一種異種無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體而言，涉及一種制備異種（豬）無細(xì)胞真皮基質(zhì) 的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 無細(xì)胞基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM)是利用物理、化學(xué)、生物等方法將皮 膚中的表皮層及含抗原成分的細(xì)胞徹底去除僅保留真皮中含膠原網(wǎng)架的細(xì)胞外基質(zhì)而得 到的，具有創(chuàng)面覆蓋、組織缺損填充、引導(dǎo)組織再生等作用。ADM由于完全沒有了細(xì)胞成分， 免疫活性低，故一般不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)。但ADM保留有正常膠原的三維結(jié)構(gòu)和真皮中含膠 原支架的細(xì)胞外基質(zhì)，這些成分可以支持?jǐn)鄬悠て纳L，同時(shí)也有利于種子細(xì)胞的黏附 增殖等，因此無細(xì)胞基質(zhì)廣泛應(yīng)用于燒傷及整形美容領(lǐng)域。異種（豬）無細(xì)胞真皮基質(zhì)相 對(duì)同種異體皮具有來源廣泛、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，因此具有巨大的應(yīng)用前景。
[0003] 傳統(tǒng)方法制備的豬無細(xì)胞真皮基質(zhì)（porcine acellular dermal matrix, PADM) 存在細(xì)胞去除不徹底、滲透性差、孔隙率低、抗張強(qiáng)度低等缺點(diǎn)。專利號(hào)為CN1387923的中 國專利公開了一種異種無細(xì)胞真皮支架及其制備方法，該支架系用胰蛋白酶和戊二醛處理 乳豬皮而得，這種方法處理后的真皮支架具有抗張強(qiáng)度高、生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)，但其滲透 性差，創(chuàng)面易產(chǎn)生積液、積氣，血管化慢，且戊二醛對(duì)細(xì)胞有毒性，有潛在的危險(xiǎn)。專利號(hào)為 CN1343523的中國專利公開了一種可用作創(chuàng)面修復(fù)的微孔異體或異種無細(xì)胞真皮替代物， 采用機(jī)械或激光的方法在無細(xì)胞真皮上規(guī)則地打上密集的貫穿性的孔，這雖然可以解決無 細(xì)胞真皮替代物的滲透性差的缺點(diǎn)，但是孔徑過大或過密，會(huì)增加抗原位點(diǎn)的暴露和抗原 提呈細(xì)胞等接觸ADM的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致細(xì)胞相容性差，并且會(huì)一定程度上破壞膠原支架的結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有良好的透水汽性、抗 張強(qiáng)度和高孔隙率的異種無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法。其特點(diǎn)是以鹽腌豬皮為原料，通過 一系列物理、化學(xué)以及生物等方法，制備具有醫(yī)學(xué)利用價(jià)值的組織工程支架材料。
[0005] -種異種無細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法為：
[0006] (1)稱重：準(zhǔn)確稱重新鮮鹽腌豬皮，作為以下各工序的計(jì)料依據(jù)；
[0007] (2)浸水：將稱重過的鹽腌豬皮，在與鹽腌豬皮質(zhì)量比為3. 5~4. 0 :1、溫度18~ 25°C、質(zhì)量濃度為0. 30~0. 50 %的NaCl溶液中浸泡60~90分鐘，結(jié)束后將豬皮取出控 水；
[0008] (3)脫脂：將處理后的材料浸入與其質(zhì)量比為3. 0~4. 0:1、溫度25~45°C、質(zhì)量 濃度為〇. 20~0. 40%的SDS溶液，浸泡90~120分鐘后，再將處理后的材料用與其質(zhì)量比 為4. 0:1的蒸餾水水洗2次，每次15分鐘；
[0009] (4)堿膨脹：將材料放入與其質(zhì)量比為3. 0~4. 0:1、溫度18~30°C、Na0H質(zhì)量濃 度為0. 50~0. 80 %并且SDS質(zhì)量濃度為0. 3~0. 4%的混合溶液中，在GSD不銹鋼控溫比 色轉(zhuǎn)鼓中先轉(zhuǎn)動(dòng)30分鐘，再每間隔50分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)一次，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間為10分鐘，總時(shí)間為16小 時(shí)，處理完畢后放凈廢液，再將處理后的材料用與其質(zhì)量比為4. 0:1的蒸餾水水洗2次，每 次15分鐘；
[0010] (5)消除堿膨脹：在與材料質(zhì)量比為2. 0~3. 0:1、溫度25~30°C、質(zhì)量濃度為 0. 3~0. 6 %的SDS的溶液中，逐滴加入質(zhì)量濃度為3. 00 %的NH4Cl溶液，調(diào)節(jié)pH值為8. 0~ 8. 5,將上步處理好的的材料放入其中反應(yīng)60~90分鐘，并且每隔30分鐘測(cè)一次pH值，再 將處理后的材料用與材料質(zhì)量比為3. 0:1的蒸餾水水洗2次，每次15分鐘；
[0011] (6)角蛋白酶處理：將材料放入與其質(zhì)量比為2. 0:1、溫度40°C、pH值在9. 5-10. 5 之間的含質(zhì)量濃度〇. 20~0. 40 %的角蛋白酶和質(zhì)量濃度0. 2~0. 40 %的SDS的混合溶液 中反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完畢后放凈廢液，再將處理后的材料用與材料質(zhì)量比為2. 0:1的蒸餾水 水洗2次，每次15分鐘；
[0012] (7)二次酶處理：在與材料質(zhì)量比為2. 0:1、溫度40°C、含質(zhì)量濃度0.30~0.40% 胰酶和含質(zhì)量濃度〇. 20~0. 40% SDS的混合溶液中加入NH4Cl固體調(diào)節(jié)pH值，使其pH值 范圍在7. 7-8. 5之間，最佳pH值為8 ;將材料放入調(diào)節(jié)pH值后的混合溶液中反應(yīng)30分鐘， 再在混合溶液加入占溶液質(zhì)量濃度為0. 30 %的1398酶再反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢后放凈廢 液，再將處理后的材料用與材料質(zhì)量比為3. 0 :1的蒸餾水水洗3次，每次15分鐘；
[0013] (8)PBS溶液清洗：在溫度25°C下用與材料質(zhì)量比為3. 0 :1的PBS溶液沖洗3次， 每次30分鐘。
[0014] (9)封裝：材料裝袋封口；
[0015] (10)消毒：將封裝好的材料用鈷-60100Gy劑量照射消毒，放入-4°C無菌環(huán)境保 存。
[0016] 其主要技術(shù)性能指標(biāo)如下：

[0019] 表格1無細(xì)胞真皮基質(zhì)技術(shù)性能指標(biāo)
[0020] 本發(fā)明的方法所制得的異種（豬）無細(xì)胞真皮基質(zhì)具有良好的生物相容性、優(yōu)良 的力學(xué)性能、高孔隙率、高透水汽性，可廣泛應(yīng)用于燒傷和整形美容領(lǐng)域。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1.環(huán)境污染小。常規(guī)脫毛方法是在堿性環(huán)境中，通過Na2S/NaHS來破壞雙硫鍵，使 角蛋白分解成小分子量的肽或氨基酸，從而達(dá)到將毛、毛跟屑和表皮去除的目的。但這種化 學(xué)除毛工藝會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，利用角蛋白酶脫毛，可以徹底放棄硫化物的使用，根除 脫毛液對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染。
[0023] 2.膠原三維結(jié)構(gòu)完整。角蛋白酶在有效去除表皮、毛跟屑和脂腺的同時(shí)，不會(huì)分解 膠原，能夠保持膠原蛋白良好的三維結(jié)構(gòu)。
[0024] 3.材料的透水汽性、孔隙率高。實(shí)驗(yàn)表明隨著角蛋白酶用量的增加，材料的透水汽 性能不斷增加，當(dāng)角蛋白酶用量在〇. 〇〇% -〇. 30%時(shí)，材料的透水汽性能緩慢增加，當(dāng)用量 在0. 30% -0. 40%時(shí)，材料的透水汽性能明顯增大。當(dāng)角蛋白酶用量大于0. 30時(shí)，材料的 透水汽速率大于3400g ·πι-2 *24h-l。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，隨著角蛋白酶用量的增加，材料的孔 隙率不斷增加，當(dāng)角蛋白酶用量在0. 00% -0. 30%時(shí)，對(duì)材料的孔隙率影響最為明顯，當(dāng)用 量在0. 30% -0. 40%時(shí)，材料的孔隙率增加緩慢，酶對(duì)材料的孔隙率影響趨緩。當(dāng)角蛋白酶 用量大于〇. 3 %時(shí)，材料的透水汽速率大于73%。
[0025] 4.材料的力學(xué)性能優(yōu)良。傳統(tǒng)方法會(huì)導(dǎo)致膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致材 料機(jī)械強(qiáng)度大大降低，用〇. 30%角蛋白酶處理后的材料，在保證非膠原成分去除徹底的情 況下，材料的拉伸強(qiáng)度大于l〇MPa。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明方法制備的異種（豬）無細(xì)胞真皮基質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體