一種多拉菌素?zé)o菌溶液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種多拉菌素?zé)o菌溶液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多拉菌素是由基因重組的阿維鏈霉菌新菌株通過添加環(huán)已氨羧酸為前體物質(zhì)發(fā)酵而成的一種阿維菌素類抗生素，屬于第三代阿維菌類藥物。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，多拉霉素的提取是采用有機(jī)醇浸提結(jié)合離子交換技術(shù)或有機(jī)醇浸提結(jié)合層析技術(shù)提取純化多拉菌素發(fā)酵液，得到其成品，其存在的主要問題是:
1提取收率低。平均提取收率僅在70%左右。
[0004]2未對多拉菌素發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，濕菌渣中水分含量超過了 60%，直接使用有機(jī)溶劑進(jìn)行浸提，導(dǎo)致溶液體積增大，增加了下游工序的處理難度。
[0005]3生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，生產(chǎn)周期長。
[0006]4生產(chǎn)成本較高，對比同類產(chǎn)品，市場競爭力較弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種有效提高提取收率，工藝簡單，生產(chǎn)周期短，且降低后續(xù)工藝處理難度的多拉菌素?zé)o菌溶液的制備方法。
[0008]為實現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
一種多拉菌素?zé)o菌溶液的制備方法，其特征在于其工藝過程為:首先將以突變阿維鏈霉菌為菌種發(fā)酵生產(chǎn)的多拉菌素發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)閃蒸干燥后得到的干菌渣用有機(jī)溶劑A浸提，降溫并加入純化水析出，過濾后所得的多拉菌素粗品用有機(jī)溶劑B溶解，超濾，結(jié)晶，再次過濾后所得的得到固體多拉菌素用有機(jī)溶劑B溶解，微濾即可得到多拉菌素?zé)o菌溶液；
所述預(yù)處理過程為:首先，將多拉菌素發(fā)酵液用酸性溶液調(diào)PH2?3，攪拌10?20min后過濾，所得濕菌渣用水稀釋，繼續(xù)攪拌10?20min，再次過濾，所得濕菌渣用水稀釋后用堿性溶液調(diào)PH9-10，再次攪拌20-40min，靜置80_100min，板框過濾即可；
所述有機(jī)溶劑A為甲醇或乙醇或丁醇或異丁醇或丙酮；
所述有機(jī)溶劑B為藥用甘油或PEG400。
[0009]所述酸性溶液為質(zhì)量濃度為20-30%的鹽酸或硫酸溶液，堿性溶液為質(zhì)量濃度為30-40%的氨水或氫氧化鈉溶液。
[0010]所述閃蒸干燥使用閃蒸干燥機(jī)干燥至菌渣水分含量低于5%，控制進(jìn)風(fēng)溫度100?120°C，出風(fēng)溫度70?90°C，加料轉(zhuǎn)速為50?400r/min。
[0011 ] 所述干菌渣用有機(jī)溶劑A浸提兩次，第一次浸提按照每1kg干菌渣加入4-5L有機(jī)溶劑A，第二次按照每1kg干菌渣加入2-2.5L有機(jī)溶劑A，每次浸提時間100-150min。
[0012]所述降溫并加入純化水析出過程為:將有機(jī)溶劑浸提液降溫至0_5°C，加入其體積的4.5-5倍純化水，靜置150-190min，過濾，得到多拉菌素粗品。
[0013]所述多拉菌素粗品或固體多拉菌素溶解在有機(jī)溶劑B中，控制其質(zhì)量濃度20-30%ο
[0014]所述超濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa，超濾膜的材質(zhì)為偏氟乙烯，孔徑為100nmo
[0015]所述結(jié)晶過程為:在攪拌狀態(tài)下，將超濾所得的多拉菌素超濾液降溫至-10-0°C，降溫速度控制在2-3°C /h,出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象時，加入晶種多拉菌素，用量為多拉菌素超濾液體積的0.1-0.3%，繼續(xù)攪拌60-100min，然后養(yǎng)晶180_200min，過濾即可得到固體多拉菌素。
[0016]所述微濾采用膜過濾設(shè)備，該設(shè)備分別安裝有規(guī)格為0.45um和0.22um的濾芯，過濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa,過濾結(jié)束，收集濾液，得到無菌多拉菌素溶液。
[0017]所述預(yù)處理過程為:第一次稀釋所用純化水用量為發(fā)酵液體積的20-30%，第二次稀釋所用純化水用量為發(fā)酵液體積的40-50%。
[0018]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在:
1提取收率較高，達(dá)到了 85%以上。
[0019]2本發(fā)明采用過濾技術(shù)代替離子交換和層析技術(shù)，降低生產(chǎn)工藝的難度，縮短了生產(chǎn)周期。
[0020]3本發(fā)明首先對發(fā)酵液進(jìn)行了預(yù)處理，從而降低了后續(xù)工藝的處理難度(原因:多拉菌素發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后，可以去除大部分不溶性顆粒，不溶性顆粒占到雜質(zhì)總量的80%以上)。
[0021]4多拉菌素臨床應(yīng)用的制劑主要是注射劑。按照國外獸藥多拉菌素注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明提供了一種制備多拉菌素?zé)o菌溶液的方法，通過該方法得到的多拉菌素溶液進(jìn)行配伍，其溶液質(zhì)量符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0022]具體實施方法
下面用實例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0023]下述實施例中的發(fā)酵液來源:
采用二級發(fā)酵模式生產(chǎn)多拉菌素，其生產(chǎn)菌種為突變阿維鏈霉菌，多拉菌素發(fā)酵培養(yǎng)基種子配方為玉米淀粉，黃豆餅粉，葡萄糖，棉籽餅粉，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米淀粉，黃豆餅粉，酵母粉，氯化鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，碳酸鈣，淀粉酶，前體環(huán)己甲酸。多拉菌素發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵周期為11天，發(fā)酵單位一般在1200mg/L。
[0024]超濾膜的材質(zhì)為偏氟乙烯，孔徑為lOOnm。
[0025]微濾中使用的濾芯由密理博中國有限公司提供膜過濾設(shè)備，該設(shè)備分別安裝有規(guī)格為0.45um和0.22um的濾芯，過濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa。
[0026]所述晶種為無菌原料藥多拉菌素。
[0027]實施例1
多拉菌素發(fā)酵液10m3，效價為1324mg/L。
[0028]發(fā)酵液預(yù)處理:首先，用20%鹽酸溶液將發(fā)酵液pH調(diào)至2，攪拌lOmin，過濾后得到濕菌渣。然后，在該濕菌渣中加入純化水2m3，攪拌lOmin，再次過濾。最后，在再次過濾所得的濕菌渣中加入純化水4m3，用30%的氨水溶液調(diào)節(jié)pH至9，攪拌20min，然后靜置80min。靜置結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，得到多拉菌素濕菌渣。
[0029]閃蒸干燥:使用閃蒸干燥機(jī)，控制進(jìn)風(fēng)溫度100?120°C，出風(fēng)溫度70?90°C，加料轉(zhuǎn)速為50?400r/min。閃蒸干燥結(jié)束，得到多拉菌素干菌渣756kg，其中水分含量為
4.1%。
[0030]有機(jī)溶劑A浸提:第一次浸提，加入甲醇3050L ;第二次浸提，加入甲醇1550L，合并兩次浸提液。
[0031]降溫并加入純化水析出:浸提液降溫溫度降至0°C，加入純化水20700L，靜置150-180min。靜置結(jié)束后過濾，得到多拉菌素粗品12.5kg。
[0032]溶解:將多拉菌素粗品溶解在藥用甘油中，濃度控制在20%。
[0033]超濾:超濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa。超濾結(jié)束，收集濾液62L。
[0034]結(jié)晶:在攪拌狀態(tài)下，將多拉菌素超濾液降溫至-10°C，降溫速度控制在2_3°C /h。出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象時，加入晶種62g。繼續(xù)攪拌60min，然后養(yǎng)晶180min。養(yǎng)晶結(jié)束后過濾，得到固體多拉菌素11.4kgο
[0035]溶解:將固體多拉菌素溶解在藥用甘油中，濃度控制在20%。
[0036]微濾:將多拉菌素溶液采用膜過濾設(shè)備過微濾，該設(shè)備分別安裝有規(guī)格為0.45um和0.22um的濾芯。過濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa。過濾結(jié)束，收集濾液，得到20%無菌多拉菌素溶液。
[0037]提取總收率:85.6%。
[0038]實施例2
多拉菌素發(fā)酵10m3，效價為1296mg/L。
[0039]發(fā)酵液預(yù)處理:首先，用23%硫酸溶液將發(fā)酵液pH調(diào)至2.3，攪拌13min，過濾后得到濕菌渣。其次，在該濕菌渣中加入純化水2.3m3，攪拌13min，再次過濾；最后，在再次過濾所得濕菌渣中加入純化水4.2m3，用33%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)多拉菌素發(fā)酵液pH至9.3，攪拌25min，然后靜置85min。靜置結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，得到多拉菌素濕菌渣。
[0040]閃蒸干燥:使用閃蒸干燥機(jī)，控制進(jìn)風(fēng)溫度100?120°C，出風(fēng)溫度70?90°C，加料轉(zhuǎn)速為50?400r/min。閃蒸干燥結(jié)束，得到多拉菌素干菌渣731kg，其中水分含量為
4.0%。
[0041]有機(jī)溶劑浸提:第一次浸提，加入甲醇3080L ;第二次浸提，加入甲醇1535L，合并兩次浸提液。
[0042]降溫并加入純化水析出:將有機(jī)溶劑浸提液溫度降至1°C，加入純化水21300L，靜置160min。靜置結(jié)束后過濾，得到多拉菌素粗品12.2kg。
[0043]溶解:將多拉菌素粗品溶解在PEG400中，濃度控制在22%。
[0044]超濾:超濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa。超濾結(jié)束，收集濾液55.3L。
[0045]結(jié)晶:在攪拌狀態(tài)下，將多拉菌素超濾液降溫至_8°C，降溫速度控制在2-3°C /h。出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象時，加入晶種83g。繼續(xù)攪拌70min，然后養(yǎng)晶185min。養(yǎng)晶結(jié)束后過濾，得到固體多拉菌素11.29kg。
[0046]溶解:將固體多拉菌素溶解在PEG400中，濃度控制在23%。
[0047]微濾:將多拉菌素溶液用膜過濾設(shè)備微濾，該設(shè)備分別安裝有規(guī)格為0.45um和
0.22um的濾芯。過濾過程中，壓力控制在0.2-0.3MPa。過濾結(jié)束，收集濾液，得到23%無菌多拉菌素溶液。
[0048]提取總收率:86.5%。
[0049]實施例3
多拉菌素發(fā)酵10m3，效價為1247mg/L。
[0050]發(fā)酵液預(yù)處理:首先，用25%鹽酸溶液