丹酚酸a減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 該發(fā)明涉及丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕的功效，直接制備藥物或作為某藥物的添 加劑用于促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 各種類(lèi)型的神經(jīng)損傷普遍導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生。增生的膠質(zhì)細(xì)胞具有較長(zhǎng)的 突起，相互鉸鏈形成密集的膠質(zhì)疤痕。研究進(jìn)展表明膠質(zhì)疤痕對(duì)于神經(jīng)損傷既有保護(hù)作用， 也有不利影響。神經(jīng)損傷的初期階段（急性期），膠質(zhì)疤痕把神經(jīng)損傷部位封閉起來(lái)，避免 神經(jīng)損傷繼續(xù)擴(kuò)大。然而，密集的膠質(zhì)疤痕在后期不僅妨礙了新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞迀移 進(jìn)入神經(jīng)損傷部位，也妨礙了任何藥物穿透進(jìn)入損傷部位實(shí)現(xiàn)神經(jīng)損傷修復(fù)的功效。最典 型的例子是缺血性中風(fēng)導(dǎo)致的膠質(zhì)疤痕。缺血性中風(fēng)不僅是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要因素之 一，也是導(dǎo)致生存者軀體運(yùn)動(dòng)障礙，語(yǔ)言、情緒和記憶等認(rèn)知功能障礙的主要因素之一。缺 血性中風(fēng)后，中風(fēng)部位普遍存在膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度和迅速增生，形成密集的膠質(zhì)疤痕。目前， 組織纖溶酶原活化因子（tPA)廣泛應(yīng)用于治療中風(fēng)后4. 5小時(shí)內(nèi)的患者。但是，100多個(gè) 擬治療中風(fēng)后神經(jīng)損傷的新藥臨床試驗(yàn)均以失敗告終。盡管這些臨床失敗的原因仍然不完 全清楚，膠質(zhì)疤痕可能是妨礙這些藥物順利到達(dá)損傷部位從而發(fā)揮應(yīng)有功效的重要原因之 一。因此，要實(shí)現(xiàn)中風(fēng)后神經(jīng)損傷部位的修復(fù)，需要先消融或減少膠質(zhì)細(xì)胞的密度，使治療 藥物能到達(dá)損傷部位，同時(shí)使新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞能夠迀移生長(zhǎng)進(jìn)入損傷部位，最終才 能真正實(shí)現(xiàn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)。研究具有減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕密度的新藥可能是治療中風(fēng)后 神經(jīng)損傷的關(guān)鍵，具有重大的臨床意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003] 丹酸酸 A(Salvianolic acid A)，是唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge)干燥根及莖中所含的一種水溶性酚酸類(lèi)化合物。研究報(bào)道表明，丹酚酸A具有抗 氧化作用，可以對(duì)抗超氧陰離子和羥基自由基導(dǎo)致的過(guò)氧化反應(yīng)和損傷；對(duì)缺血再灌注引 起的腦細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用；改善小鼠腦缺血再灌注導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。但 是，丹酚酸A是否具有減少或消融膠質(zhì)疤痕的功效，由此促進(jìn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)迄今未見(jiàn) 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的旨在利用丹酚酸A減少或消融膠質(zhì)疤痕，以促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)過(guò) 程，最終實(shí)現(xiàn)神經(jīng)組織和功能障礙的康復(fù)。
[0005] 優(yōu)選的，丹酚酸A直接在用于制備藥物促進(jìn)膠質(zhì)疤痕的減少或消融的應(yīng)用。
[0006] 優(yōu)選的，丹酚酸A作為添加劑應(yīng)用于制備其它藥物促進(jìn)膠質(zhì)疤痕的減少或消融的 應(yīng)用。
[0007] 優(yōu)選的，丹酚酸A直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物促進(jìn)神經(jīng)損傷后 的修復(fù)過(guò)程，預(yù)防或治療與膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生相關(guān)的神經(jīng)組織損傷或相關(guān)疾病。
[0008] 優(yōu)選的，丹酚酸A減小或消融膠質(zhì)疤痕，因而直接用于制備藥物或作為添加劑制 備其它藥物，應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的膠質(zhì)疤痕治療，最終有助于神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0009] 優(yōu)選的，丹酚酸A直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物，用于預(yù)防或治 療與膠質(zhì)疤痕相關(guān)的其它特定疾病。
[0010] 優(yōu)選的，所述特定疾病是指專(zhuān)業(yè)上顯而易見(jiàn)的膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生形成膠質(zhì)疤痕因 而妨礙了神經(jīng)損傷后的修復(fù)。
[0011] 優(yōu)選的，所述特定疾病是指血管性癡呆癥、老年癡呆癥和脊髓損傷。
[0012] 盡管本發(fā)明是以中風(fēng)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞疤痕為例闡述丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕的 功效為基礎(chǔ)的應(yīng)用。許多慢性疾病如血管性癡呆癥、老年癡呆癥、脊髓損傷等也廣泛存在過(guò) 度增生的膠質(zhì)疤痕問(wèn)題。本發(fā)明還包括這些在專(zhuān)業(yè)上顯而易見(jiàn)的應(yīng)用范圍。
[0013] 本發(fā)明中，上述涉及的丹酚酸A功效，減少或消融膠質(zhì)細(xì)胞疤痕，是丹酚酸A通過(guò) 促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽(yáng)性細(xì)胞）的重編程，把膠質(zhì)細(xì)胞在原位轉(zhuǎn)化為新生的神經(jīng)細(xì)胞（NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞），從而不僅減少或消融膠質(zhì)疤痕，也直接促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)。本發(fā)明所述的腦 疾病或腦損傷是指缺血性腦中風(fēng)以及顯而易見(jiàn)的膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生相關(guān)疾病或損傷。所 述的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，是指膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillaryacid protein (GFAP))，被認(rèn)為是用免疫組化方法檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)典型標(biāo)記分子。
[0014] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
[0015] -、丹酚酸A治療缺血性中風(fēng)的量-效關(guān)系研究
[0016] ( -）丹酚酸A (SalA)治療小鼠缺血性中風(fēng)的量-效關(guān)系研究
[0017] 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0018] 該實(shí)驗(yàn)所使用的昆明品系小鼠購(gòu)買(mǎi)于北京華埠康生物科技股份有限公司。選用小 鼠4-5周齡，雄性，體重30-35g，合格證號(hào)為SCXK (京）2014-0004。每組動(dòng)物數(shù)量見(jiàn)表1和 2。受試品為SalA。實(shí)驗(yàn)設(shè)置SalA不同劑量組、溶媒對(duì)照組（陰性對(duì)照）以及陽(yáng)性對(duì)照藥 物依達(dá)拉奉組（Edaravone) 〇
[0019] 2實(shí)驗(yàn)步驟
[0020] 采用光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠海馬缺血性中風(fēng)模型。腹腔注射玫瑰紅（RB，100mg/kg)，隨后 腹腔注射戊巴比妥鈉（約80mg/kg)麻醉動(dòng)物。頭皮下注射適量鹽酸普魯卡因后，于頭正中 線(xiàn)切開(kāi)頭皮，清理結(jié)締組織，用脫脂棉蘸取70 %酒+精擦干顱骨表面。隨后使用腦立體定 位儀固定動(dòng)物頭部，參照腦立體定位操作規(guī)范調(diào)整左右前后水平，顱骨鉆孔（鉆頭直徑約 1mm)，海馬坐標(biāo)位置為（AP :-2. 5mm，ML : ± 1. 8mm)，暴露硬腦膜，用手術(shù)針挑破硬腦膜。光纖 (直徑200 μ m)下至顱骨下1. 4mm(DV)。腹腔注射玫瑰紅后1小時(shí)，給予藍(lán)色激光（473nm) 照射20min。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)腹腔給予藥物治療或?qū)φ仗幚?。手術(shù)期間使用電熱毯保 持動(dòng)物正常體溫，供給動(dòng)物醫(yī)用混合氧氣，必要時(shí)補(bǔ)充麻醉劑以避免動(dòng)物的疼痛感受。手 術(shù)結(jié)束后等到動(dòng)物清醒、恢復(fù)自主運(yùn)動(dòng)后把動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠。給藥后的第5天處死動(dòng)物， 取出大腦（切除小腦和嗅球），稱(chēng)取腦重量，將腦置于人工腦積液環(huán)境下進(jìn)行切片（厚度為 350 μ m)，把腦片放置于PH值為7. 4的4% TTC染液中，于37°C避光孵育染色15min，然后取 出腦片放入多聚甲醛（PFA)液中固定15min。正常腦組織染成紅色，呈白色部分為缺血腦 區(qū)。將白色缺血區(qū)域用手術(shù)刀取材，隨后稱(chēng)取其重量。
[0021] 給藥方式：腹腔注射給予治療藥物SalA、EdaraV〇ne以及對(duì)照組生理鹽水。腹腔注 射SalA的時(shí)間點(diǎn)分別為中風(fēng)造模后0h、3h、5h和8h。
[0022] 檢測(cè)指標(biāo)：腦梗死指數(shù)（Infarct index)=梗死灶濕重量（g)/梗死灶濕重量 (g) X100%〇
[0023] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：各實(shí)驗(yàn)組的梗死指數(shù)，以mean土 SEM表示，用SPSS 11. 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著差異設(shè)置為P〈0. 05。
[0024] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0025] 3. 1 SalA減小小鼠腦梗死指數(shù)的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究
[0026] 表1 SalA減小小鼠腦梗死指數(shù)的劑量-效應(yīng)關(guān)系
[0028] *Ρ〈0· 05 (vs. Saline)
[0029] 缺血性中風(fēng)模型造模后，給予小鼠 SalA治療，其低、中、高劑量SalA組的梗死指數(shù) 低于對(duì)照組。與對(duì)照組比較，中劑量組（3mg/kg)的梗死指數(shù)顯著降低（P〈0. 05)，表明SalA 對(duì)小鼠缺血性中風(fēng)具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。
[0030] (二）SalA治療大鼠缺血性中風(fēng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究
[0031] 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0032] SD品系大鼠購(gòu)買(mǎi)自北京華埠康生物科技股份有限公司。使用雄性SD大鼠，體重 300-350g，合格證號(hào)為SCXK (京）2014-0004。每組動(dòng)物數(shù)量見(jiàn)表2。受試品為SalA。實(shí)驗(yàn)設(shè) 置SalA不同劑量組、溶媒對(duì)照組（陰性對(duì)照）以及陽(yáng)性對(duì)照藥物依達(dá)拉奉組（Edaravone)。
[0