序列，從而在靶標(biāo)上產(chǎn)生適用于連接以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物的可連接的5’磷酸根(圖38)。如果甲基不敏感限制性核酸內(nèi)切酶釋放活性的5’磷酸根，那么使用具有3’-5’核酸酶活性的聚合酶將消化靶標(biāo)中的額外3’序列(如果需要)，那么一旦滑到寡核苷酸探針上的互補序列，聚合酶將使靶標(biāo)鏈向上延伸至靶標(biāo)上的可連接的5’磷酸根，且缺口被連接酶密封，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物(圖41&45)。核酸外切酶消化后，從甲基敏感性限制性核酸內(nèi)切酶裂解存活下來的鏈?zhǔn)谴藚^(qū)域的甲基化標(biāo)記。利用Bst聚合酶在BstUI(CGCG)存在下進行滾環(huán)復(fù)制確保位點在原始樣品中被甲基化。在變型3.1中，使用聚合酶和連接酶形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的共價閉合環(huán)。這也可以只使用連接酶完成。變型3.2：(參見例如，圖47和48)。在這個變型中，用HinP1I(或其它甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶)裂解DNA，以產(chǎn)生可連接的3’端和5’端。為捕獲所需未甲基化的區(qū)域，部分雙鏈寡核苷酸對與靶標(biāo)雜交，所述部分雙鏈寡核苷酸對包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一探針互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一探針互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針。添加連接酶允許靶標(biāo)的3’端連接至第二寡核苷酸探針的5’端，且允許靶標(biāo)的5’端連接至第二寡核苷酸探針的3’端，以形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：3.2.a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的cfDNA。在這個實施例中，使用HinP1I。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)，并使DNA變性(94℃1分鐘)。3.2.b.使靶DNA在部分雙鏈寡核苷酸對(包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一鏈互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一鏈互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)與所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，以允許在60℃下連接產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.2.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化的DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。當(dāng)使用直接SMRT測序時，可直接確定原始模板DNA失去甲基化狀態(tài)。注釋2.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋3.可使用相同方法鑒定啟動子區(qū)域被甲基化的區(qū)域(參見例如，圖49和51)。用甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)的混合物以及甲基不敏感酶(HaeIII和MspI)裂解分離的cfDNA。這些圖示出在兩個HaeIII位點內(nèi)部并且與所述兩個HaeIII位點側(cè)接的甲基化AciI位點。從甲基敏感性限制性核酸內(nèi)切酶裂解存活下來的鏈?zhǔn)谴藚^(qū)域的甲基化標(biāo)記。另外，當(dāng)對共價閉合模板使用直接SMRT測序時，可確定原始模板DNA的甲基化狀態(tài)。相鄰甲基敏感性限制位點處未甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫當(dāng)前TCGA數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于許多不同組織位置的人類基因組上的約450,000個CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息，正常信息和腫瘤信息。然而，它并未涵蓋相鄰HinP1I位點的所有未甲基化狀態(tài)，也不會區(qū)分同一條基因組DNA上的兩個位點都未被甲基化。因此，為使以上測定方法最有用，創(chuàng)建相鄰甲基敏感性限制位點處的未甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫將是有幫助的。一種這樣的方法示出在圖51中。方法概述：理念是生成只有片段的兩端都含有在原始基因組DNA中未被甲基化的限制位點才能形成的小片段的文庫。所述片段具有附接有任選的獨特標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭，所述接頭現(xiàn)在能夠連接產(chǎn)生片段多聚體，所述多聚體則是附加步驟和后續(xù)測序的底物。變型3.2.1：(參見例如圖51)。這種方法示出如何發(fā)現(xiàn)整個基因組的相鄰HinP1I位點(GCGC)處的未甲基化。起始材料可為平均長度為約160bp的完整基因組DNA或cfDNA。將非連接端含有阻斷的5’端的短接頭連接至靶DNA上。用HinP1I裂解基因組DNA，以使DNA在未甲基化的HinP1I位點處斷裂。將含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭連接至這些新產(chǎn)生的補平HinP1I裂解端斷行。這些新接頭含有在其非連接側(cè)的阻斷的3’端或含硫代磷酸根的主鏈(在圖51中示為****)。添加雙鏈3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)后，一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有具有連接至兩側(cè)的新接頭的片段仍將為雙鏈，因為3’阻斷基團或硫代磷酸根抑制3’核酸外切酶消化。使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用5’-核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化，例如通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。連接產(chǎn)物由最初在靶DNA中未被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生相鄰甲基敏感性限制位點處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)方案：3.2.1a.連接在非連接端的5’端被阻斷的接頭上。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的基因組DNA或富含甲基的DNA。在這個實施例中，使用HinP1I。任選地，加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)。3.2.1.b.添加HinP1I以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HinP1I裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGC)的靶標(biāo)將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。移除dNTP(經(jīng)由離心柱)，并只回添dATP以產(chǎn)生單堿基3’A懸突。3.2.1.c.使用T4連接酶，使連接端具有單堿基3’T懸突的接頭(含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列)附接至裂解并補平的靶序列的單堿基A懸突。接頭的5’非連接側(cè)含有5’懸突，且任選地未被磷酸化。接頭的3’非連接側(cè)含有3’阻斷基團和/或硫代磷酸根以抑制3’核酸外切酶消化。3.2.1.d.添加3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)并在37℃下消化。一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有新接頭連接至兩側(cè)的片段仍將為雙鏈。核酸外切酶也將使接頭成為單鏈。任選地，用離心柱移除所需片段的消化產(chǎn)物。3.2.1.1.e.使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接的，方式為(i)使用T4激酶使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化。連接產(chǎn)物由具有最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列的靶片段的多聚體組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋：1：阻斷的接頭的3’端可經(jīng)合成以在阻斷內(nèi)部位置處含有尿嘧啶或脫嘌呤(AP)位點，并在用UDG和AP核酸內(nèi)切酶處理后釋放可連接的3’端。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：連接將有利于形成多聚體，方式是通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。注釋4.可使用相同方法鑒定啟動子區(qū)域被甲基化的區(qū)域(參見例如，圖52)。用甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)的混合物裂解分離的cfDNA，并連接在具有阻斷的5’端的短接頭上。然后用甲基不敏感性酶(HaeIII和MspI)裂解靶標(biāo)。此圖中示出AciI和HaeIII。從甲基敏感性限制性核酸內(nèi)切酶裂解存活下來的鏈?zhǔn)谴藚^(qū)域的甲基化標(biāo)記。當(dāng)用HaeIII裂解時，只有原始靶標(biāo)中具有甲基化AciI位點的相鄰HaeIII位點(GGCC)才產(chǎn)生未阻斷的片段。更長接頭的后續(xù)連接如上所述。當(dāng)對連接產(chǎn)物使用直接SMRT測序時，可確定原始模板DNA的甲基化狀態(tài)。檢測啟動子區(qū)域中的未甲基化相鄰位點可能所需測定啟動子區(qū)域中的兩個甲基敏感限制位點之間的CpG序列的未甲基化狀態(tài)。這與以上方法類似，且包括額外的亞硫酸氫鹽步驟。方法綜述：理念是忠實拷貝在目標(biāo)區(qū)域的相鄰限制位點未被甲基化的靶DNA的每個片段，用亞硫酸氫鹽處理，附接獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符，并使它們成環(huán)，以進行隨后的測序。使寡核苷酸DNA鏈成環(huán)并測序。這種方法提供以下優(yōu)點：獲得拷貝數(shù)信息(需要時)，以及以所需的最少測序獲得未甲基化數(shù)據(jù)。變型3.3：(參見例如，圖53和54)。在這個變型中，用HinP1I(或其它甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶)裂解DNA，以產(chǎn)生可連接的3’端和5’端。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得這些鏈不互補，所以它們變成單鏈。為捕獲所需未甲基化區(qū)域，包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)的序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸探針與靶標(biāo)雜交。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸未甲基化的靶標(biāo)的3’端，然后連接至所述靶標(biāo)的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：3.3.a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的cfDNA。這個實施例描述HinP1I。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)，并使DNA變性(94℃1分鐘)。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。3.3.b.使靶DNA在寡核苷酸(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)的序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合位點和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘，如果需要)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP，以允許在50℃下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.3.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化的DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.寡核苷酸可缺乏5’磷酸根，或在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的5’端不適用于連接。注釋2.以上實施例使用KlenTaq，一種缺乏鏈置換活性以及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。如果寡核苷酸在5’側(cè)具有阻斷基團，那么可以使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。注釋3.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋4.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。在變型3.3中，使用聚合酶和連接酶形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的共價閉合環(huán)。這也可以只使用連接酶完成。變型3.4：(參見例如，圖55和56)。在這個變型中，用HinP1I(或其它甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶)裂解DNA，以產(chǎn)生可連接的3’端和5’端，隨后進行亞硫酸氫鹽處理。為捕獲所需未甲基化的區(qū)域，部分雙鏈寡核苷酸對與靶標(biāo)雜交，所述部分雙鏈寡核苷酸對包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一探針互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一探針互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針。添加連接酶允許靶標(biāo)的3’端連接至第二寡核苷酸探針的5’端，且允許靶標(biāo)的5’端連接至第二寡核苷酸探針的3’端，以形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案3.4.a.用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的cfDNA。這個實施例使用HinP1I。加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)，并使DNA變性(94℃1分鐘)。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。3.4.b.使靶DNA在部分雙鏈寡核苷酸對(包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一鏈互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一鏈互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)與所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，以允許在60℃下連接產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.4.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。當(dāng)使用直接SMRT測序時，可直接確定原始模板DNA失去甲基化狀態(tài)。注釋2.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。相鄰甲基敏感性限制位點處未甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫.當(dāng)前TCGA數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于許多不同組織位置的人類基因組上的約450,000個CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息，正常信息和腫瘤信息。然而，它并未涵蓋相鄰HinP1I位點和這些位點間的CpG位點的所有未甲基化狀態(tài)，也不會區(qū)分同一條基因組DNA上的兩個位點都未被甲基化。因此，為使以上測定方法最有用，創(chuàng)建相鄰甲基敏感性限制位點處的未甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫將是有幫助的。一種這樣的方法示出在圖57中。方法綜述：理念是生成只有片段的兩端都含有在原始基因組DNA中未被甲基化的限制位點才能形成的小片段的文庫。所述片段具有附接有任選的獨特標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭，所述接頭現(xiàn)在能夠連接產(chǎn)生片段多聚體，然后用亞硫酸氫鹽處理，以顯露甲基化或未甲基化的位置，所述多聚體則是附加步驟和后續(xù)測序的底物。變型3.4.1：(參見例如圖57)。這種方法示出如何發(fā)現(xiàn)整個基因組的相鄰HinP1I位點(GCGC)處的未甲基化。起始材料可為平均長度為約160bp的完整基因組DNA或cfDNA。將非連接端處含有阻斷的5’端的短接頭連接至靶DNA上。用HinP1I裂解基因組DNA，以使DNA在未甲基化的HinP1I位點處斷裂。將含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭連接至這些新產(chǎn)生的補平HinP1I裂解端上。這些新接頭含有在其非連接側(cè)的阻斷的3’端或含硫代磷酸根的主鏈(在圖57中示為****)。添加雙鏈3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)后，一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有具有連接至兩側(cè)的新接頭的片段仍將為雙鏈，因為3’阻斷基團或硫代磷酸根抑制3’核酸外切酶消化。使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用5’-核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化，例如通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。連接產(chǎn)物由最初在靶DNA中未被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列組成。然后產(chǎn)物與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。這些單鏈產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生相鄰甲基敏感性限制位點處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)方案：3.4.1a.連接在非連接端的5’端被阻斷的接頭上。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。用一種或多種甲基敏感性酶(AciI、HinP1I、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解分離的基因組DNA或富含甲基的DNA。在這個實施例中，使用HinP1I。任選地，加熱殺死核酸內(nèi)切酶(65℃持續(xù)15分鐘)。3.4.1.b.添加HinP1I以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HinP1I裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HinP1I位點(GCGC)的靶標(biāo)將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。來自Taq聚合酶的殘余聚合酶將補平2-堿基懸突(任選地將溫度升至60℃)。移除dNTP(經(jīng)由離心柱)，只回添dATP以產(chǎn)生單堿基3’A懸突。3.4.1.c.使用T4連接酶，使連接端具有單堿基3’T懸突的接頭(含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列)附接至裂解并補平的靶標(biāo)序列的單堿基A懸突。接頭的5’非連接側(cè)含有5’懸突，且任選地未被磷酸化。接頭的3’非連接側(cè)含有3’阻斷基團和/或硫代磷酸根以抑制3’核酸外切酶消化。3.4.1.d.添加3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)并在37℃下消化。一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有新接頭連接至兩側(cè)的片段仍將為雙鏈。核酸外切酶也將使接頭成為單鏈。任選地，用離心柱移除所需片段的消化產(chǎn)物。3.4.1.1.e.使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接的，方式為(i)使用T4激酶使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化。連接產(chǎn)物由具有最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰HinP1I序列的靶片段的多聚體組成。連接產(chǎn)物與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，這些鏈將不再彼此互補，且解開鏈。這些單鏈產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋：1：更長阻斷接頭的3’端可經(jīng)合成以在阻斷內(nèi)部位置處含有尿嘧啶或脫嘌呤(AP)位點，并在用UDG和AP核酸內(nèi)切酶處理后釋放可連接的3’端。另外，這些接頭可經(jīng)合成具有5-甲基C，使得在用亞硫酸氫鹽處理后，它們保持原始狀態(tài)。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：連接將有利于形成多聚體，方式是通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。檢測給定區(qū)域內(nèi)的個別CpG位點的未甲基化狀態(tài)以上方法對于識別和枚舉含有相鄰未甲基化的HinP1I位點作為此DNA片段內(nèi)的未甲基化替代品的片段是理想的。然而，對于一些應(yīng)用，重要的是識別給定區(qū)域內(nèi)的個別CpG位點的未甲基化狀態(tài)。因此，可能有必要用亞硫酸氫鹽處理輸入DNA，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。利用亞硫酸氫鹽的方法概述：理念是忠實拷貝在目標(biāo)區(qū)域的在序列的相鄰HphI限制位點(GGTGA)處未被甲基化的靶DNA的每個片段，用亞硫酸氫鹽處理(將GGCGA轉(zhuǎn)化為GGTGA)，附接獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符，并使它們成環(huán)，以進行隨后的測序。使寡核苷酸DNA鏈成環(huán)并測序。這種方法提供以下優(yōu)點：獲得拷貝數(shù)信息(需要時)，以及以所需的最少測序獲得甲基化數(shù)據(jù)。所述理念利用識別序列對HphI的獨特性質(zhì)。所述酶裂解一個方向上的4.5堿基識別序列GGTGA，和另一方向上的TCACC。如果用亞硫酸氫鹽在第一方向上處理未甲基化的GGCGA位點，所述位點將變成HphI識別序列GGTGA。幾輪PCR擴增后，5-甲基C被轉(zhuǎn)化為C，而U被轉(zhuǎn)化為T。當(dāng)用HphI裂解時，只有原始靶標(biāo)中的未甲基化的相鄰位點將產(chǎn)生3’端和5’端都是可連接的片段。這種方法的一個獨特特征在于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化產(chǎn)生兩條非互補鏈。因此，上鏈將具有相鄰的GGCGA或GGTGA序列，且即使存在間插TCACC序列也無關(guān)緊要，因為它被轉(zhuǎn)化為TUAUU，其不被認(rèn)為是HphI位點。甚至更好地，形式TCGCC的上鏈上的序列將為下鏈上的GGCGA。下鏈也可以用于詢問甲基化狀態(tài)，且因為兩條序列現(xiàn)在極為不同，上鏈和下鏈的寡核苷酸探針將不會彼此雜交，只會與轉(zhuǎn)化的靶標(biāo)雜交。因此，這種方法允許利用上鏈和下鏈的信息獲得關(guān)于啟動子的詳細(xì)甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理DNA以將未甲基化DNA轉(zhuǎn)化為可被限制性酶裂解的序列(但如果被甲基化，它不可被相同限制性酶裂解)的原理可擴展至一些附加限制位點。例如，序列CCGTC將被轉(zhuǎn)化為BccI位點(CCATC)，只要內(nèi)部CG不被甲基化。(這是由相反鏈即GACGG轉(zhuǎn)化為BccI的相反鏈識別序列；即GATGG造成的)。同樣，序列GGACG將被轉(zhuǎn)化為FokI位點(GGATG)，只要內(nèi)部CG不被甲基化。因此，下文針對HphI考慮的變型同樣有效，但不限于限制性核酸內(nèi)切酶BccI、FokI和它們的同裂酶。變型3.5：(參見側(cè)如，圖58和59)。在這個變型中，將含5-甲基C的短接頭連接至DNA末端上。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得這些鏈不互補，所以它們變成單鏈。幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在HphI位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用HphI裂解這些產(chǎn)物。只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰“HphI”位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生現(xiàn)在在兩端可連接的片段。為捕獲所需區(qū)域，包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸探針與靶標(biāo)雜交。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸未甲基化的靶標(biāo)的3’端，然后連接至所述靶標(biāo)的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：3.5.a.連接在含有5-甲基C的接頭上，以在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后保留序列。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，這些鏈將不再彼此互補，且解開鏈。3.5.b.添加引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余HphI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。3.5.c.添加HphI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HphI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HphI位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。3.5.d.使靶DNA在寡核苷酸(包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合位點和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP，以允許在50℃下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.5.e.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.寡核苷酸可缺乏5’磷酸根，或在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，使得寡核苷酸的5’端不適用于連接。注釋2.以上實施例使用KlenTaq，一種缺乏鏈置換活性以及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。如果寡核苷酸在5’側(cè)具有阻斷基團，那么可以使用具有5’-＞3’核酸酶活性的聚合酶。注釋3.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋4.如果寡核苷酸探針還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。在變型3.5中，使用聚合酶和連接酶形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的共價閉合環(huán)。這也可以只使用連接酶完成。變型3.6：(參見例如，圖60和61)。在這個變型中，將含5-甲基C的短接頭連接至DNA末端上。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得這些鏈不互補，所以它們變成單鏈。幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在HphI位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用HphI裂解這些產(chǎn)物。只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰“HphI”位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生現(xiàn)在兩端可連接的片段。為捕獲所需未甲基化區(qū)域，部分雙鏈寡核苷酸對與靶標(biāo)雜交，所述部分雙鏈寡核苷酸對包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一鏈互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一鏈互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針。添加連接酶允許靶標(biāo)的3’端連接至第二寡核苷酸探針的5’端，且允許靶標(biāo)的5’端連接至第二寡核苷酸探針的3’端，以形成含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。通過堅持使用限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’OH和5’磷酸根，這避免了錯誤信號，且還應(yīng)去除任何非特異性連接信號。因此，基因組DNA的在純化后為單鏈或不被裂解的任何罕見片段將不會形成生產(chǎn)性底物，且將被核酸外切酶處理步驟破壞。啟動子未甲基化的高靈敏度檢測的詳細(xì)方案：3.6.a連接在含有5-甲基C的接頭上，以在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后保留序列。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，這些鏈將不再彼此互補，且解開鏈。3.6.b.添加引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余HphI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。3.6.c.添加HphI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HphI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HphI位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。3.6.d.使靶DNA在部分雙鏈寡核苷酸對(包含具有與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的第一寡核苷酸探針，以及包含與所述第一鏈互補的5’區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列和與所述第一鏈互補的3’區(qū)域的第二寡核苷酸探針)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度(例如50℃-60℃持續(xù)2小時)與所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，以允許在60℃下連接產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。3.6.e.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由甲基化DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋1.環(huán)狀產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋2.如果寡核苷酸探針還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。相鄰HphI限制位點處甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫當(dāng)前TCGA數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于許多不同組織位置的人類基因組上的約450,000個CpG位點的甲基化狀態(tài)的信息，正常信息和腫瘤信息。然而，它并未涵蓋相鄰AciI位點的所有未甲基化狀態(tài)，也不會區(qū)分同一條基因組DNA上的兩個位點都被甲基化。因此，為使以上測定方法最有用，創(chuàng)建相同方向的相鄰HphI限制位點(將GGCGA轉(zhuǎn)化為GGTGA)處的甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫將是有幫助的。這種方法也將包括另一方向的相鄰HphI限制位點(TCACC和TCGCC)，因為它們在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后在相反鏈上將為GGTGA。一種這樣的方法示出在圖62中。方法綜述：理念是生成只有片段的兩端都含有在原始基因組DNA中未被甲基化的被轉(zhuǎn)化GGCGA(至GGTGA)才能形成的小片段的文庫。所述理念利用識別序列對HphI的獨特性質(zhì)。所述酶裂解一個方向上的4.5堿基識別序列GGTGA，和另一方向上的TCACC。如果用亞硫酸氫鹽在第一方向上處理未甲基化的GGCGA位點，所述位點將變成HphI識別序列GGTGA。幾輪PCR擴增后，5-甲基C被轉(zhuǎn)化為C，而U被轉(zhuǎn)化為T。當(dāng)用HphI裂解時，只有原始靶標(biāo)中的未甲基化的相鄰位點將產(chǎn)生3’端和5’端都可連接的片段。所述片段具有附接有任選的獨特標(biāo)識符和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭，所述接頭現(xiàn)在能夠連接產(chǎn)生片段多聚體，所述多聚體則是附加步驟和后續(xù)測序的底物。變型3.6.1：(參見例如圖62)。在這個變型中，將含5-甲基C的短接頭連接至DNA末端上。然后用亞硫酸氫鹽處理DNA，這使得這些鏈不互補，所以它們變成單鏈。幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在HphI位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用HphI裂解這些產(chǎn)物。只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰“HphI”位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生現(xiàn)在兩端可連接的片段。為捕獲所需區(qū)域，包含與靶標(biāo)的5’側(cè)序列互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶標(biāo)的3’側(cè)序列互補的3’探針區(qū)域的寡核苷酸與靶標(biāo)雜交。添加缺乏鏈置換活性及3’-＞5’和5’-＞3’核酸酶活性的連接酶和聚合酶能夠延伸未甲基化靶標(biāo)的3’端，然后連接至所述靶標(biāo)的5’端，以形成含獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點的環(huán)狀產(chǎn)物。未連接的產(chǎn)物通過核酸外切酶消化來消除。這個環(huán)狀產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。變型3.6.1：(參見例如圖62)。這種方法示出如何發(fā)現(xiàn)整個基因組的相鄰“HphI”位點(GGCGA或GGTGA)處的未甲基化。起始材料可為平均長度為約160bp的完整基因組DNA或cfDNA。將非連接端處含有阻斷的5’端的短接頭連接至DNA末端上。亞硫酸氫鹽處理DNA，將常規(guī)C但非甲基-C轉(zhuǎn)化為U。使用未甲基化的dNTP和5’阻斷的引物進行幾輪PCR擴增產(chǎn)生現(xiàn)在在剩余的HphI位點處未甲基化的產(chǎn)物。然后用HphI裂解這些產(chǎn)物。當(dāng)用HphI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HphI位點(GGCGA和GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。將含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列的接頭連接至這些新產(chǎn)生的HphI裂解端上。這些新接頭含有在其非連接側(cè)處的阻斷的3’端或含硫代磷酸根的主鏈(在圖62中示為****)。添加雙鏈3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)后，一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有具有連接至兩側(cè)的新接頭的片段仍將為雙鏈，因為3’阻斷基團或硫代磷酸根抑制3’核酸外切酶消化。使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接的，方式為(i)使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用5’-核酸酶，或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化，例如通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。連接產(chǎn)物由最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相同方向的相鄰AciI序列(即GCGG)組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。用于產(chǎn)生相鄰“HphI”限制位點處的未甲基化狀態(tài)的數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)方案：3.6.1.a.連接在非連接端的5’端被阻斷的接頭上。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶端，隨后用克列諾(外-)和dATP產(chǎn)生單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。cfDNA與亞硫酸氫鹽孵育，將常規(guī)C而不是甲基-C轉(zhuǎn)化為U。亞硫酸氫鹽處理使上鏈和下鏈發(fā)生不同轉(zhuǎn)化，使得在處理后，所述鏈將不再彼此互補，且解開鏈。3.6.1.b.添加5’阻斷的引物、Taq聚合酶和dNTP，并進行幾個PCR循環(huán)，以產(chǎn)生在剩余HphI位點處現(xiàn)在未甲基化的產(chǎn)物。3.6.1.c.添加HphI以裂解含此類位點的產(chǎn)物。當(dāng)用HphI裂解時，只有含有在原始靶標(biāo)中未被甲基化的相鄰HphI位點(GGCGA或GGTGA)的PCR擴增子將產(chǎn)生兩端未阻斷的片段(即對于接頭來說是可連接的)。用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)靶末端。移除dNTP(經(jīng)由離心柱)，只回添dATP以產(chǎn)生單堿基3’A懸突。3.6.1.d.使用T4連接酶，使連接端具有單堿基3’T懸突的接頭(含有任選的獨特標(biāo)識符序列和任選的患者標(biāo)識符序列)附接至裂解并補平的靶序列的單堿基A懸突。接頭的5’非連接側(cè)含有5’懸突，且任選地未被磷酸化。接頭的3’非連接側(cè)含有3’阻斷基團和/或硫代磷酸根以抑制3’核酸外切酶消化。3.6.1.e.添加3’核酸外切酶(即核酸外切酶III)并在37℃下消化。一側(cè)或兩側(cè)含原始短接頭的片段將被消化并變成單鏈。只有新接頭連接至兩側(cè)的片段仍將為雙鏈。核酸外切酶也將使接頭成為單鏈。任選地，用離心柱移除所需片段的消化產(chǎn)物。3.6.1.f.使含有剩余接頭的片段的游離端變成可連接，方式為(i)使用T4激酶使5’端磷酸化，(ii)移除阻斷的3’基團，或(iii)利用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，留下可連接的5’-磷酸根或其任何組合。連接條件經(jīng)設(shè)計以利于多聚化。連接產(chǎn)物由具有最初在靶DNA中被甲基化且具有任選的獨特標(biāo)識符和/或患者標(biāo)識符序列的相鄰AciI序列的靶片段的多聚體組成。這個產(chǎn)物適用于任選的附加步驟和后續(xù)測序。注釋：1：阻斷的接頭的3’端可經(jīng)合成以在阻斷內(nèi)部位置處含有尿嘧啶或脫嘌呤(AP)位點，并在用UDG和AP核酸內(nèi)切酶處理后釋放可連接的3’端。注釋2：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：連接將有利于形成多聚體，方式是通過使用擁擠試劑(即20％PEG)和/或通過混合兩組連接產(chǎn)物，其中第一組的非回文5’接頭懸突與第二組的非回文5’接頭懸突互補。預(yù)測性實施例4-精確量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA中的腫瘤特異性拷貝變化。腫瘤DNA的拷貝變化可以是強結(jié)果預(yù)測因子。在過去幾年中，大多數(shù)拷貝數(shù)工作是在SNP芯片上執(zhí)行的，其中生物信息學(xué)方法求取某一區(qū)域上的信號平均值，以測定相對拷貝數(shù)。對于低細(xì)胞數(shù)量，使用數(shù)字PCR方法獲得起始分子的精確計數(shù)。方法綜述：一般來講，拷貝變化出現(xiàn)在DNA的大型區(qū)域，諸如染色體臂。因為存在極少數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，可通過同時詢問給定染色體臂的多個區(qū)域，并加和所得信號或求取其平均數(shù)來提高精確度。同樣，在一些腫瘤中擴增特定基因(即Her2-neu，IGF2)，這樣可預(yù)測結(jié)果或指導(dǎo)療法。除拷貝變化以外，喪失雜合性后不僅可對染色體計數(shù)，還可以尋找傳統(tǒng)上在多態(tài)SNP內(nèi)喪失雜合性或在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記物。最異源性標(biāo)記物在重復(fù)序列中。本文中示出利用四核苷酸重復(fù)序列的概念，盡管也可以考慮三-和二-核苷酸重復(fù)序列。下一章節(jié)中將提出用于量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA的腫瘤特異性拷貝變化的詳細(xì)方案，所述方案給來自循環(huán)腫瘤細(xì)胞的突變評分，因為總體方法極其類似。預(yù)測性實施例5-檢測從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的突變循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供濃縮含突變的DNA的優(yōu)勢，所以不再需要尋找過量野生型序列中的低水平突變。然而，因為有少量起始DNA分子，重要的是精確地擴增所有區(qū)域，并核實真實地存在的突變。方法綜述：本文的方法類似于如上文所述的尋找已知的常見點突變，或測定數(shù)個外顯子序列的方法。然而，當(dāng)處理少量輸入DNA時，可能存在聚合酶錯誤。這個問題通過使用環(huán)形測序或SMRT測序解決。因為DNA是從幾個捕獲的腫瘤細(xì)胞獲得，如果存在突變，那么其應(yīng)該存在于一些(如果不是大多數(shù))捕獲的細(xì)胞中。下文描述了用于檢測從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA中的突變的詳細(xì)方案，包括量化拷貝數(shù)，因為所述方法極為類似。變型5.1：(參見例如圖63)。本文的總體理念是將所有cfDNA或CTCDNA轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)，其中每個片段含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合序列。一旦發(fā)生所述轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在環(huán)適用于進行原始測序，利用生物素化探針進行序列特異性捕獲所需靶標(biāo)，或適用于滾環(huán)擴增，并利用生物素化探針提高所需靶標(biāo)的捕獲。在這個變型中，目標(biāo)是捕獲所有靶和非靶DNA序列，但不使用探針結(jié)合至靶標(biāo)。將接頭連接至DNA靶標(biāo)(平均長度為約160個堿基的cfDNA)。為捕獲所有序列，包含與接頭的5’端互補的5’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與接頭的3’端互補的序列的寡核苷酸探針與靶標(biāo)雜交。寡核苷酸可在一端(示出的5’端)含有任選的阻斷基團。添加聚合酶允許寡核苷酸的3’端在靶標(biāo)上延伸，以及允許3’端接頭延伸通過獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列，直到它與所述靶標(biāo)上的5’接頭毗鄰。接頭的5’端可以設(shè)計得稍微更長，以使得一旦聚合酶延伸3’接頭，其不正好延伸通過5’接頭互補序列，直到其命中與5’探針區(qū)域雜交的5’靶部分。這個變型要求寡核苷酸探針含有與3’和5’接頭鏈互補的序列，那些序列只被約20-40個堿基分開。因為所述序列與接頭鏈互補，進而互相互補，重要的是阻止寡核苷酸探針內(nèi)的兩條序列正好形成具有20-40個堿基環(huán)的內(nèi)部發(fā)夾。一種解決方案是連接含有內(nèi)部泡的接頭，使得兩個接頭在接頭連接所用的低溫(16℃或甚至4℃，用T4連接酶)下保持雙鏈性質(zhì)。此外，5’接頭可經(jīng)設(shè)計以長于3’接頭。最終，接頭內(nèi)互補性的區(qū)域可經(jīng)設(shè)計以具有微弱錯配(即G：T和T：G)，其在互補寡核苷酸探針中較不穩(wěn)定(即C：A和A：C)，使得寡核苷酸探針不太可能在總體雜交溫度(即40-50℃)下形成內(nèi)部發(fā)夾。靶標(biāo)上寡核苷酸的3’端的延伸改善探針與靶標(biāo)的締合，且因此增加接頭的3’端正確地與其互補序列雜交及通過聚合酶延伸的能力。聚合酶(或Fen核酸酶)的5’-＞3’核酸酶裂解活性裂解5’接頭的匹配5’-重疊堿基，從而在接頭上留下可連接的5’-磷酸根。聚合酶還延伸靶標(biāo)上的寡核苷酸，且不裂解寡核苷酸的5’端上的阻斷基團。連接酶將延伸的3’端共價地密封至可連接的5’-磷酸根，以產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。阻斷基團阻止寡核苷酸探針環(huán)化。任選地添加尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶(Fpg，也稱為8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶，其充當(dāng)N-糖基化酶和AP-裂解酶)可以用于使含受損堿基的靶標(biāo)缺口。隨后添加核酸外切酶以消化所有未連接的或有缺口的產(chǎn)物，從而只留下由原始靶DNA和獨特標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性地捕獲所需靶標(biāo)，其與滾環(huán)擴增和環(huán)形測序或直接SMRT測序結(jié)合。這里的挑戰(zhàn)是避免聚合酶在沒有連接步驟(即缺口平移)的情況下以破壞5’接頭的方式延伸3’接頭。這可以通過在距離5’磷酸根端的第二位和第三位并入硫代磷酸根鍵實現(xiàn)(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。替代方法是使用在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點的5’接頭。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。當(dāng)使用熱穩(wěn)定性EndoIII時，所用的PCR聚合酶將缺乏5’-＞3’核酸外切酶活性。如上所述，缺口平移問題也可以如下最小化：通過使用具有和不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的聚合酶混合物(例如比例為1∶20)在分配延伸條件下，在連接酶存在下，使得大多數(shù)延伸借助不具有核酸酶活性的聚合酶，直到需要具有核酸酶活性的聚合酶來產(chǎn)生可連接結(jié)，隨后聚合酶解離和連接事件，以產(chǎn)生所需環(huán)狀連接產(chǎn)物。精確地量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的腫瘤特異性拷貝變化或檢測其突變的詳細(xì)方案：5.1.a.以cfDNA或從CTC分離的基因組DNA(剪切至約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，隨后利用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。任選地，從未連接的接頭純化靶DNA。5.1.b.使兩端含接頭的靶DNA在寡核苷酸探針(包含與接頭的5’端互補的5’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與接頭的3’端互補的序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)30分鐘)使寡核苷酸探針與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸探針可在5’端含有任選的阻斷基團。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。5.1.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性捕獲所需靶標(biāo)或適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后利用生物素化探針改善捕獲所需靶標(biāo)。此后可利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用接頭序列或任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化。注釋2：可使用Fen核酸酶替代具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶，以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：5’端接頭可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二位和第三位包含硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋5：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根?？商娲?，可在連接至靶DNA之前或在連接步驟之后利用T4激酶添加5’磷酸根。注釋6：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋7：捕獲靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)拷貝(通過滾環(huán)擴增生成)提供多價結(jié)合以改善正確靶標(biāo)的捕獲的獨特有點。這使得雜交/捕獲條件更嚴(yán)格，導(dǎo)致更高捕獲效率和更少捕獲非所需序列。這種方法也可以用于捕獲所有含重復(fù)序列(即AGAT四核苷酸重復(fù))的靶標(biāo)，允許給雜合性遺失、拷貝數(shù)變化、單體型分析、建立親權(quán)(paternity)和其它應(yīng)用評分。注釋8：獨特序列標(biāo)識符即使在滾環(huán)或其它選擇/擴增步驟后，可以唯一地對每條原始靶序列進行評分，從而允許精確地量化每個靶標(biāo)的原始拷貝數(shù)。注釋9：可在接頭兩側(cè)添加獨特標(biāo)識符序列。如果未向靶DNA添加額外堿基(即跳過克列諾步驟)，那么使用平端連接。為避免接頭-至-接頭連接，接頭的平端未磷酸化。提供含有獨特標(biāo)識符和平端的接頭的實例作為寡核苷酸iSx-201-MdAdT(上鏈)和iSx-202-MdLgAdB-bk(下鏈)(參見表1)。上鏈更長，從而在非連接側(cè)上產(chǎn)生5’單鏈懸突。下鏈具有5’-OH，且任選地含有避免延伸的3’阻斷基團，以及與上鏈的獨特標(biāo)識符序列配對時充當(dāng)通用堿基的內(nèi)部5-硝基吲哚基團。在連接平端接頭后，將獨特序列附接至雙鏈DNA靶標(biāo)的5’端，通過用聚合酶延伸3’端拷貝那些序列。任選地，上鏈含有后續(xù)用UDG和FPG裂解以釋放5’磷酸根的dU堿基，適用于在后續(xù)步驟中連接和環(huán)化。接頭iSx-201-MdAdT(參見表1)可含有毗鄰新釋放的5’磷酸根的任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移和促進靶標(biāo)與接頭末端環(huán)化。注釋10：當(dāng)設(shè)計與更長接頭序列一起使用的寡核苷酸(包含與商用儀器一起使用的“條碼”和“索引”序列)時，可以必要地使用PCR、鏈置換擴增或其組合來組裝寡核苷酸。在PCR期間，使用dUTP替代TTP摻入尿嘧啶，適用于后續(xù)通過UDG裂解。反義鏈引物可經(jīng)磷酸化，從而允許其利用λ核酸外切酶或類似的5’-＞3’核酸外切酶消化。dA30序列可以附接到正向引物的5’端，實現(xiàn)鏈置換擴增。用于組裝適用于與以上接頭一起使用的反向互補序列的寡核苷酸的實例為：iSx-204-bkA30-Lk-F2、iSx-205-r503-F3、iSx-206-d701-R4和iSx-207-Lk-R5(參見表1)。注釋11：在附接的另一變型中，可在接頭的兩側(cè)添加獨特標(biāo)識符序列，一條鏈還包含與商業(yè)儀器一起使用的“條碼”或“索引”序列(參見例如，圖64)。通過分割接頭與雜交寡核苷酸之間的長區(qū)域，可直接合成不同序列，并將長度保持在約100個堿基。提供含有索引或條碼序列、獨特標(biāo)識符和平端的接頭的實例作為寡核苷酸iSx-211-r702-LgAdT(上鏈)和iSx-202-MdLgAdB-bk(下鏈，與上面相同)(參見表1)。上鏈明顯更長，從而在非連接側(cè)上產(chǎn)生5’單鏈懸突。下鏈具有5’-OH，且任選地含有避免延伸的3’阻斷基團，以及與上鏈的獨特標(biāo)識符序列配對時充當(dāng)通用堿基的內(nèi)部5-硝基吲哚基團。在連接平端接頭后，將獨特序列附接至雙鏈DNA靶標(biāo)的5’端，通過用聚合酶延伸3’端拷貝那些序列。任選地，上鏈含有后續(xù)用UDG和FPG裂解以釋放5’磷酸根的dU堿基，適用于在后續(xù)步驟中連接和環(huán)化。橋接寡核苷酸iSx-212-r503-R4(參見表1)與含裂解的5’磷酸根的接頭以及延伸的長3’端雜交，從而允許用聚合酶延伸，并用連接酶環(huán)化。注釋12：以利用以上引物和接頭設(shè)計產(chǎn)生的上述產(chǎn)物，在簇或珠粒擴增或在商業(yè)儀器上捕獲在流動池的孔、地址或表面后，可使用以下引物起始測序反應(yīng)：(i)iLx-003-PEsqP1，成對末端測序引物1；(ii)iLx-004-BrCdR1，索引引物，條碼讀段1；(iii)iLx-001-P5-BrCdR2，條碼讀段2；和(iv)iLx-005-PEsqP2，成對末端測序引物2(下表1中提供的引物序列)。以上程序使用具有5’OH的接頭。變型5.2使用具有5’磷酸根的接頭來避免一些與使用具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶相關(guān)的潛在問題(參見例如圖63)。精確地量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的腫瘤特異性拷貝變化或檢測其突變的詳細(xì)方案：5.2.a.以cfDNA或從CTC分離的基因組DNA(剪切至約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，隨后利用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。5’接頭含有磷酸根基團(任選地利用T4激酶添加)。5.2.b.使兩端含接頭的靶DNA在寡核苷酸探針(包含與接頭的5’端互補的5’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與接頭的3’端互補的序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)30分鐘)使寡核苷酸探針與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸探針可在5’端含有任選的阻斷基團。在退火步驟之后或在程序開始時添加KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。5.2.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性捕獲所需靶標(biāo)或適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后利用生物素化探針改善所需靶標(biāo)的捕獲。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用接頭序列或任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團或5’OH，使得寡核苷酸探針不環(huán)化。注釋2：接頭可經(jīng)合成具有5’磷酸根，或可利用T4激酶附接磷酸根。注釋3：捕獲靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)拷貝(通過滾環(huán)擴增生成)提供多價結(jié)合以改善正確靶標(biāo)的捕獲的獨特有點。這使得雜交/捕獲條件更嚴(yán)格，導(dǎo)致更高捕獲效率和更少捕獲非所需序列。這種方法也可以用于捕獲所有含重復(fù)序列(即AGAT四核苷酸重復(fù))的靶標(biāo)，允許給雜合性遺失、拷貝數(shù)變化、單體型分析、建立親權(quán)和其它應(yīng)用評分。注釋4：獨特序列標(biāo)識符即使在滾環(huán)或其它選擇/擴增步驟后，可以唯一地對每條原始靶序列進行評分，從而允許精確地量化每個靶標(biāo)的原始拷貝數(shù)。注釋5：促進環(huán)化的接頭和互補寡核苷酸的實例分別為：iSx-220-d503-AdT1、iSx-221-pd707-AdB2和iSx-222-Lk-uRC1(參見表1)。接頭iSx-220-d503-AdT1(參見表1)可在距離5’端的第二位和第三位含有任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移，并促進靶標(biāo)與接頭末端環(huán)化。圖64和65中描述的方法使用通用接頭捕獲和環(huán)化總基因組DNA，然后隨后的步驟，諸如利用生物素化探針捕獲所需靶標(biāo)，以選擇靶標(biāo)進行序列分析。在雜交之前或雜交之后，將生物素化探針捕獲在珠粒上，所以即使在第二中情況下，雜交步驟可為液體，最終存在液體至固體的步驟，且這些步驟可導(dǎo)致更低產(chǎn)率或片段遺失。變型5.3描述替代性方法，其中捕獲步驟發(fā)生在液體中，方式是使用設(shè)計用于在靶標(biāo)上彼此接近或鄰近地雜交的探針，然后產(chǎn)生供靶標(biāo)末端上接頭雜交、延伸和連接以產(chǎn)生共價閉合的環(huán)狀靶標(biāo)的“著陸點(landingpad)”。在選擇含有重復(fù)DNA的靶標(biāo)時，這種方法尤其有用。精確地量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的腫瘤特異性拷貝變化或檢測其突變的詳細(xì)方案：5.3.a.以cfDNA或從CTC分離的基因組DNA(剪切至約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，隨后利用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。接頭可經(jīng)合成具有5’磷酸根，或可利用T4激酶附接磷酸根。任選地，從未連接的接頭純化靶DNA。5.3.b.使兩端含有接頭的靶DNA在寡核苷酸探針(包含與靶標(biāo)的獨特或重復(fù)部分(即AGAT重復(fù))互補的5’序列、任選的間隔基域、與接頭的5’端互補的序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的間隔基域、與接頭的3’端互補的序列和與靶標(biāo)的獨特或重復(fù)部分(即AGAT重復(fù))互補且與靶標(biāo)互補的5’序列毗鄰的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交(例如50℃持續(xù)2小時)。寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP。在接頭序列具有5’磷酸根的情況中，KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端(圖70的左側(cè))直接毗鄰。在接頭序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖70的右側(cè))。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。5.3.c.任選地，在可裂解連接處裂解寡核苷酸探針(例如，使用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解的U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性捕獲所需靶標(biāo)或適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后利用生物素化探針改善所需靶標(biāo)的捕獲。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用接頭序列或任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化?？商娲兀闪呀膺B接可被包括在原始寡核苷酸中。注釋2：可使用Fen核酸酶替代具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶，以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：5’端接頭可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二位和第三位包含硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋5：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根。可替代地，可在連接至靶DNA之前或在此連接步驟之后利用T4激酶添加5’磷酸根。注釋6：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋7：捕獲靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)拷貝(通過滾環(huán)擴增生成)提供多價結(jié)合以改善捕獲正確靶標(biāo)的獨特優(yōu)點。這使得雜交/捕獲條件更嚴(yán)格，導(dǎo)致更高的捕獲效率和更少的捕獲非所需序列。這種方法也可以用于捕獲所有含重復(fù)序列(即AGAT四核苷酸重復(fù))的靶標(biāo)，允許對雜合性遺失、拷貝數(shù)變化、單體型分析、建立親權(quán)和其它應(yīng)用評分。注釋8：獨特序列標(biāo)識符即使在滾環(huán)或其它選擇/擴增步驟后，可以唯一地對每條原始靶序列進行評分，從而允許精確地量化每個靶標(biāo)的原始拷貝數(shù)。注釋9：可利用單堿基T懸突連接在由“索引”或“條碼”序列組成的接頭兩側(cè)添加獨特標(biāo)識符序列(參見例如，圖67)。用T4聚合酶修復(fù)靶標(biāo)末端，用T4激酶使5’端磷酸化。利用缺乏3’-＞5’核酸酶活性的克列諾片段向靶標(biāo)的3’端添加A堿基。在30℃下用T4連接酶連接在具有3’T懸突的3-片“缺口”接頭上。使用缺乏3’-＞5’核酸酶活性的克列諾片段補平缺口，并在T4連接酶存在下連接至小接頭鏈。任選地，使用缺乏3’-＞5’核酸酶活性的DNA聚合酶補平缺口，并在T4連接酶存在下連接至小接頭鏈。此類3-片接頭寡核苷酸的實例為：iSx-223-d504-AdT3、iSx-224-pSmAdT4和iSx-225-pd708-N6AdB5(參見表1)。接頭iSx-223-d504-AdT3(參見表1)可在距離5’端的第二位和第三位處含有任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移并促進靶標(biāo)與接頭末端環(huán)化。注釋10：利用平端連接在由“索引”或“條碼”組成的序列的接頭兩側(cè)添加獨特標(biāo)識符序列。用T4聚合酶修復(fù)靶標(biāo)末端。在30℃下用T4連接酶連接在具有3’磷酸根和齊平懸突的3-片“缺口”接頭上。在37℃下使用缺乏3’-＞5’核酸酶活性的克列諾片段補平缺口，加熱至50℃，以使小接頭變性。使用TaqDNA聚合酶(缺乏3’-＞5’核酸酶活性，但具有5’-3’核酸酶活性)補平缺口，并用熱穩(wěn)定連接酶連接至靶標(biāo)。此類3-片接頭寡核苷酸的實例為：iSx-226-d505-AdT6、iSx-227-SmAdT7p和iSx-225-pd708-N6AdB5(與上面相同；參見表1)。接頭iSx-226-d505-AdT6(參見表1)可在距離5’端的第二位和第三位含有任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移，并促進靶標(biāo)與接頭末端環(huán)化。注釋11：利用逆轉(zhuǎn)錄在由“索引”或“條碼”序列組成的接頭兩側(cè)添加獨特標(biāo)識符序列。用T4聚合酶修復(fù)靶標(biāo)末端，用T4激酶使5’端磷酸化(參見例如，圖68)。利用逆轉(zhuǎn)錄酶向靶標(biāo)的3’端添加3個C堿基。使接頭對雜交，其中第一接頭具有在3’端上的rGrG+G(+G是LNA，rG3的符號)、引物結(jié)合位點以及任選的患者和獨特標(biāo)識符和5’磷酸根，而第二接頭具有引物結(jié)合位點以及患者標(biāo)識符。逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)歷鏈轉(zhuǎn)換并拷貝獨特標(biāo)識符來填補缺口。連接酶將延伸的靶標(biāo)共價密封至第二接頭。RNA酶H2裂解RNA堿基，從而釋放第一接頭序列中的rG3(rGrG+G)的3’OH。聚合酶填補缺口，且連接酶共價地密封延伸的末端。此類接頭寡核苷酸的實例為：iSx-228-d506-AdT83+G和iSx-229-pd709-AdB6。接頭iSx-228-d506-AdT83+G(參見表1)可在距離5’端的第二位和第三位含有任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移，并促進靶標(biāo)與接頭末端環(huán)化。注釋12：一個變型是使用包含多個可裂解鍵的寡核苷酸，使得在延伸/連接并用裂解劑處理后，在靶鏈上生成獨特引物，適用于滾環(huán)擴增產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物。下表1中示出此類適用于產(chǎn)生包含含熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物的寡核苷酸的實例，且包括：(i)KRAS正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-232-KRS-T32、iSx-233-KRS-B33)；(ii)BRAF正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-234-BRF-T34、iSx-235-BRF-B35)；(iii)TP53外顯子5正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-241-TP53e5-T41、iSx-242-TP53e5-B42、iSx-243-TP53e5-T43、iSx-244-TP53e5-B44)；(iv)TP53外顯子6正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-245-TP53e6-T45、iSx-246-TP53e6-B46)；(v)TP53外顯子7正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-247-TP53e7-T47、iSx-248-TP53e7-B48)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向靶標(biāo)延伸/連接寡核苷酸(iSx-249-TP53e8-T49、iSx-250-TP53e8-B50)。上述延伸/連接寡核苷酸可在距離5’端的第二位和第三位含有任選的硫代磷酸根基團，以防止缺口平移，并促進互補靶標(biāo)上的環(huán)化。注釋13：可替代地，在產(chǎn)生包含含熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物后，這些區(qū)域可利用新添加的靶標(biāo)特異性引物進行滾環(huán)擴增，以產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可在用靶標(biāo)特異性寡核苷酸在固體載體上捕獲所需靶之前或之后產(chǎn)生(參見下文注釋8)。引物可含有內(nèi)部可裂解核苷酸堿基或無堿基位點，諸如1’，2’-雙脫氧核糖(dSpacer)，使得可在滾環(huán)擴增期間摻入dUTP，以防止攜帶污染。下表1中示出此類引物的實例，且包括以下：(i)KRAS正向和反向引物(iSx-108-KRS-rcF26、iSx-109-KRS-rcR27)；(ii)BRAF正向和反向引物(iSx-118-BRF-rcF26、iSx-119-BRF-rcR27)；(iii)TP53外顯子5正向和反向引物(iSx-128-TP53e5-rcF66、iSx-129-TP53e5-rcR67；iSx-130-TP53e5-rcF68、iSx-131-TP53e5-rcR69)；(iv)TP53外顯子6正向和反向引物(iSx-138-TP53e6-rcF76、iSx-139-TP53e6-rcR77)；(v)TP53外顯子7正向和反向引物(iSx-148-TP53e7-rcF86、iSx-149-TP53e7-rcR87)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向引物(iSx-158-TP53e8-rcF96、iSx-159-TP53e8-rcR97)。注釋14：在產(chǎn)生包含含熱點突變的KRAS、BRAF和TP53外顯子5-8的靶區(qū)域的環(huán)狀產(chǎn)物，和/或產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)物后，這些產(chǎn)物可通過與更長寡核苷酸雜交被捕獲，所述更長寡核苷酸含有適用于后續(xù)在固體載體上捕獲的捕獲基團。下表1中示出了此類含有適用于經(jīng)由涂覆鏈霉親和素的固體表面捕獲的生物素基團的捕獲寡核苷酸的實例，且包括以下：(i)KRAS正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-013-KRS-bcF1、iSx-014-KRS-bcR2)；(ii)BRAF正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-020-BRF-bcF1、iSx-021-BRF-bcR2)；(iii)TP53外顯子5正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-030-TP53e5-bcF1、iSx-031-TP53e5-bcR2；iSx-032-TP53e5-bcF3、iSx-033-TP53e5-bcR4)；(iv)TP53外顯子6正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-050-TP53e6-bcF5、iSx-051-TP53e6-bcR6)；(v)TP53外顯子7正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-060-TP53e7-bcF7、iSx-061-TP53e7-bcR8)；和(vi)TP53外顯子8正向和反向捕獲寡核苷酸(iSx-070-TP53e8-bcF9、iSx-071-TP53e8-bcR10)。注釋15：以利用以上引物和接頭設(shè)計產(chǎn)生的上述產(chǎn)物，在簇或珠粒擴增或在商業(yè)儀器上捕獲在流動池的孔、地址或表面后，可使用以下引物起始測序反應(yīng)：(i)iLx-003-PEsqP1，成對末端測序引物1；(ii)iLx-004-BrCdR1，索引引物，條碼讀段1；(iii)iLx-001-P5-BrCdR2，條碼讀段2；和(iv)iLx-005-PEsqP2，成對末端測序引物2(下表1中提供了引物序列)。圖70中所述方法利用兩種寡核苷酸探針以及含接頭的靶標(biāo)的連接，產(chǎn)生環(huán)狀聯(lián)鎖連接產(chǎn)物。隨后，在可裂解連接處引入缺口。對于重復(fù)序列，3’端可只使用如下文在變型5.4中所述的3dNTP延伸，參見例如圖77。精確地量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的腫瘤特異性拷貝變化或檢測其突變的詳細(xì)方案：5.4.a.以cfDNA或從CTC分離的基因組DNA(剪切至約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，隨后利用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。接頭可經(jīng)合成具有5’磷酸根，或可利用T4激酶附接磷酸根。任選地，從未連接的接頭純化靶DNA。5.4.b.使兩端含接頭的靶DNA在寡核苷酸探針(包含與接頭的5’端互補的5’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的間隔基域、與接頭的3’端互補的序列和與靶標(biāo)的獨特或重復(fù)部分(即AGAT重復(fù))互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)使寡核苷酸探針與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸探針可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，以及對于AGAT重復(fù)的實例，只有三種互補核苷酸(即dTTP、dCTP、dATP)。在接頭序列具有5’磷酸根的情況中，KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端(圖77的左側(cè))直接毗鄰。在接頭序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖77的右側(cè))。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。5.4.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下所需的由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性捕獲所需靶標(biāo)或適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后利用生物素化探針改善所需靶標(biāo)的捕獲。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用接頭序列或任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化。注釋2：可使用Fen核酸酶替代具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶，以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：5’端接頭可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二位和第三位含有硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋5：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根。可替代地，可在連接至靶DNA之前或在此連接步驟之后利用T4激酶添加5’磷酸根。注釋6：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋7：捕獲靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)拷貝(通過滾環(huán)擴增生成)提供多價結(jié)合以改善正確靶標(biāo)的捕獲的獨特有點。這使得雜交/捕獲條件更嚴(yán)格，導(dǎo)致更高捕獲效率和更少捕獲非所需序列。這種方法也可以用于捕獲所有含重復(fù)序列(即AGAT四核苷酸重復(fù))的靶標(biāo)，允許為雜合性遺失、拷貝數(shù)變化、單體型分析、建立親權(quán)和其它應(yīng)用評分。注釋8：獨特序列標(biāo)識符即使在滾環(huán)或其它選擇/擴增步驟后，可以唯一地對每條原始靶序列進行評分，從而允許精確地量化每個靶標(biāo)的原始拷貝數(shù)。為避免聚合酶延伸和缺口平移問題，程序可不進行聚合酶延伸步驟，只利用連接酶或連接酶結(jié)合聚合酶的5’-3’核酸酶活性，如圖78中所示(v5.5)。訣竅是將獨特標(biāo)識符序列附接至接頭。精確地量化從循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離的DNA或cfDNA中的已知基因(例如Braf、K-ras、p53)中的腫瘤特異性拷貝變化或檢測其突變的詳細(xì)方案：5.5.a.以cfDNA或從CTC分離的基因組DNA(剪切至約150bp)開始，用T4聚合酶和T4激酶修復(fù)末端，隨后利用克列諾(外-)和dATP添加單堿基3’A懸突。接頭具有單堿基3’T懸突，使得在4℃下用T4連接酶的連接將接頭附接在片段兩端。接頭在接頭的5’單鏈側(cè)含有獨特標(biāo)識符序列，且可經(jīng)合成具有5’磷酸根，或者可利用T4激酶附接磷酸根。任選地，從未連接的接頭和/或dNTP純化靶DNA。5.5.b.使兩端含有接頭的靶DNA在寡核苷酸(包含與靶標(biāo)的獨特或重復(fù)部分(即AGAT重復(fù))互補的5’序列、任選的間隔基域、與接頭的5’端互補的序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列、任選的間隔基域、與接頭的3’端互補的序列及與靶標(biāo)的獨特或重復(fù)部分(即AGAT重復(fù))互補且與靶標(biāo)互補的5’序列直接毗鄰或有單堿基或側(cè)翼重疊的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并允許寡核苷酸通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團。任選地，在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)。在接頭序列具有5’磷酸根的情況中，3’接頭與可連接的5’端直接相鄰(圖78的左側(cè))。在接頭序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖78的右側(cè))。允許進行任選的側(cè)翼裂解，并在雜交溫度下連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。5.5.c.任選地，在可裂解連接處裂解寡核苷酸探針(例如，使用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解的U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于利用生物素化探針序列特異性捕獲所需靶標(biāo)或適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后利用生物素化探針改善所需靶標(biāo)的捕獲。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用接頭序列或任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1：寡核苷酸可在5’側(cè)含有任選的阻斷基團，以干擾聚合酶的后續(xù)5’-3’核酸酶活性，使得寡核苷酸探針不環(huán)化。可替代地，可裂解連接可被包括在原始寡核苷酸中。注釋2：可使用Fen核酸酶替代具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶，以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋3：捕獲靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)拷貝(通過滾環(huán)擴增生成)提供多價結(jié)合以改善正確靶標(biāo)的捕獲的獨特優(yōu)點。這使得雜交/捕獲條件更嚴(yán)格，導(dǎo)致更高捕獲效率和更少捕獲非所需序列。這種方法也可以用于捕獲所有含重復(fù)序列(即AGAT四核苷酸重復(fù))的靶標(biāo)，允許給雜合性遺失、拷貝數(shù)變化、單體型分析、建立親權(quán)和其它應(yīng)用評分。注釋4：獨特序列標(biāo)識符即使在滾環(huán)或其它選擇/擴增步驟后，可以唯一地對每條原始靶序列進行評分，從而允許精確地量化每個靶標(biāo)的原始拷貝數(shù)。預(yù)測性實施例6--精確地量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的腫瘤特異性mRNA或IncRNA。(例如十二種預(yù)測結(jié)果或指導(dǎo)處理的表達標(biāo)記物)。腫瘤特異性mRNA或lncRNA表達的變化是以組織特異性方式給疾病狀態(tài)分類的強有力工具。這包括精確檢測和量化mRNA或lncRNA的特定外顯子(參見例如，圖108、111、112)或檢測和量化mRNA中存在的復(fù)發(fā)性基因融合(參見例如，圖109和110)。從外來體或循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離總或聚-AmRNA或聚-AlncRNA，并利用用于這個過程的逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計規(guī)則獲得通常橫跨特異性轉(zhuǎn)錄物的外顯子-內(nèi)含子邊界的區(qū)域的最大特異性，通過使用外顯子特異性引物產(chǎn)生cDNA?？商娲兀梢允褂秒S機六聚體引發(fā)來拷貝整個轉(zhuǎn)錄組，或可以使用聚dT引物來富集所有轉(zhuǎn)錄物的3’端。含有與毗鄰但分離的區(qū)域互補的序列的寡核苷酸與cDNA靶標(biāo)雜交。圖108和112示出外顯子檢測和量化方法，所述方法在5’與3’寡核苷酸間使用缺口(即10-20個核苷酸)，其中使用聚合酶延伸靶結(jié)合序列的3’端以拷貝靶序列中的一些，并封閉所述缺口以產(chǎn)生適用于后續(xù)連接的可連接結(jié)，以形成環(huán)狀產(chǎn)物。在一個實施方案中，寡核苷酸探針的5＇與3＇端間的缺口為10-20個核苷酸。然而，可將待拷貝的缺口裁制為用于后續(xù)測序步驟中的讀取的長度。圖111示出外顯子檢測和量化方法，其中兩個靶結(jié)合序列相互毗鄰且不存在缺口。這些報道子環(huán)的枚舉可通過各種量化方法進行，所述量化方法包括但不限于下一代測序。除允許通過環(huán)形成同時多重檢測許多靶序列以外，下一代測序作為讀出提供關(guān)于報道子環(huán)的額外信息(兩個獨特標(biāo)識符)，所述信息輕易將真正連接產(chǎn)物與連接假象區(qū)分開來，從而增加測定的靈敏度。圖109和110描述用于檢測和量化mRNA中存在的復(fù)發(fā)性基因融合的兩種變化形式。因為兩個基因的融合結(jié)方式不嚴(yán)密，從一個基因的兩個5’端與另一個基因的3’端缺失序列的數(shù)百至數(shù)千堿基長度，所以難以設(shè)計含有未確定融合結(jié)的上游和下游的幾十個探針對的測定，所以本文所述方法利用兩個半圓式寡核苷酸探針，每個的一端在上游外顯子中且另一端在下游外顯子中。只有在其間毗鄰一個缺口的兩個探針(四個末端)或者在cDNA靶標(biāo)上彼此緊鄰的兩個探針(四個末端)雜交后，才可連接形成單個環(huán)狀產(chǎn)物。后續(xù)消化未連接的寡核苷酸探針(利用核酸外切酶)留下環(huán)狀產(chǎn)物，所述環(huán)狀產(chǎn)物在一個變型中(參見例如圖109)不含來自原始靶cDNA的額外序列信息(無缺口)。在另一個變型中(參見例如圖110)，聚合酶延伸每個靠近缺口的探針的3’端，直到聚合酶遇到附近探針的各自5’端。這兩個報道子環(huán)含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列以及它們中的一個、任選的引物結(jié)合位點。這些報道子環(huán)的枚舉可通過各種量化方法進行，所述量化方法包括但不限于下一代測序。除允許同時多重檢測許多融合轉(zhuǎn)錄物以外，下一代測序提供關(guān)于報道子環(huán)的額外信息(獨特標(biāo)識符的兩個拷貝)，所述信息輕易將真正連接產(chǎn)物與連接假象區(qū)分開來。兩個變化形式(圖109和110)中的每個還示出兩種產(chǎn)生可連接的5’端的方法。所述探針在雜交前具有5’-磷酸根(圖左側(cè))或使用Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，從而產(chǎn)生可連接的5’-磷酸根(圖右側(cè))。用于檢測和量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的mRNA或lncRNA中的外顯子的詳細(xì)方案。變型6.1，參見例如圖108：6.1.a從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的總或聚-AmRNA或聚-AlncRNA開始通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶和外顯子特異性引物產(chǎn)生cDNA。6.1.b.使靶cDNA在寡核苷酸(包含與朝向5’側(cè)的一部分cDNA互補的5’探針區(qū)域、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與朝向3’側(cè)的另一部分cDNA互補的3’探針區(qū)域)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)30分鐘)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。寡核苷酸可在5’端含有任選的磷酸根基團或匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼。任選地，在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)及任選的dNTP。在寡核苷酸在結(jié)點處具有直接毗鄰3’OH的5’磷酸根的情況中，兩個末端可利用連接酶直接連結(jié)(圖108的右側(cè))。在寡核苷酸具有5’磷酸根且5’與3’端之間具有缺口的情況下，用KlenTaq延伸3’OH。在寡核苷酸具有5’OH的情況下，Taq聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基或側(cè)翼，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖108的左側(cè))。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。6.1.c.添加外切核酸酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和外切核酸酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含一小段的原始靶DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀cDNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：可使用Fen核酸酶替代具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶，以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋2：寡核苷酸引物的5’端可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二位和第三位含有硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：3：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根?？商娲?，可在連接至靶DNA之前或在連接步驟之后利用T4激酶添加5’磷酸根。注釋5：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋6：如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋7：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可經(jīng)工程化以在50℃-60℃下從總輸入RNA(InvitrogenSuperscriptIII)合成cDNA?？商娲?，已使Tth或TmaDNA聚合酶工程化以提高其逆轉(zhuǎn)錄酶活性(可能需要添加Mn輔因子)。最終，嗜熱PyroPhage3173DNA聚合酶具有鏈置換活性和逆轉(zhuǎn)錄活性，且也可以使用。用于檢測和量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的mRNA中的基因融合的詳細(xì)方案；：變型6.2(參見例如圖109)：6.2.a.從外來體或CTC分離的mRNA首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA，以此方式橫跨任何可能融合轉(zhuǎn)錄物的結(jié)點。在優(yōu)選的方法中，使用外顯子特異性引物。6.2.b.使靶cDNA在兩個寡核苷酸(第一個包含與靶外顯子#1的獨特部分互補的5-’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶外顯子#2的獨特部分互補的3’-序列，且第二個包含與靶外顯子#2的獨特部分互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶外顯子#1的獨特部分互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)下使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。在退火步驟之后或在程序開始時添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)以及任選的Taq聚合酶和dNTP。在兩條寡核苷酸序列具有5’磷酸根的情況下，不需要聚合酶(圖109的左側(cè))。在兩條寡核苷酸序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖109的右側(cè))。允許在雜交溫度下側(cè)翼裂解和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成側(cè)翼裂解和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。6.2.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下所需的由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋2：如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋3：在使用兩個橋接寡核苷酸探針的系統(tǒng)中，每個探針含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點，建議所述寡核苷酸中只有一個而不是兩個含有引物結(jié)合位點(寡核苷酸上游或下游)。對于另一水平的假陽性檢測，建議探針上游和下游的獨特標(biāo)識符序列不同。注釋4：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可經(jīng)工程化以在50℃-60℃下從總輸入RNA(InvitrogenSuperscriptIII)合成cDNA?？商娲?，已使Tth或TmaDNA聚合酶工程化以提高其逆轉(zhuǎn)錄酶活性(可能需要添加Mn輔因子)。最終，嗜熱PyroPhage3173DNA聚合酶具有鏈置換活性和逆轉(zhuǎn)錄活性，且也可以使用。用于檢測和量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的mRNA中的基因融合的另一變型的詳細(xì)方案；變型6.3(參見例如圖110)：6.3.a.從外來體或CTC分離的mRNA首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA，以此方式橫跨任何可能融合轉(zhuǎn)錄物的結(jié)點。在優(yōu)選的方法中，使用外顯子特異性引物。6.3.b.使靶cDNA在兩個寡核苷酸(第一個包含與靶外顯子#1的獨特部分互補的5-’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶外顯子#2的獨特部分互補的3’-序列，且第二個包含與靶外顯子#2的獨特部分互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶外顯子#1的獨特部分互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)下使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)、熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)和dNTP。在兩條寡核苷酸序列具有5’磷酸根的情況中，KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端(圖110的左側(cè))直接毗鄰。在兩條寡核苷酸序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖110的右側(cè))。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。6.3.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋2：寡核苷酸引物的5’端可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二和第三位含有硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：3：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根?？商娲?，5’磷酸根可以使用T4激酶在連接到靶DNA之前或在連接步驟之后添加。注釋5：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋6：如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋7：在使用兩個橋接寡核苷酸探針的系統(tǒng)中，每個探針含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點，建議所述寡核苷酸中只有一個而不是兩個含有引物結(jié)合位點(寡核苷酸上游或下游)。對于另一水平的假陽性檢測，建議探針上游和下游的獨特標(biāo)識符序列不同。注釋8：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可經(jīng)工程化以在50℃-60℃下從總輸入RNA(InvitrogenSuperscriptIII)合成cDNA。可替代地，已使Tth或TmaDNA聚合酶工程化以提高其逆轉(zhuǎn)錄酶活性(可能需要添加Mn輔因子)。最終，嗜熱PyroPhage3173DNA聚合酶具有鏈置換活性和逆轉(zhuǎn)錄活性，且也可以使用。用于檢測和量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的mRNA中的含特定外顯子(可能彼此不毗鄰)的mRNA的詳細(xì)方案；變型6.4(參見例如圖111)6.4.a.從外來體或CTC分離的mRNA首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA，以此方式包括兩個外顯子區(qū)域。在優(yōu)選的方法中，使用外顯子特異性引物。6.4.b.使靶cDNA在兩個寡核苷酸(第一個包含與靶外顯子#1的獨特部分互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶外顯子#2的獨特部分互補的3’-序列，且第二個包含與靶外顯子#2的獨特部分互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶外顯子#1的獨特部分互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)下使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。在退火步驟之后或在程序開始時添加熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)以及任選的Taq聚合酶和dNTP。在兩條寡核苷酸序列具有5’磷酸根的情況下，不需要聚合酶(圖111的左側(cè))。在兩條寡核苷酸序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖111的右側(cè))。允許在雜交溫度下側(cè)翼裂解和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成側(cè)翼裂解和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。6.4.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋2：如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋3：在使用兩個橋接寡核苷酸探針的系統(tǒng)中，每個探針含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點，建議所述寡核苷酸中只有一個而不是兩個含有引物結(jié)合位點(寡核苷酸上游或下游)。對于另一水平的假陽性檢測，建議探針上游和下游的獨特標(biāo)識符序列不同。注釋4：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可經(jīng)工程化以在50℃-60℃下從總輸入RNA(InvitrogenSuperscriptIII)合成cDNA?？商娲兀咽筎th或TmaDNA聚合酶工程化以提高其逆轉(zhuǎn)錄酶活性(可能需要添加Mn輔因子)。最終，嗜熱PyroPhage3173DNA聚合酶具有鏈置換活性和逆轉(zhuǎn)錄活性，且也可以使用。用于檢測和量化從外來體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的總血細(xì)胞分離的mRNA中的含特定外顯子(可能彼此不毗鄰)的mRNA的詳細(xì)方案；變型6.5(參見例如圖112)：6.5.a.從外來體或CTC分離的mRNA首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA，以此方式包括兩個外顯子區(qū)域。在優(yōu)選的方法中，使用外顯子特異性引物。6.5.b.使靶cDNA在兩個寡核苷酸(第一個包含與靶外顯子#1的獨特部分互補的5-’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶外顯子#2的獨特部分互補的3’-序列，且第二個包含與靶外顯子#2的獨特部分互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶外顯子#1的獨特部分互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)下使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)、熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)和dNTP。在兩條寡核苷酸序列具有5’磷酸根的情況中，KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端(圖112的左側(cè))直接毗鄰。在兩條寡核苷酸序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖112的右側(cè))。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。6.5.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：可使用Fen核酸酶代替具有5’-3’核酸酶活性的聚合酶以在靶標(biāo)的5’側(cè)產(chǎn)生可連接的5’磷酸根。注釋2：寡核苷酸引物的5’端可經(jīng)合成以在距離5’磷酸根端的第二位和第三位含有硫代磷酸根鍵(硫代磷酸根鍵將由聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性釋放)。因為聚合酶延伸一個堿基太多次(這將使得無法連接至下游引物)，為使所述聚合酶最少置換那些堿基，連接結(jié)處的靶堿基將優(yōu)選地在3’側(cè)富含AT，且在5’側(cè)富含GC。注釋：3：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可經(jīng)合成以在毗鄰所需5’磷酸根的位置處含有脫嘌呤(AP)位點。使用熱穩(wěn)定EndoIII(例如TmaEndoIII)釋放該5’磷酸根。當(dāng)引物結(jié)合至靶標(biāo)時，這種酶裂解留下5’磷酸根的AP位點。核酸內(nèi)切酶也裂解單鏈引物，但效率更低，因此與模板雜交的引物將為優(yōu)選的底物。注釋4：當(dāng)使用KlenTaq聚合酶(不具有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)時，5’端接頭可以經(jīng)過合成以含有5’磷酸根?？商娲?，5’磷酸根可以使用T4激酶在連接到靶DNA之前或在連接步驟之后添加。注釋5：可以在分配延伸的條件(即，更高鹽濃度)下使用Taq聚合酶(具有5’-＞3’核酸酶活性)和KlenTaq(沒有5’-＞3’核酸酶裂解活性的Taq聚合酶)的1∶20混合物，以使靶DNA由于缺口平移產(chǎn)生的降解最小化。注釋6：如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即通用引物結(jié)合位點)，其將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。注釋7：在使用兩個橋接寡核苷酸探針的系統(tǒng)中，每個探針含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點，建議所述寡核苷酸中只有一個而不是兩個含有引物結(jié)合位點(寡核苷酸上游或下游)。對于另一水平的假陽性檢測，建議探針上游和下游的獨特標(biāo)識符序列不同。注釋8：MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可經(jīng)工程化以在50℃-60℃下從總輸入RNA(InvitrogenSuperscriptIII)合成cDNA?？商娲兀咽筎th或TmaDNA聚合酶工程化以提高其逆轉(zhuǎn)錄酶活性(可能需要添加Mn輔因子)。最終，嗜熱PyroPhage3173DNA聚合酶具有鏈置換活性和逆轉(zhuǎn)錄活性，且也可以使用。預(yù)測性實施例7--精確地量化從外來體或阿爾古蛋白分離的腫瘤特異性miRNA。(例如十二種預(yù)測結(jié)果或指導(dǎo)處理的microRNA標(biāo)記物)。已將MicroRNA(miRNA)鑒定為存在腫瘤、其分類和預(yù)兆的潛在組織特異性標(biāo)記物。miRNA作為與Ago2蛋白形成的復(fù)合物或通過封裝為外來體存在于血清和血漿中。圖114-117描述用于捕獲miRNA序列，供后續(xù)通過高精度測序枚舉的方法。在所有已知的方法中，方法涉及制備靶miRNA序列的cDNA拷貝，靶miRNA序列被轉(zhuǎn)化為合適的環(huán)狀DNA。用于捕獲、識別和量化存在于未經(jīng)任何選擇的血清、血漿或外來體的所有miRNA物質(zhì)的詳細(xì)方案：變型7.1(參見例如圖114)7.1.a.從外來體或CTC分離miRNA。利用具有5’-磷酸根的DNA接頭將通用接頭連接至miRNA的3’端，并利用RNA連接酶1阻斷3’端。7.1.b.用T4激酶使經(jīng)修飾的miRNA的5’端磷酸化。利用具有5’磷酸根和阻斷的3’端的DNA接頭將通用接頭連接至經(jīng)修飾的接頭的5’端。7.1.c.移除過量接頭后，使核酸在寡核苷酸(包含與接頭的5’-和3’端互補的序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)30分鐘)使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。添加缺乏5’-3’活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(即利用Mn2+輔因子的TthDNA聚合酶)、熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)和dNTP；在退火步驟之后或在程序開始時添加所述組分。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。7.1.d.添加UDG和AP核酸內(nèi)切酶使原始靶標(biāo)中的miRNA缺口，添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含原始靶miRNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即，通用引物結(jié)合位點)，那么環(huán)狀DNA將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。設(shè)計所述方法的后續(xù)變型(參見例如，圖115-117)，以捕獲從血清、血漿或外來體分離的總miRNA的特定miRNA序列。這些方法利用與靶miRNA序列的全部或一部分互補的捕獲探針，但隨后制備原始miRNA序列的cDNA拷貝，且因此能夠檢測miRNA或捕獲物中由于錯誤雜交而引起的單堿基變化。用于捕獲、識別和量化存在于未經(jīng)任何選擇的血清、血漿或外來體的特定miRNA物質(zhì)的詳細(xì)方案：變型7.2(參見例如圖115)7.2.a.從外來體或CTC分離miRNA。用T4激酶使分離的miRNA磷酸化。使寡核苷酸對雜交，其中第一寡核苷酸包含與miRNA靶標(biāo)互補、與獨特5’-和3’-接頭序列側(cè)接的序列，而第二寡核苷酸包含5’-磷酸化末端，接著為獨特3’-接頭的互補序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和獨特5’-接頭的互補序列，其最后的堿基為核糖核苷酸堿基。存在T4RNA連接酶2來共價密封miRNA的末端，從而產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。7.2.b.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接的寡核苷酸，只留下所需的單鏈環(huán)狀miRNA-DNA嵌合體。在80℃下加熱持續(xù)20分鐘使核酸外切酶失活。7.2.c.向環(huán)狀產(chǎn)物添加通用的5’-磷酸化引物，在37℃下雜交。添加缺乏5’-3’核酸外切酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(利用Mn2+輔因子的TthDNA聚合酶)、熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)和dNTP；在退火步驟之后或在程序開始時添加所述組分。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生現(xiàn)在含有原始靶miRNA的拷貝的環(huán)狀產(chǎn)物。7.2.d.添加UDG和AP核酸內(nèi)切酶使原始靶標(biāo)中的miRNA缺口，添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含原始靶miRNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列的所需的單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即，通用引物結(jié)合位點)，那么環(huán)狀DNA將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。所述方法的后續(xù)變型利用C6或C18間隔基，這允許拷貝靶miRNA，但防止完成環(huán)狀產(chǎn)物，且因此消除低水平的所需miRNA的假陽性檢測。在相對于5’端的第二位和第三位處含有硫代磷酸根的通用引物的缺口平移無法跨越靶miRNA結(jié)合互補序列中間的C6或C18間隔基，從而能夠破壞任何未連接的miRNA探針。用于捕獲、識別和量化存在于未經(jīng)任何選擇的血清、血漿或外來體的特定miRNA物質(zhì)的詳細(xì)方案：變型7.3(參見例如圖116)：7.3.a.從外來體或CTC分離miRNA。用T4激酶使分離的miRNA磷酸化。使寡核苷酸對雜交，其中第一寡核苷酸包含與含有單個C6或C18間隔基的miRNA靶標(biāo)互補、與獨特5’-和3’-接頭序列側(cè)接的序列，而第二寡核苷酸包含5’-磷酸化末端，接著為獨特3’-接頭的互補序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和獨特5’-接頭的互補序列，其最后的堿基為核糖核苷酸堿基。雜交混合物中還存在在距離5’端第二位和第三位含有硫代磷酸根鍵的通用引物。提供T4RNA連接酶2來共價密封miRNA的末端，從而產(chǎn)生環(huán)狀連接產(chǎn)物。7.3.b.添加具有5’-3’核酸外切酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(利用Mn2+輔因子的TthDNA聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，在退火步驟之后或在程序開始時添加dNTP。允許在雜交溫度下延伸和連接，并任選地升高溫度(例如60℃)，以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生現(xiàn)在含有原始靶miRNA的拷貝的環(huán)狀產(chǎn)物。7.3.c.添加UDG和AP核酸內(nèi)切酶以使原始靶標(biāo)中的miRNA缺口，然后添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下包含原始靶miRNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列的所需單鏈環(huán)狀DNA。這個產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(利用與引物結(jié)合序列互補的引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)。此后利用下一代測序或者可替代地直接SMRT測序在共價閉合模板上利用任選的引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點鑒定靶標(biāo)。注釋1.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即，通用引物結(jié)合位點)，那么環(huán)狀DNA將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。另一變型(圖117)利用與靶miRNA的一部分互補的莖-環(huán)捕獲探針。詳細(xì)方案如下文所述：用于捕獲、識別和量化存在于未經(jīng)任何選擇的血清、血漿或外來體的特定miRNA物質(zhì)的詳細(xì)方案：變型7.4(參見例如圖117)：7.4.a.從外來體或CTC分離miRNA。使由形成莖-環(huán)的5’端、與靶miRNA的一部分互補的突出3’-區(qū)域組成的莖-環(huán)探針雜交。環(huán)部分含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的可裂解連接。用逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP延伸莖-環(huán)探針的3’端。7.4.b.使核酸在寡核苷酸(包含與5’-莖-環(huán)序列互補的序列和延伸cDNA的3’端)存在下變性(94℃1分鐘)。此外，阻斷5’端，以防止缺口平移。)并通過冷卻至所需溫度(例如40-50℃持續(xù)30分鐘)使寡核苷酸與其在所需片段上的互補區(qū)域雜交。7.4.c.添加klenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)，在退火步驟之后或在程序開始時添加dNTP。KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端直接毗鄰。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。7.4.d.在可裂解連接處裂解寡核苷酸探針(例如，使用UDG和AP核酸內(nèi)切酶裂解的U)。添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接的產(chǎn)物和過量探針，只留下包含一小段的原始靶DNA的拷貝、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀cDNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1.如果寡核苷酸還包含任選的引物結(jié)合位點(即，通用引物結(jié)合位點)，那么環(huán)狀DNA將適用于PCR擴增，隨后利用下一代測序、TaqMan測定、UniTaq測定、實時PCR測定、數(shù)字PCR、微陣列、雜交或其它檢測方法識別靶標(biāo)。預(yù)測性實施例8--孕婦血漿樣品的產(chǎn)前診斷的臨床需要。在產(chǎn)前護理領(lǐng)域中，迫切需要開發(fā)用于常見非整倍性(諸如三體性21、18或13)、小片段缺失(諸如由杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)基因的缺失引起的那些)、其它小拷貝數(shù)異常(諸如與自閉癥有關(guān)的那些)、確定潛在臨床表現(xiàn)的平衡易位、可導(dǎo)致與印記相關(guān)的疾病如安格爾曼綜合征(Angelman’ssyndrome)或普拉德-威利綜合征(Prader-Willisyndrome)的甲基化變化、負(fù)責(zé)諸如亨延頓氏病(Huntington’sdisease)的疾病的三聯(lián)體重復(fù)變化、點突變(諸如在負(fù)責(zé)囊性纖維化的CFTR基因中的那些)的非侵入式測定。綜述：最近的工作已證明，血漿中胎兒DNA占母體DNA的百分比在第一個、第二個和第三個三月期中分別為約6％、20％和26％。由于DNA的降解方式，母體DNA通常為約160個堿基，且仍與H1組蛋白相關(guān)，而胎兒DNA為約140個堿基，且與組蛋白不締合。根據(jù)臨床需求，且在知道將提供最佳護理時，可開發(fā)出具有足夠靈敏度來檢測合適三月期中的胎兒DNA的測試。存在約3,500種隱性遺傳病癥，其中基因是已知。最常見病癥是由DNA拷貝異常引起的，諸如在三體性21中的額外染色體或是諸如杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)基因的基因的一部分的缺失。在考慮產(chǎn)前篩查時，需要平衡遺傳病癥的可能性對比手術(shù)風(fēng)險。當(dāng)前，護理標(biāo)準(zhǔn)推薦35歲待產(chǎn)婦女在第17周期間進行羊膜穿刺術(shù)，因為1/200的三體性21或其它染色體非整倍性現(xiàn)在與手術(shù)后的自然流產(chǎn)匹配。在考慮使用本文所述核酸測序方法進行產(chǎn)前篩查時，推薦兩個水平的測試。為低成本篩查所有孕期的三體性21、13和18，本發(fā)明的測序方法可用于快速識別染色體21、13和18上的差異化表達的基因，例如識別那些在胎兒中因為甲基化沉默而關(guān)閉的但成人中是開啟的基因。在三個對照染色體，即2、5、7上識別類似的區(qū)域。即使在從第一個三月期的母親血清分離DNA時，也可以通過比較對照染色體區(qū)域中的甲基化DNA與未甲基化DNA快速計算起源于胎兒的DNA的百分比-在本文的實施例中，將為6％。如果在任何其它染色體處存在三體性(即，三體性21)，那么來自此染色體的啟動子將示出約9％的甲基化，換句話說，稍微比正常二體性情況高50％。推薦對1,000個基因組當(dāng)量評分，使得三體性情況的計數(shù)為90個的甲基化拷貝容易與正常樣品的60個甲基化拷貝區(qū)分。作為此程序的第一步驟，為了識別那些在胎兒DNA中在最早發(fā)育階段被甲基化、但在母體DNA中從不被甲基化的啟動子區(qū)域(即WBC)。這需要通過比較從懷有二倍體胎兒、含有三體性的胎兒和未懷孕的女性分離的cfDNA的甲基化模式依據(jù)經(jīng)驗進行。為了關(guān)于使用用于NIPD的表觀遺傳標(biāo)記的一般綜述，參見Patsalis等人，“ANewNon-invasivePrenatalDiagnosisofDownsyndromethroughEpigeneticMarkersandReal-timeqPCR，”ExpertOpinBiolTher.12增刊1：S155-61(2012)，該文獻以引用的方式整體并入本文中。作為實例，檢測單個標(biāo)記物PDE9A處的甲基化狀態(tài)，參見Lim等人，“Non-invasiveEpigeneticDetectionofFetalTrisomy21inFirstTrimesterMaternalPlasma，”PLoSOne6(11)：e27709(2011)，該文獻以引用的方式整體并入本文中。本文所述方法將能夠快速得多地識別此類標(biāo)記物。為識別整個基因組的毗鄰HinP1I位點處的甲基化，將使用圖28中概述的方法?？商娲?，當(dāng)聚焦選定染色體上的已知基因時，可針對特定靶區(qū)域設(shè)計探針，并如圖27中對甲基化評分。這種方法還將用在最后的產(chǎn)前篩查測試中。為獲得更充足甲基化位點，即整個基因組的HaeIII位點間的毗鄰AciI位點，將使用圖36中概述的方法。當(dāng)聚焦已知基因時，可針對特定靶區(qū)域設(shè)計探針，并如圖36、37、39和40中給甲基化評分。如果以上方法未產(chǎn)生足夠標(biāo)記物，可利用圖33中所概述方法識別整個基因組的毗鄰AciI位點處的甲基化位點。對于這些位點，可使用圖29和31中概述的更多靶向方法?？商娲兀嬖谀承┰谔喊l(fā)育期間開啟，在成人組織或血液中關(guān)閉的基因。在這些條件下，重要的是通過比較從懷有二倍體胎兒、含有三體性的胎兒和未懷孕者的女性分離的cfDNA的未甲基化模式識別未甲基化啟動子區(qū)域。為識別甲基化模式的全基因組損失，可使用圖51、57或62中所述方法。為識別選定染色體上的未甲基化已知基因時，可針對特定靶區(qū)域設(shè)計探針，并如圖53、55、58、60中對未甲基化評分。這種方法還將用在最后的產(chǎn)前篩查測試中。另外，以上方法將能夠精確地量化基因組中其它位置處的甲基化變化，所述甲基化變化可導(dǎo)致與印記相關(guān)的疾病，諸如安格爾曼綜合征或普拉德-威利綜合征。本發(fā)明測定甲基化狀態(tài)和同時通過SNP或重復(fù)序列多態(tài)性檢測測定缺失是在父體染色體上還是在母體染色體上(即，檢測上游或下游順位(cis-located)母體或父體鑒定SNP或重復(fù)序列多態(tài)性)的能力將改善其診斷辨別印記疾病。最近已經(jīng)報道了對染色體片段計數(shù)以用于非侵入式產(chǎn)前診斷(被稱為DANSR)的基于連接酶的方法(Sparks等人，“SelectiveAnalysisofCell-freeDNAinMaternalBloodforEvaluationofFetalTrisomy，”PrenatDiagn.32(1)：3-9(2012)，該文獻以引用的方式整體并入本文中)。這種方法基于在染色體臂上的連接反應(yīng)中使用3個片段：含有上游通用序列的左側(cè)片段、中間片段和含有下游通用序列的右側(cè)片段。連接反應(yīng)后，從輸入引物分離產(chǎn)物，進行PCR擴增和測序。假連接(即上游直接連接至錯誤下游引物，沒有中間段)容易通過測序區(qū)分，且少于5％。本發(fā)明也可以通過從整個基因組的連接產(chǎn)物捕獲特異性靶標(biāo)(如圖63-69中所述)，或通過在初始連接事件期間使用靶標(biāo)特異性探針(如圖13-26或圖70-78中所述)使用這種方法靶標(biāo)特異性。因為以上方法取決于計數(shù)染色體區(qū)域，技術(shù)的精確度可通過利用此類區(qū)域中的多態(tài)性提高。圖70、77和78描述一組用于捕獲含有重復(fù)序列多態(tài)性的片段的技術(shù)。這些多態(tài)性將允許鑒定整個基因組或確定地方處的拷貝數(shù)差異，拷貝增加或拷貝減少-這也與癌癥基因組分析相關(guān)。三體性可起源于第一次減數(shù)分裂期間或第二次減數(shù)分裂期間的不分離。我們以精子發(fā)生為例。如果不分離出現(xiàn)在第一次減數(shù)分裂時，那么同源染色體在后期期間移向同一極。當(dāng)這些隨后分裂形成配子時，兩個將為二體(含有每份親本染色體的1份)，且兩個將為零體(null-somic)。如果這些配子使整倍體卵受精，所得受精卵將為2個三體(1+1+1)和兩個單體。另一方面，如果不分離出現(xiàn)在第二次減數(shù)分裂時，那么姐妹染色單體在后期期間移向同一極。當(dāng)這些隨后分裂形成配子時，一個將為二體(含有相同親本染色體的2份)和一個將為零體，且兩個將為整倍體(每個1份染色體)。如果這些配子使整倍體卵受精，所得受精卵將為1個三體(2+1)和一個單體，以及兩個整倍體(二體)。對于母體染色體同樣適用。因此，三體性胎兒可具有不同的父體和母體染色體的多個組合。可使用母體DNA的1,000個基因組當(dāng)量和胎兒DNA的100個基因組當(dāng)量的實例說明通過對存在拷貝對比存在多態(tài)性評分進行區(qū)分的差異。當(dāng)使用高度多態(tài)性標(biāo)記物，諸如具有四核苷酸重復(fù)，所述多態(tài)性中的3種或所有4種都不同是尋常的。結(jié)果將與這些情況作比較，其中母體或父體染色體的標(biāo)記物是相同或不同的。將染色體2用作對照，并將21用作三體性的實例情況1(只有拷貝數(shù))情況2(母體標(biāo)記純合的，母體不分離，第一次減數(shù)分裂)*注釋：因為等位基因2M1和2M2是相同的，所以總計＝2,100。同樣，因為等位基因21M1和21M2是相同的，所以總計＝2,200。父本等位基因可以是雜合或純合的情況3(母體標(biāo)記純合的，母體不分離，第二次減數(shù)分裂)*注釋：因為等位基因2M1和2M2是相同的，所以總計＝2,100。同樣，因為等位基因21M1和21M2是相同的，所以總計＝2,200。父本等位基因可以是雜合或純合的情況4(母體標(biāo)記雜合的，母體不分離，第一次減數(shù)分裂)情況5(母體標(biāo)記雜合的，母體不分離，第二次減數(shù)分裂)*注釋：存在另一個三體性組合，其中2個等位基因21M1拷貝在受精卵中。情況6(母體標(biāo)記純合的，父本不分離，第一次減數(shù)分裂)*注釋：因為等位基因2M1和2M2是相同的，所以總計＝2,100。同樣，因為等位基因21M1和21M2是相同的，所以總計＝2,100。父本等位基因可以是雜合或純合的情況7(母體標(biāo)記純合的，父本不分離，第二次減數(shù)分裂)*注釋：因為等位基因2M1和2M2是相同的，所以總計＝2,100。同樣，因為等位基因21M1和21M2是相同的，所以總計＝2,100。父本等位基因可以是雜合或純合的情況8(母體標(biāo)記雜合的，父本不分離，第一次減數(shù)分裂)情況9(母體標(biāo)記雜合的，父本不分離，第二次減數(shù)分裂)*注釋：存在另一個三體性組合，其中2個等位基因21P2拷貝在受精卵中。由這個分析可清楚區(qū)分三體性，最有用的標(biāo)記物是其中母本基因座為多態(tài)性且父本基因座不同于兩個母本等位基因的那些標(biāo)記物。父本基因座不必為多態(tài)性。對于諸如在杜氏肌營養(yǎng)不良中存在的X-連鎖缺失，方法較簡單，因為該疾病在男孩中最明顯。再次比較染色體2與缺失區(qū)域中的X染色體將產(chǎn)生：情況10(母本標(biāo)記物雜合的，遺傳X-連鎖缺失)*注釋：遺傳區(qū)域的缺失情況11(母本標(biāo)記物雜合的，胎兒不含X-連鎖缺失)*注釋：遺傳區(qū)域的缺失情況11(母本標(biāo)記物雜合的，散發(fā)性X-連鎖缺失)*注釋：遺傳區(qū)域的缺失情況10示出遺傳杜氏肌營養(yǎng)不良，其中母親是攜帶者。在這些條件下，兩個X-染色體等位基因的總量的量出現(xiàn)在一半其它的位置。在情況11中，胎兒未患有該疾病，且在情況12中，該疾病是出現(xiàn)在胎兒中的散發(fā)性突變。Y染色體標(biāo)記物確認(rèn)了男性中的胎兒。以上示出將如何在DMD基因座上進行基因型分型。如果先前知道母親是攜帶者，那么可測定具有相鄰多態(tài)性的缺失的相位調(diào)整(參見下文)，那么也可以使用這些相鄰的多態(tài)性驗證胎兒是否也攜帶缺失，且胎兒是否為男性，以及是否易患所述疾病。這種方法可用于尋找X-連鎖和常染色體顯性變化。為測定胎兒是否在含有關(guān)于大致3,500種其它病癥中的一種的遺傳性或散發(fā)性突變，包括缺失、點突變或異常甲基化，將推薦更復(fù)雜的分析。序列分析容易測定在雙親中存在隱性等位基因。如果突變在雙親中不同，那么可通過評價來自母體血清的無細(xì)胞DNA來測定兒童是否是疾病的復(fù)合雜合子。為獲得分析母體血清中胎兒DNA的完整答案，可能需要這個測定的兩部分。首先建立圍繞疾病基因的重復(fù)區(qū)域中的母本SNP或多態(tài)性的相位。這可以通過從母親的白血細(xì)胞或父親的唾液分離高分子量DNA完成。測定精確單體型或相位可通過使用由CompleteGenomics開發(fā)的方法的變型(參見Peters等人，“AccurateWhole-genomeSequencingandHaplotypingfrom10to20HumanCells，”Nature487(7406)：190-5(2012)，該文獻以引用的方式整體并入本文中)完成。對于本申請，將HMWDNA分配到96或384孔板中，使得每個孔具有不足一條染色體。隨后，使用全基因組擴增測定哪個孔含有染色體，然后測定所考慮的基因的母本疾病等位基因的96個相鄰SNP或重復(fù)序列多態(tài)性的相位。一旦完成，對來自父親的疾病等位基因的存在評分(如上文方法4中所述)，并利用測序驗證從母親遺傳的染色體也含有疾病等位基因。本文描述多種用于捕獲整個基因組的DNA的重復(fù)序列的方法，所述方法可用于鑒定來自原始或全基因組擴增的DNA的多態(tài)性。測定來自二倍體基因組的單體型的能力仍然是技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性和昂貴的任務(wù)，這基本上依賴在通過測序或一些其它技術(shù)進行基因型分型之前物理分離染色體或亞染色體片段。以下描述用于捕獲基因組DNA的相同鏈上的兩個區(qū)域，以允許測定由所述兩個區(qū)域限定的單體型結(jié)構(gòu)的快速且簡單的程序。對于每個潛在靶標(biāo)，兩個寡核苷酸同時雜交，每條寡核苷酸含有與與靶標(biāo)上的兩種多態(tài)性中的每種側(cè)接的上游和下游部分互補的序列。這些多態(tài)性可為四核苷酸、三核苷酸或二核苷酸重復(fù)或SNP。信息量最多的多態(tài)性是兩條母本染色體中是多態(tài)性，以及在轉(zhuǎn)移至胎兒的父親染色體中是多態(tài)性的多態(tài)性。使用聚合酶從兩個3’端中的每個延伸，以封閉缺口和測定位于兩對側(cè)接結(jié)合序列間的多態(tài)性的基因型。兩種靶標(biāo)多態(tài)性不一定彼此毗鄰，且可被其它多態(tài)性分隔開。兩種目標(biāo)多態(tài)性間的距離只受到通過兩個寡核苷酸中所含四條結(jié)合序列橋接的概率的限制。每個寡核苷酸含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和在5’端上的任選的磷酸根。用于測定兩種已知多態(tài)性間的單體型的詳細(xì)方案：變型8.1(參見例如圖113)：8.1.a.通過產(chǎn)生高(＞15kb)分子量材料的方法分離基因組DNA。8.1.b.使靶DNA在兩個寡核苷酸(第一個包含與靶多態(tài)性#1上游的獨特區(qū)域互補的5-’序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和與靶多態(tài)性#2下游的獨特區(qū)域互補的3’-序列，且第二個包含與靶多態(tài)性#2上游的獨特區(qū)域互補的5’-序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和與靶多態(tài)性#1下游的獨特區(qū)域互補的3’序列)存在下變性(94℃1分鐘)，并通過冷卻至所需溫度(例如50℃持續(xù)2小時)下使寡核苷酸與它們在所需片段上的互補區(qū)域雜交。在退火步驟之后或在程序開始時添加Taq聚合酶和/或KlenTaq(缺乏核酸酶活性的Taq聚合酶)和熱穩(wěn)定連接酶(優(yōu)選來自菌株AK16D)、dNTP。在兩條寡核苷酸序列具有5’磷酸根的情況中，KlenTaq延伸3’端，直到它與可連接的5’端(圖113的左側(cè))直接毗鄰。在兩條寡核苷酸序列具有5’OH的情況下，聚合酶的5’-＞3’核酸酶活性裂解匹配的5’-重疊堿基，以產(chǎn)生可連接的5’磷酸根(圖113的右側(cè))。允許在雜交溫度下進行延伸和連接，并且任選地升高溫度(例如60℃)以確保完成延伸和連接，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物。8.1.c.添加核酸外切酶I(以3’-＞5’方向消化單鏈DNA)和核酸外切酶III(以3’-＞5’方向消化雙鏈DNA)，以消化所有未連接或有缺口的產(chǎn)物，只留下由原始靶DNA、接頭序列、獨特標(biāo)識符序列、任選的引物結(jié)合序列和任選的患者標(biāo)識符序列組成的所需單鏈環(huán)狀DNA。這種產(chǎn)物適用于滾環(huán)擴增(使用隨機六聚體引物和phi-29聚合酶)，以產(chǎn)生所需序列的串聯(lián)重復(fù)，隨后在共價閉合模板上利用下一代測序或可替代地直接SMRT測序，使用引物結(jié)合序列作為引物結(jié)合位點識別靶標(biāo)。注釋1：這種方法還容易建立具有實際導(dǎo)致疾病的突變的單體型(即相位)。引物經(jīng)設(shè)計使得一個多態(tài)性位點是實際的疾病基因。注釋2：在使用兩個橋接寡核苷酸探針的系統(tǒng)中，每個探針含有獨特標(biāo)識符序列、任選的患者標(biāo)識符序列和任選的引物結(jié)合位點，建議所述寡核苷酸中只有一個而不是兩個含有引物結(jié)合位點(寡核苷酸上游或下游)。對于另一水平的假陽性檢測，建議探針上游和下游的獨特標(biāo)識符序列不同。注釋3：重要的是最大限度形成連接產(chǎn)物，其中兩條寡結(jié)合序列實際上由一連續(xù)段的DNA接合，并最小限度形成橋聯(lián)片段并不連續(xù)的連接產(chǎn)物。為了進行示意性的說明，考慮以下實施例。上游區(qū)域被命名為″X″且具有AGAT四核苷酸重復(fù)，而下游區(qū)域被命名為″Y″且具有CA二核苷酸重復(fù)。下文將上游區(qū)域X示為“X-上”，上游引物結(jié)合位點；AGAT(n)，四核苷酸重復(fù)區(qū)域和“X-dn”，下游引物結(jié)合位點。下文將下游區(qū)域Y示為“Y-上”，上游引物結(jié)合位點；CA(n)，二核苷酸重復(fù)區(qū)域和“Y-dn”，下游引物結(jié)合位點。在這個實施例中，兩個區(qū)域間隔10kb，且兩條母體染色體將具有以下形式：X-上AGAT(12)X-dn.........(10kb).......Y-上CA(23)Y-dnX-上AGAT(16)X-dn.........(10kb).......Y-上CA(18)Y-dn然后添加結(jié)合至下部鏈的連接-延伸引物(如圖113中所示)。它們將具有以下形式：(左側(cè))5′X-dn-引物位點-標(biāo)識符#1-Y-上3′(右側(cè))5′Y-dn-標(biāo)識符#2-X-上3′(在這個實施例中，引物結(jié)合位點只在左側(cè)引物中。)然后由單體型定義的2種可能的連接產(chǎn)物(在引物結(jié)合位點是線性化的，所以更容易追蹤)將具有以下形式：引物位點-標(biāo)識符#1-Y-上CA(23)Y-dn-標(biāo)識符#2-X-上AGAT(12)X-dn引物位點-標(biāo)識符#1-Y-上CA(18)Y-dn-標(biāo)識符#2-X-上AGAT(16)X-dn可通過稀釋反應(yīng)物在相同染色體片段上最大限度形成源自連續(xù)位點的正確產(chǎn)物，使得源自非連續(xù)位點的產(chǎn)物的概率變得無窮小。另外，因為引物大大超過染色體DNA，所以如果兩個片段不連續(xù)，則每個片段有極高概率已經(jīng)具有與之結(jié)合的“左”和“右”復(fù)合引物(即4個結(jié)合至兩個獨立片段的引物)。只有當(dāng)兩個片段是連續(xù)的時候，兩個區(qū)域才有更高概率通過“左”和“右”復(fù)合引物中的每一個結(jié)合在一起。這是簡單的實驗，通過產(chǎn)生不同靶濃度相對于連接延伸引物的不同稀釋液的條件矩陣來優(yōu)化正確連接產(chǎn)物的產(chǎn)率。如果有源自兩個在一起的不同染色體區(qū)域的不正確連接產(chǎn)物，那么將錯誤地產(chǎn)生CA(23)與AGAT(16)在一起，且CA(18)與AGAT(12)在一起的產(chǎn)物。作為一個實例，考慮最壞的情況，其中80％的連接產(chǎn)物源自不連續(xù)的橋接片段。為簡便起見，假定1,000基因組當(dāng)量。注意，如果產(chǎn)物源自橋接的片段，那么它們來自相同母體染色體與來自相反染色體(即各自400)的可能性相等。但那些源自連續(xù)DNA的產(chǎn)物將只會源自相同母體染色體(即各自200)。因此，應(yīng)該有以下組合：CA(23)和AGAT(12)600(＝400+200)CA(23)和AGAT(16)400CA(18)和AGAT(12)400CA(18)和AGAT(16)600(＝400+200)即使這些數(shù)字在最不利方向上波動50(相當(dāng)于90％連接產(chǎn)物源自橋接片段)，仍將在每條染色體處明確地將單體型區(qū)分為CA(23)和AGAT(12)；以及CA(18)和AGAT(16)。CA(23)和AGAT(12)550(＝400-50+200)CA(23)和AGAT(16)450(＝400+50)CA(18)和AGAT(12)450(＝400+50)CA(18)和AGAT(16)550(＝400-50+200)可替代地，在第二方法中，該疾病基因可分成20種最常見遺傳疾病，以及常染色體顯性疾病，然后分成17組各自涵蓋平均200個基因的更不常突變的基因。每組基因?qū)⒈粩?shù)組捕獲探針覆蓋，然后依據(jù)親本測序分析的結(jié)果，母體血液將被賦予適當(dāng)患者標(biāo)識符，并評價17個專業(yè)探針捕獲組中的一組或多組。以上方法中的第一種將識別遺傳性和散發(fā)性突變，以及測定胎兒是否從母親遺傳帶有突變的區(qū)域。這種方法還應(yīng)能夠測定存在x-連鎖遺傳疾病的缺失、其它染色體缺失、胎兒的異常甲基化、由三核苷酸重復(fù)引起的疾病和由染色體易位或其它重排引起的疾病。第二方法將確定被詢問基因的疾病條件。關(guān)鍵問題將是家族得到正確答案的重要性。明確確定雙親是否是攜帶者以及突變是否不同，相對明確地確定父親的疾病等位基因是否存在于胎兒中。如果其不存在，則胎兒將無疾病或是攜帶者。如果其存在，則遺傳母本等位基因并獲得疾病的可能性是50％。如果已經(jīng)確定母本等位基因的單體型，那么可使用單體型標(biāo)記物驗證存在或不存在遺傳母本等位基因。還可以謹(jǐn)慎地進行羊膜穿刺術(shù)，并直接測試母本等位基因的存在。當(dāng)前的建議是如上所述對基因測序并對父本疾病等位基因評分。如果存在或如果父本和母本的疾病特異性突變相同，那么醫(yī)師建議羊膜穿刺術(shù)。本發(fā)明方法也可以用于不平衡的染色體易位的非侵入式產(chǎn)前診斷和植入前遺傳診斷(PGD)。攜帶染色體易位的個體的不孕、流產(chǎn)、死產(chǎn)和/或懷有具有出生缺陷的小孩的風(fēng)險增加。植入前遺傳診斷能夠區(qū)分具有正確數(shù)量的遺傳物質(zhì)的胚胎(平衡/正常)和由于易位而缺乏遺傳物質(zhì)的胚胎(不平衡)。許多其中一個成員是易位攜帶者的夫婦經(jīng)歷流產(chǎn)或在得知懷有不平衡的染色體組時不得不面對困難決定?；赑GD的本發(fā)明方法將通過在已知轉(zhuǎn)移的胚胎具有平衡的染色體易位的概念之前減少不得不處理這些特定情況的可能性。也可以在植入前篩選中采用對染色體特異性SNP或重復(fù)序列多態(tài)性評分的方法。與懷孕相反，其中只有三體性21、18和13應(yīng)對(以及X和Y染色體異常)體外受精，其它染色體異常仍可允許在16、32或更高細(xì)胞數(shù)階段生長。因此，整個基因組的多態(tài)性將需要對染色體區(qū)域的適當(dāng)拷貝數(shù)和損失或增加計數(shù)。被詢問的多態(tài)性數(shù)量越高，可越精細(xì)地測定拷貝數(shù)變化。預(yù)測性實施例9--胎兒的親權(quán)測試(例如產(chǎn)前護理支持)綜述：基本方法是尋找存在于父親中但不存在于母親中的等位基因的存在。有兩種一般方法來實現(xiàn)這一點?？梢詮腟NP開始，其中常見的等位基因的頻率約為70-75％，以便母親的主要等位基因是純合型的機會為約50％。從約48個SNP開始，在約一半(24個)的SNP中，母親的常見等位基因?qū)⑹羌兒系?，并且?0％的機會父親的次要等位基因?qū)⑹请s合的或純合的。類似于尋找突變，對母本血液中的次要等位基因的存在進行簡單評分，但也將存在的量進行量化，目的只是確認(rèn)它是來自父親的次要等位基因。第二種方法是從頻率約50％的等位基因開始，然后母親的一個等位基因有50％的機會是純合的，然后父親在此位置處有75％的機會將具有另一個等位基因。區(qū)別父親的信息量少一點，但是更多的位置將提供信息。第三種方法是使用重復(fù)序列多態(tài)性，其中存在高度多態(tài)性，使得父親的等位基因在給定位置處與母親任一等位基因不同的可能性高。這將需要最少量的等位基因。在所有這些條件下，醫(yī)師必須小心尊重母親的隱私，以防丈夫并非胎兒父親(無親權(quán))。表1：本公開的寡核苷酸序列/3Phos/＝3′磷酸根/3SpC3/＝3′C3間隔基(阻斷的3’端)/5Phos/＝5’磷酸根/5SpC3/＝5′C3間隔基(阻斷的5’端)/52-Bio/＝5′雙重生物素/idSp/＝內(nèi)部1′，2′-二脫氧核糖(dSpacer)/i5NitInd/＝內(nèi)部5-硝基吲哚+G＝LNA(鎖核酸)胍N＝任何堿基rG＝核糖-胍U＝脫氧尿苷*＝硫代硫酸根主鏈盡管已經(jīng)在本文中詳細(xì)描繪和描述了優(yōu)選的實施方案，但是對相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，可以在不背離本發(fā)明的精神的情況下進行各種修改、添加、替換等并且因此將其視為在如隨附權(quán)利要求書中所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3