033] 2實驗步驟
[0034] 采用光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠海馬缺血性中風(fēng)模型。尾靜脈注射玫瑰紅（RB，100mg/kg)，緩 慢推注，推注時間至少lmin。戊巴比妥鈉（腹腔注射約80mg/kg)麻醉SD大鼠，電熱毯保持 大鼠體溫、呼吸機(jī)供給大鼠醫(yī)用氧氣。頭皮下注射適量鹽酸普魯卡因，手術(shù)刀由正中間切開 頭皮，清理顱骨結(jié)締組織，將動物固定于腦立體定位儀。顱骨鉆孔（直徑約1mm)，打孔位置 為（AP :-3. 8mm，ML : ±2. 8mm)，暴露硬腦膜，用手術(shù)針挑破硬腦膜。光纖（直徑200 μ m)下 至顱骨下2. 5mm(DV)。等至玫瑰紅注射1小時時，給予藍(lán)色激光（473nm)照射20min。造模 后給藥。給藥后第五天處死動物，取腦，在人工腦積液環(huán)境下進(jìn)行切片（厚度為350 μ m)，把 腦片放于PH值為7. 4的4% TTC溶液中，于37°C避光孵育染色15min，取出后放入多聚甲醛 (PFA)中固定15min。然后拍照、梗死體積計算。
[0035] 給藥方式：舌下靜脈注射給予治療藥物SalA，Edaravone或生理鹽水。SalA的給 藥時間點為中風(fēng)后〇h、5h、8h和12h。
[0036] 指標(biāo)檢測：測量每一腦片的梗死面積。梗死體積（Infarct volume)=腦片梗死面 積之和X腦片厚度。
[0037] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計：各實驗組的梗死體積，以mean土 SEM表示。用SPSS 11. 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行 獨立樣本t檢驗。顯著差異設(shè)置為P〈0. 05。
[0038] 3實驗結(jié)果
[0039] 3. 1 SalA減小大鼠缺血性中風(fēng)梗死體積的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究
[0040] 表2 SalA減小大鼠缺血性中風(fēng)梗死體積的劑量-效應(yīng)關(guān)系
[0042] *Ρ〈0· 05 (vs. Saline)
[0043] SalA對缺血性中風(fēng)腦梗死體積的影響有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
[0044] 其中2mg/kg劑量可顯著減少梗死體積（P〈0. 05)。更低或更高的劑量沒有顯著效 果。
[0045] 二、SalA減少缺血性中風(fēng)模型導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞疤痕
[0046] 1實驗動物
[0047] 昆明品系小鼠購買自北京華埠康生物科技股份有限公司。使用4-5周齡，雄性，體 重 30-35g，合格證號為 SCXK (京）2014-0004。
[0048] 2實驗步驟
[0049] 用戊巴比妥鈉麻醉小鼠（60mg/kg)后，把小鼠固定于腦立體定位儀上。呼吸機(jī) 給予小鼠醫(yī)用氧氣、電熱毯維持小鼠正常體溫。在雙側(cè)海馬腦區(qū)進(jìn)行埋管，管長7_，管為 深圳瑞沃德，以顱骨冠狀縫與矢狀縫會合處（bregma)點為原點，定位光纖埋置的坐標(biāo)為： (AP :-2. 5mm，ML :±2. 0mm，DV :-1. 2mm)。用牙科水泥（dental cement)將埋入的光纖導(dǎo)管 固定于小鼠顱骨。手術(shù)結(jié)束后，等至小鼠清醒恢復(fù)自主運動后放回飼養(yǎng)箱中恢復(fù)7天。
[0050] 小鼠在清醒可自由移動的情況下，進(jìn)行海馬缺血性中風(fēng)造模。先腹腔給予小鼠 玫瑰紅（rose bengal，sigma, i. ρ·，100mg/kg)或生理鹽水（10mg/ml)，1小時后將直徑為 200 μ m的光纖沿導(dǎo)管插入并與導(dǎo)管壁螺紋旋緊固定。飼養(yǎng)環(huán)境中給予30min的藍(lán)色激光照 射（473nm，20mW)。
[0051] 在小鼠缺血性中風(fēng)造模后1小時，通過光纖導(dǎo)管給予小鼠海馬SalA或生理鹽水。 給藥時把給藥管沿導(dǎo)管插入，并與導(dǎo)管壁旋緊固定，給藥管的另一端與微量注射栗連接。微 量注射栗購買自迷醉夏新源同德醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號為WZ-50C6。模型小鼠的一側(cè)海馬 給予生理鹽水1 μ 1 ;另一側(cè)海馬給予SalA (3 μ g，1 μ 1):生理鹽水溶（1 μ 1)。
[0052] 在造模后第7天，將小鼠用戊巴比妥鈉（60mg/kg)麻醉。用pH值為7. 4的0. 1Μ PBS 50ml和pH值為7.4的4% PFA 50ml灌流和固定。隨后取出腦組織，放入上述相同4% PFA溶液中4°C過夜后固定。將后固定好的組織放入30%蔗糖生理鹽水溶液中4°C過夜脫 水。將脫水后的組織進(jìn)行冠狀切片（Leica VT1000)，腦片為40μπι厚。將腦片用0. 1M PBS 洗脫3次，每次10分鐘。
[0053] 隨后將腦片放入含有 Η202的 Triton Χ-100 溶液中（0.3% Η 202,0· 1 % Triton X-100, PBS溶）進(jìn)行室溫下通透30min。用PBS溶液洗脫三次，lOmin/次。放入封閉液中 (5%羊血清，碧云天，PBS)室溫封閉1小時。再將封閉好的孵育一抗GFAP(ab4647，Abcam)， 抗體稀釋比為1 :2000(稀釋液：5%羊血清，0. 1% Triton X-100，PBS溶），4°C過夜。將孵育 完一抗的腦片用PBS洗脫3次，lOmin/次。將上述腦片孵育二抗，Rabbit-IgG-biotin (ABC 試劑盒，碧云天），抗體稀釋比為1 :500(稀釋液：5%羊血清，0. l%Triton X-100，PBS溶）， 室溫下2小時。之后用PBS洗脫3次，lOmin/次，洗脫后，孵育抗體avidin-HRP (ABC試劑 盒，碧云天），抗體稀釋比為1 :200(稀釋液：5%羊血清，0. 1% Triton X-100, PBS溶），室 溫下2小時。孵育用PBS洗脫3次，lOmin/次。將洗脫液完畢的腦片放入DAB溶液中顯色， 最后將染好色的腦片貼片，用70%甘油進(jìn)行封片，顯微鏡觀察。
[0054] 3實驗結(jié)果
[0055] 通過GFAP免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在小鼠缺血性中風(fēng)后的第7天，中風(fēng)部位顯示了大 量密集的膠質(zhì)細(xì)胞，其長偽足相互鉸鏈形成膠質(zhì)疤痕。在3 μ g SalA治療的海馬側(cè)中風(fēng)部 位，不僅膠質(zhì)細(xì)胞有顯著的減少，其膠質(zhì)細(xì)胞的偽足突出變短，表明SalA能顯著的減小或 消融膠質(zhì)疤痕。
[0056] 通過上述例舉實驗，本發(fā)明首次闡述了丹酚酸A能減少中風(fēng)導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞疤 痕，從而直接產(chǎn)生對神經(jīng)損傷的修復(fù)功效。其意義在于丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕后，使得 內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)機(jī)理如新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞得迀移進(jìn)入損傷部位，也使得其它治療藥 物能到達(dá)損傷部位實現(xiàn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。
【主權(quán)項】
1. 一種丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用，其特征在于，丹酚酸A減小或消融膠質(zhì) 疤痕，因而直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物，應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的膠質(zhì)疤痕 治療，最終有助于神經(jīng)損傷修復(fù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用，其特征在于，丹酚 酸A直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物，用于預(yù)防或治療與膠質(zhì)疤痕相關(guān)的其 它特定疾病。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用，其特征在于，所述特 定疾病是指專業(yè)上顯而易見的膠質(zhì)細(xì)胞過度增生形成膠質(zhì)疤痕因而妨礙了神經(jīng)損傷后的 修復(fù)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用，其特征在于，所述特 定疾病是指血管性癡呆癥、老年癡呆癥和脊髓損傷。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕功效的應(yīng)用，本發(fā)明首次闡述了丹酚酸A能減少中風(fēng)導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞疤痕，從而直接產(chǎn)生對神經(jīng)損傷的修復(fù)功效。其意義在于丹酚酸A減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕后，使得內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)機(jī)理如新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞得遷移進(jìn)入損傷部位，也使得其它治療藥物能到達(dá)損傷部位實現(xiàn)神經(jīng)損傷的修復(fù)。
【IPC分類】A61P17/02, A61P25/00, A61K31/216, A61P25/28
【公開號】CN105287475
【申請?zhí)枴緾N201510789724
【發(fā)明人】徐林, 周啟心, 毛榕榕, 李津男, 焦春香, 王朦樂, 蔣睿
【申請人】云南巔青生物科技有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月17日