改性脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其改性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域,具體涉及一種改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)及其改性方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜位于眼球前壁,是一種透明組織,主要行使屏障和屈光功能。由于角膜直接與外界接觸,極易受到機(jī)械外傷、熱灼傷、酸堿侵蝕等,從而引起角膜病的發(fā)生,嚴(yán)重者甚至失明。角膜移植是臨床現(xiàn)有唯一的治療方法,但受限于角膜捐贈供體數(shù)量的嚴(yán)重匱乏,很多角膜患者在等待中失去了希望。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,體外構(gòu)建與角膜功能類似的組織功能角膜代替物成為可能,有望解決角膜供體不足的問題。
[0003]選取載體支架是成功構(gòu)建組織工程角膜的關(guān)鍵。目前應(yīng)用于組織工程角膜構(gòu)建的載體支架材料主要包括天然材料和合成材料,其中天然材料主要包括羊膜、膠原、絲素蛋白、細(xì)胞外基質(zhì);合成材料主要包括聚羥基乙酸和聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物。哺乳動物中豬和人在解剖學(xué)上比較相似且來源廣泛,因此對豬角膜進(jìn)行各種脫細(xì)胞方法處理,獲取可用于組織工程角膜的載體支架已越來越受到關(guān)注。
[0004]目前制備的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有較好的生物相容性,但由于角膜原有的膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不可避免的遭到各種程度的破壞,糖胺聚糖等天然成分大量流失,導(dǎo)致其力學(xué)強(qiáng)度、耐降解性和生物活性等有所降低。我們前期使用的國家專利《一種制備脫細(xì)胞基質(zhì)的方法》(專利號200810026972.2)只針對細(xì)胞的特異性脫細(xì)胞方法,得到保留角膜精密結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞角膜基質(zhì),臨床試用具有顯著的效果,在生理范圍內(nèi),角膜基質(zhì)愈合較好,但也存在移植術(shù)后透明性恢復(fù)較慢,極端炎癥下脫細(xì)胞基質(zhì)降解較快的現(xiàn)象。為提高其臨床效果,脫細(xì)胞角膜基質(zhì)需要進(jìn)一步改性,使其與天然的角膜細(xì)胞外基質(zhì)更加接近。
[0005]現(xiàn)有的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)改性方法主要是使用物理、化學(xué)、酶等方法實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞角膜膠原之間的交聯(lián),起到了改善脫細(xì)胞的機(jī)械性能、耐降解性和生物活性等。但上述改性方法在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用時都面臨著不同的問題。具體為:物理法,主要通過引入離子型或者兩親性交聯(lián)劑,借助范德華力、離子鍵、氫鍵、親疏水作用力等實(shí)現(xiàn)改性,此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,殘留物容易去除,但此方法的缺點(diǎn)是穩(wěn)定性差,交聯(lián)效率較低且不可控,而且容易降解、流失,同時改變角膜基質(zhì)的電位及親疏水性,存在引發(fā)免疫排斥的隱患;化學(xué)法和酶法,通過引入交聯(lián)劑(如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、I,1-羰基二咪唑、京尼平、氧化海藻酸鈉、戊二醛等)、酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、辣根過氧化物酶、酪氨酸酶、賴氨酰氧化酶和辣根過氧化物酶等)或者光(紫外、X射線等)催化等方法實(shí)現(xiàn)角膜基質(zhì)中膠原相互交聯(lián),優(yōu)點(diǎn)是形成的共價鍵十分穩(wěn)定,高效,且條件可控,缺點(diǎn)是交聯(lián)后生理?xiàng)l件下是不可逆,破壞角膜內(nèi)膠原動態(tài)六方晶格結(jié)構(gòu),對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)造成二次損傷,而且此方法還存在交聯(lián)劑、酶以及副產(chǎn)物殘留的問題。
[0006]上述改性方法還存在一個共同的問題:僅試圖修復(fù)脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),在設(shè)計(jì)上未涉及角膜生理功能的修復(fù),不能滿足臨床快速實(shí)現(xiàn)角膜透明性恢復(fù)的需要。從角膜的生理功能來說,角膜含有的結(jié)合水、自由水與其透明性密切相關(guān),二者主要是通過氫鍵、膠原纖維的六方晶格排列得到,如果不能很好的解決脫細(xì)胞角膜基質(zhì)含水率的問題,移植后就會延緩脫細(xì)胞角膜透明性恢復(fù)的時間,并在臨床上存在移植后出現(xiàn)干眼癥的隱患。總之,在改性時除了提高其機(jī)械性能等,還必須改善角膜含水率,綜合實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞角膜基質(zhì)生物穩(wěn)定性的提高。因此設(shè)計(jì)一種可以既改善脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的物理、生物穩(wěn)定性,同時又可以改善角膜生理功能的方法,是解決脫細(xì)胞角膜基質(zhì)廣泛應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]基于此,本發(fā)明的目的之一在于提供一種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法,該方法可以既改善脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的物理、生物穩(wěn)定性,同時又可以改善角膜的生理功能,使改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)在臨床上可以快速恢復(fù)透明性。
[0008]實(shí)現(xiàn)上述目的的具體技術(shù)方案如下。
[0009]—種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法,包括以下步驟:
[0010](I)將脫細(xì)胞角膜基質(zhì)預(yù)處理;
[0011](2)通過氨基酸與經(jīng)過預(yù)處理的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng),對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行接枝改性;
[0012](3)將接枝改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行后期處理,除去接枝改性處理過程中的殘留物質(zhì),即得改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
[0013]本發(fā)明的改性脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法是使用氨基酸對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行改性,借助氨基酸的氨基和羧基,達(dá)到改善脫細(xì)胞角膜基質(zhì)含水率和生物穩(wěn)定性的目的。
[0014]在其中一些實(shí)施例中,所述的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸或其衍生物、低聚物或高聚物中的一種或一種以上。
[0015]在其中一些實(shí)施例中,所述氨基酸的濃度為2yg/mL-2g/mL。
[ΟΟ??]在其中一些實(shí)施例中,所述氨基酸的濃度為5mg/mL-2g/mL。
[0017]在其中一些實(shí)施例中,步驟(2)中接枝改性時:先對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)和/或氨基酸用活化羧基或氨基的試劑進(jìn)行活化,再將脫細(xì)胞角膜基質(zhì)與氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。使用活化羧基或氨基的試劑對氨基或羧基進(jìn)行活化,可以增加接枝到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)中的氨基酸含量,提高改性效果。
[0018]在其中一些實(shí)施例中,所述活化羧基或氨基的試劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和/或N-羥基琥珀酰亞胺。
[0019]在其中一些實(shí)施例中,將脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行活化時的pH為4-8,將氨基酸進(jìn)行活化時的PH為6-9,所述活化在超聲波或微波的條件下進(jìn)行。
[0020]在其中一些實(shí)施例中,步驟(2)中的反應(yīng)在溫度為0-65°C,pH為2.5-9的條件下進(jìn)行;和/或步驟(2)中的反應(yīng)在光催化、微波或超聲波的條件下進(jìn)行。
[0021]接枝改性時,活化或者反應(yīng)在超聲波、微波或光催化的條件下進(jìn)行,調(diào)節(jié)超聲的功率、頻率;微波的功率;光催化劑量、時間等參數(shù)可進(jìn)一步增加接枝到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)中的氨基酸含量,提高改性效果。
[0022]在其中一些實(shí)施例中,所述超聲波的功率為100?600W,頻率為30-80KHZ。
[0023]在其中一些實(shí)施例中,所述微波的功率為80-120W。
[0024]在其中一些實(shí)施例中,所述光催化的劑量為20-30KyG、時間為4-8min。
[0025]在其中一些實(shí)施例中,步驟(I)中所述的預(yù)處理包括如下的步驟A,或步驟A和步驟B,或步驟A?C:
[0026]A、使用生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水浸泡脫細(xì)胞角膜基質(zhì);
[0027]B、用去離子水清洗浸泡后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì);
[0028]C、風(fēng)干或冷凍干燥后,在干燥器中保存?zhèn)溆谩?br>[0029]所述的風(fēng)干或冷凍干燥目的在于促進(jìn)氨基酸溶液和活化試劑進(jìn)入角膜內(nèi)部,提高改性效果。以復(fù)水實(shí)驗(yàn)中改性后脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的含水率為指標(biāo),復(fù)水10分鐘,含水率可以從53% (預(yù)處理時不經(jīng)過冷凍干燥)提高到79% (預(yù)處理時經(jīng)過冷凍干燥);復(fù)水24h,即充分復(fù)水后,含水率可以從81.2% (預(yù)處理時不經(jīng)過冷凍干燥)提升到93% (預(yù)處理時經(jīng)過冷凍干燥)。
[0030]在其中一些實(shí)施例中,步驟(3)所述的后期處理的方法為:將接枝改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)用去離子水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液沖洗,再用截留分子量為100?200000Da的透析裝置進(jìn)行透析,透析液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或超純水,最后經(jīng)過滅菌即得。[0031 ]本發(fā)明的另一目的在于提供一種改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
[0032]具體技術(shù)方案如下。
[0033]一種改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì),由上述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法制備得到。該改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì),使用的改性劑,安全無毒;具有良好的復(fù)水和保水性,植入后具有很好的透明性和含水率;角膜內(nèi)膠原的交聯(lián)是適度的,且在生理?xiàng)l件下是可逆,植入后角膜可以自身實(shí)現(xiàn)“修正”。
[0034]本發(fā)明的原理如下:1.角膜中的結(jié)合水主要是通過膠原以及糖胺聚糖形成的氫鍵結(jié)合。2.糖胺聚糖在角膜中主要通過N-糖苷鍵與膠原上的天門冬氨酸結(jié)合,因此使用氨基酸進(jìn)行改性,無毒,且形成的肽鍵在生理?xiàng)l件下可逆。3.角膜中的膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要通過肽鍵和氫鍵維持,氨基酸的引入可以修復(fù)脫細(xì)胞過程中對肽鍵的損傷,而氨基酸游離的氨基和羧基均能形成穩(wěn)定的氫鍵,二者協(xié)同作用有利于角膜內(nèi)膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的修復(fù),從而提高脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生物穩(wěn)定性。4.氨基酸,尤其是聚氨基酸游離的氨基和羧基具有很好的吸水和保水性(例如聚谷氨酸的保濕鎖水功效是透明質(zhì)酸的500倍),有利于恢復(fù)角膜含水率。
[0035]因此,本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0036](I)用本發(fā)明的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法進(jìn)行改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有良好的物理、生物穩(wěn)定性,比未改性的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性,復(fù)水后透明性和彈性模量也得到了改善,提高了脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生物穩(wěn)定性,植入后具有很好的透明性和含水率;
[0037](2)本發(fā)明的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的改性方法中,接枝改性時對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)和/或氨基酸用活化羧基或氨基的試劑進(jìn)行活化,活化和/或反應(yīng)在超聲波、微波或光催化的條件下進(jìn)行,可以增加接枝到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)中的氨基酸含量,進(jìn)一步提高改性效果;預(yù)處理時對脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行風(fēng)干或冷凍干燥,可以進(jìn)一步促進(jìn)氨基酸溶液和活化試劑進(jìn)入角膜內(nèi)部,進(jìn)一步提高改性效果,使改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)具有更高的吸水性、復(fù)水和保水性;
[0038](3)通過本發(fā)明的改性方法改性后的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)含有大量的氨基和羧基,植入后可以吸附生理