Usp33在腫瘤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用作腫瘤標(biāo)志物的USP33及其在制備治療肺 癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是最常見的癌癥，每年全球死亡約138萬人，同時(shí)其5年生存率約為15%。雖 然目前有眾多的治療手段，包括手術(shù)、放療、化療和靶向治療甚至他們之間組合治療，但其 效果都差強(qiáng)人意。肺癌可以分為小細(xì)胞肺癌SCLC和非小細(xì)胞肺癌NSCLC。非小細(xì)胞肺癌， 包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化大細(xì)胞癌、腺鱗癌和支氣管腺體癌；小細(xì)胞肺癌，由均勻一致 的小細(xì)胞構(gòu)成，典型的呈燕麥樣。NSCLC占到約80%的病例。當(dāng)前的肺癌的治療主要基于 腫瘤形態(tài)學(xué)和以腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM為基礎(chǔ)的分期系統(tǒng)。在肺癌中許多抑癌基因已經(jīng)被發(fā) 現(xiàn)，包括TP53,P16,LKB1/STK11，NF1，RASSF1，APC，BRG1，PTEN和RB。各種易感基因最近也 已被發(fā)現(xiàn)，然而，抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性機(jī)制仍然知之甚少。
[0003] 近期的報(bào)道顯示，神經(jīng)元導(dǎo)向分子被認(rèn)為與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程相關(guān)。Slit基 因最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，它的產(chǎn)物是一個(gè)分泌蛋白家族，充當(dāng)神經(jīng)導(dǎo)向分子的作用。最近的 研究表明slit基因參與不同類型的癌癥細(xì)胞的侵染和轉(zhuǎn)移。Slit蛋白通過與一個(gè)單次跨 膜蛋白R(shí)oundabout(Robo)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)其功能。調(diào)控Slit-Robo信號(hào)傳導(dǎo)作用的蛋白之一 是泛素特異性蛋白酶33 (USP33)。作為泛素特異性蛋白酶家族的一個(gè)成員之一，USP33最初 發(fā)現(xiàn)作為底物的蛋白結(jié)合到VHLE3連接酶。在Slit信號(hào)通路調(diào)控中線部位連合軸突導(dǎo)向 中，USP33被認(rèn)為是必需的。
[0004] 此外，slit信號(hào)在實(shí)現(xiàn)其抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的功能中，USP33也參與其中，這表 明USP33可能在癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，在肺癌中USP33如何調(diào)控slit信 號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制并不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供USP33在肺癌中的應(yīng)用，特別是USP33在制備 檢測(cè)和治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供的技術(shù)方案是：USP33在腫瘤中的應(yīng) 用，USP33作為腫瘤預(yù)后檢測(cè)標(biāo)志物和USP33在腫瘤藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
[0007] 優(yōu)選地，USP33作為腫瘤預(yù)后檢測(cè)標(biāo)志物，所述腫瘤包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和 急性髓細(xì)胞白血病。
[0008] 優(yōu)選地，USP33在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤為肺癌。
[0009] 優(yōu)選地，USP33作為腫瘤治療靶點(diǎn)。
[0010] 優(yōu)選地，USP33通過調(diào)控slit-Robo信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
[0011] 本發(fā)明第二方面提供一種診斷試劑盒，該試劑盒含有檢測(cè)USP33蛋白物質(zhì)，所述 USP33蛋白序列為SeqNo. 1。
[0012] 本發(fā)明第三方面提供一種試劑盒，該試劑盒含有檢測(cè)USP33基因的物質(zhì)，所述 USP33基因序列為SeqNo. 2。
[0013] 本發(fā)明第四方面提供一種診斷試劑盒的用途，用于檢測(cè)腫瘤及腫瘤預(yù)后USP33表 達(dá)。
[0014] 本發(fā)明第五方面提供一種腫瘤藥物組合物，該藥物組合物含有：USP33基因和/或 其編碼的蛋白，以及醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料。
[0015] 優(yōu)選地，所述腫瘤為肺癌。
[0016] 在這項(xiàng)研究中，發(fā)明人證明Slit蛋白抑制肺癌細(xì)胞的遷移過程需要USP33參與。 USP33調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞中Robo受體的水平。這與USP33在神經(jīng)元和非癌細(xì)胞的作用方式有著 明顯的差別（Yuasa-Kawadaetal.，2009a，b)。此外，USP33在肺癌細(xì)胞中扮演腫瘤抑制劑 的角色，因?yàn)閁SP33的低表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后較低的生存率呈現(xiàn)很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。
[0017] 在肺癌組織中USP33表達(dá)顯著下降。高USP33表達(dá)與預(yù)后較好有關(guān)。USP33可以 提高Robol穩(wěn)定性，并且是slit蛋白抑制腫瘤細(xì)胞遷移所必須的。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP33是 肺癌發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵參與者，有希望作為一個(gè)新的肺癌預(yù)后標(biāo)志物。
[0018] 本發(fā)明提供的USP33能夠調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞中Robo受體的水平，提高Robol蛋白穩(wěn)定 性，并且是slit蛋白抑制腫瘤細(xì)胞遷移所必須的。因此USP33可以作為治療腫瘤，特別是 肺癌藥物的重要組份，聯(lián)合其它抗癌藥物共同用藥。此外，USP33還可以作為肺癌預(yù)后檢測(cè) 標(biāo)志物，為腫瘤、特別是肺癌的檢測(cè)和治療提供新的方法和方案。
【附圖說明】
[0019] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0020] 圖1顯示了 25組肺癌和非肺癌組織樣本中mRNA的表達(dá)水平，Y軸為表達(dá)量，GAPDH 基因做參照，***P〈〇. 001。
[0021] 圖2免疫組化染色檢測(cè)肺癌和對(duì)照樣本中USP33表達(dá)情況。其中，a和c為在正 常組織中檢測(cè)到USP33表達(dá)的強(qiáng)陽性信號(hào)，b為腺癌中的USP33陽性表達(dá)示例，d為鱗狀細(xì) 胞癌USP33陽性表達(dá)示例。
[0022] 圖3肺癌樣本（N= 25)和對(duì)照正常組織樣本（CTRL)(N= 25)USP33蛋白表達(dá)情 況的定量分析。
[0023] 該USP33-免疫組化分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法如下：USP33免疫組化得分=(陽性腫瘤細(xì) 胞的百分比）X染色信號(hào)強(qiáng)度。在肺癌中USP33蛋白表達(dá)量顯著低于非肺癌組織（**， P<0. 01) 〇
[0024] 圖4從公布的數(shù)據(jù)庫中經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在肺癌患者樣本中USP33的表達(dá)量下降；其中，
[0025] 圖4A為TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌樣本中USP33基因變異及表達(dá)情況。淡藍(lán)色表示純合性 缺失；綠色表示體細(xì)胞突變；粉紅色表示表達(dá)上調(diào)；藍(lán)色表示表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果所依賴的 計(jì)算數(shù)據(jù)來自癌癥CBI0門戶網(wǎng)站((http: //www.oncomine.org).)
[0026] 圖4B為TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌樣本中USP33氨基酸突變情況。
[0027] 圖4C為利用Oncomine(http://www.oncomine.org).分析五組數(shù)據(jù)庫中肺癌患者 USP33基因的表達(dá)水平。在五組數(shù)據(jù)庫中，肺癌樣本與非腫瘤樣本相比，USP33的表達(dá)量發(fā) 生明顯下降。LUAD:肺腺癌；LuSC:肺鱗狀細(xì)胞癌，Ctrl:對(duì)照。
[0028] 圖5為不同組織樣本中USP33基因表達(dá)變化情況。
[0029] 圖6顯示了不同癌癥數(shù)據(jù)庫中顯示低表達(dá)USP33基因意味著較短的生存期；具體 如下
[0030]圖 6A為TCGA肺癌數(shù)據(jù)庫AgilentG4502A_07_3 數(shù)據(jù)，USP331ow中n= 91，USP33high中n= 91;P= 0? 0436，
[0031]圖 6B為TCGA肺癌數(shù)據(jù)庫IlluminaHiSeq_RNASeqV2 數(shù)據(jù)，USP331ow中n= 106,USP33high中n= 106;P= 0? 0267，
[0032]圖6C為 GSE3141肺癌數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)是通過 KM(http://kmplot.com/analysis/) 進(jìn)行分析。USP331ow中 n=28,USP33high中 n=83;P=0? 031，
[0033] 圖6D為GSE31210肺癌數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)是通過KM(http://kmplot.com/ analysis/)進(jìn)行分析。USP331ow中n= 113,USP33high中n= 113;P= 0? 034，
[0034]圖 6E為TCGA肺癌數(shù)據(jù)庫USP331ow中n= 61，USP33high中n= 61;P= 0? 0188，
[0035]圖 6F為肺癌數(shù)據(jù)庫利用 KM分析USP331ow中n= 562,USP33high中n= 553;P =0? 034，
[0036]圖 6G為TCGA黑色素瘤數(shù)據(jù)庫USP331ow中n= 145,USP33high中n= 50;P= 0.0453，
[0037] 圖6H為TCGA急性髓細(xì)胞白血病數(shù)據(jù)庫，USP331ow中n= 77,USP33high中n= 82;P= 0? 0282。
[0038] 圖7A和7B分別為H1299細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA或siUSP33后用對(duì)照或slit蛋白處理 之后圖片及計(jì)數(shù)分析圖，在第三天和第四天對(duì)照組和slit處理組細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化。
[0039] 圖8為USP33通過泛素化催化位點(diǎn)調(diào)節(jié)slit抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；其中，圖8A為轉(zhuǎn) 染對(duì)照siRNA或siUSP33的H1299cells傷口愈合實(shí)驗(yàn)圖片；圖8B和圖8E表示細(xì)胞遷移距 離。圖8C顯示了Western試驗(yàn)證明是siUSP33而不是對(duì)照siRNA可以抑制USP33基因在 H1299細(xì)胞中的表達(dá)。圖8D為野生型USP33或突變USP33(C163A)被用于安慰對(duì)照或slit 對(duì)照。產(chǎn)生劃痕后，邊緣的細(xì)胞將會(huì)朝右側(cè)運(yùn)動(dòng)，圖形在劃痕后不同時(shí)間點(diǎn)采集，白色點(diǎn)狀 線表示0小時(shí)傷口邊緣。圖8F為Western驗(yàn)證USP33野生型和突變基因（C163A)在H1299 細(xì)胞中表達(dá)。
[0040] 圖9顯示了 USP33與Robol相互作用，并影響Robol在肺癌細(xì)胞中的穩(wěn)定性。其 中，圖9A在H1299細(xì)胞中USP33與Robol的相互作用。在對(duì)照和slit組中利用對(duì)照IgG 或Robol抗體開展免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。免疫沉淀獲得的蛋白利用USP33抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，
[0041] 圖 9B顯示了對(duì)轉(zhuǎn)染Robo-HA,Flag-ubiquitin,CtrlsiRNA或siUSP33 的H1299 進(jìn)行去