治療奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的益生菌組合活菌制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及益生菌菌株唾液乳桿菌 SaJiKariiA?)菌株LWT1和魏斯氏菌Aoreeftsis)菌株LWT20及治療奶牛隱性子 宮內(nèi)膜炎的益生菌組合活菌制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛子宮內(nèi)膜炎是由產(chǎn)后細(xì)菌感染引起的一種常見(jiàn)的產(chǎn)科疾病。采用抗生素及化 學(xué)藥物治療常導(dǎo)致刺激子宮粘膜出血，細(xì)菌耐藥性及牛奶污染等問(wèn)題。中藥制劑藥方復(fù)雜、 操作不便、劑量大、見(jiàn)效慢；中西藥復(fù)方仍會(huì)有抗生素的殘留；而激光、針灸、溶菌酶操作繁 瑣、見(jiàn)效慢。所以子宮內(nèi)膜炎的治療急需新型藥物，而微生態(tài)制劑在腸道中已經(jīng)得到廣泛性 應(yīng)用，并且效果顯著，但對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎治療方面尚處于空白階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為解決抗生素藥物殘留、致病菌的耐藥性；中藥制劑藥方復(fù)雜、操 作不便、劑量大、見(jiàn)效慢；激光、針灸、溶菌酶操作繁瑣、見(jiàn)效慢等問(wèn)題，因此提供益生菌菌 株唾液乳桿菌（ZacioAaciUiA? SaJiKarii/61 )LWT1 和魏斯氏菌Aoreeftsis) LWT20及治療牛子宮內(nèi)膜炎的益生菌組合活菌制劑。
[0004] 唾液乳桿菌菌株LWT1，保藏編號(hào)：CGMCC No. 11133。
[0005] 魏斯氏菌菌株LWT20,保藏編號(hào)：CGMCC No. 11134。
[0006] 治療奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的益生菌組合活菌制劑，它是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 11133的唾液乳桿菌菌株LWT1和保藏編號(hào)為CGMCC No. 11134的魏斯氏菌菌株LWT20組 合成的活菌制劑； 所述的牛為奶牛； 所述的唾液乳桿菌菌株LWT1與魏斯氏菌菌株LWT20的濃度比為1-3:1 ; 所述的唾液乳桿菌菌株LWT1與魏斯氏菌菌株LWT20的濃度比為2:1 ; 所述的活菌制劑為MRS培養(yǎng)基活菌制劑； 所述的活菌制劑終濃度為：1015CFU/mL。
[0007] 本發(fā)明提供了唾液乳桿菌菌株LWT1，它的保藏編號(hào)為CGMCC No. 11133和魏斯氏 菌菌株LWT20,它的保藏編號(hào)為CGMCC No. 11134, 2株益生菌均從健康奶牛陰道內(nèi)分離獲 得，它們?cè)谥委熌膛ｋ[性子宮內(nèi)膜炎方面均具有良好的療效，本發(fā)明還提供了由唾液乳桿 菌菌株LWT1與魏斯氏菌菌株LWT20用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，濃度比為2:1，終濃度為 1015CFU/mL，用于治療奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的益生菌組合活菌制劑。唾液乳桿菌菌株LWT1 和魏斯氏菌菌株LWT2經(jīng)過(guò)300次傳代，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變異現(xiàn)象，對(duì)抗生素均具有較好的敏感 性，具有良好的穩(wěn)定性和安全性。并且在4°C保存半年后其抑菌能力沒(méi)有明顯變化，所以該 益生菌組合活菌制劑可以長(zhǎng)期保存，該益生菌組合活菌制劑治療奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎治愈 率達(dá)到85%。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1分離的乳酸菌產(chǎn)酸測(cè)定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 實(shí)施例1菌株來(lái)源 1)唾液乳桿菌、魏斯氏菌、嗜酸乳桿菌均從健康奶牛陰道內(nèi)分離獲得，具體方法如下： a從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)和九臺(tái)養(yǎng)牛場(chǎng)分別選取30頭產(chǎn)后健康奶牛作為樣本。用棉拭 子采集健康奶牛陰道內(nèi)分泌物。采完后立即在無(wú)菌條件下放入事先配置好的MRS液體培養(yǎng) 基的試管中，lh內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室并在37 °C下厭氧培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，完成細(xì)菌的富集并取一 部分菌液保存?zhèn)溆谩?br>[0010] b使用MRS選擇性培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌進(jìn)行分離與純化，最后對(duì)乳酸菌分離株進(jìn)行保 存。
[0011] 2)篩選與鑒定 通過(guò)乳酸菌對(duì)致病菌的抑菌試驗(yàn)對(duì)乳酸菌分離株進(jìn)行篩選，此次使用的致病菌指示菌 為金黃色葡萄球菌。具體操作如下： 本試驗(yàn)采用杯碟法對(duì)乳酸菌抑制致病菌生長(zhǎng)能力進(jìn)行測(cè)試。分別取乳酸菌上清液240 ul加入事先準(zhǔn)備好的金黃色葡萄球菌平板上的牛津杯中。將平板放入培養(yǎng)箱中37 °C培養(yǎng) 48 h，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，對(duì)照組添加等量的滅菌水，培養(yǎng)完后使用游標(biāo)卡尺分別測(cè) 量各個(gè)菌株的抑菌環(huán)直徑大小并做好記錄。具體結(jié)果如表1所示：
通過(guò)乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)篩選出了 13株具有抑菌能力的乳酸菌分離 株，并通過(guò)16 SrDNA測(cè)序?qū)θ樗峋蛛x株進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定乳酸菌分離株分別為唾液乳桿 菌7株、魏斯氏菌5株、嗜酸乳桿菌1株。（具體結(jié)果為：LWT1，3, 5, 6, 12, 16, 17為唾液乳桿 菌，LWT18, 19, 20, 111，112為魏斯氏菌，LWT113為嗜酸乳桿菌)。隨后對(duì)篩選出的13株乳酸 菌進(jìn)行了對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和鏈球菌的抑菌活性試驗(yàn)，抑菌結(jié)果如表1所示。
[0012] 最后通過(guò)乳酸菌分離株對(duì)4種指示菌的抑菌活力試驗(yàn)，篩選出唾液乳桿菌LWT1、 魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳桿菌LWT113進(jìn)一步研究其益生特性(唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌 LWT20和嗜酸乳桿菌LWT113在其所屬的菌種里抑菌能力最強(qiáng))。
[0013] 實(shí)施例2乳酸菌產(chǎn)酸試驗(yàn) 將唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳桿菌LWT113接種于已滅菌的MRS液體培 養(yǎng)基中，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，37 °C厭氧靜止培養(yǎng)24 h。每隔2 h，使用酸度計(jì)分別測(cè)量各試 管中菌液的酸度值。用未接菌的液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照。最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，酸度值為 縱坐標(biāo)，繪制益生菌的酸度變化曲線。結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0014] 實(shí)施例3乳酸菌抗生素敏感性試驗(yàn) 挑取唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳桿菌LWT113的單菌落接種于MRS液 體培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)24 h，離心去上清，用生理鹽水重新懸浮并調(diào)整菌液濃度為 3X106 CFU/mL，使用涂布器在平板上均勻涂布，蓋上平皿蓋，室溫下放置5分鐘，用無(wú)菌眼 科鑷子將抗生素紙片貼于平板上，37 °C厭氧培養(yǎng)18 h。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌圈的大 小，對(duì)抑菌圈不明顯的，細(xì)菌分布不均的和抑菌圈過(guò)大的平板要做補(bǔ)充試驗(yàn)，以做進(jìn)一步的 驗(yàn)證。藥敏試驗(yàn)具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

[0015] +敏感++中度敏感+++高度敏感R抗性 唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌LWT20對(duì)萬(wàn)古霉素具有抗性，此外唾液乳桿菌LWT1還對(duì)慶 大霉素具有抗性，嗜酸乳桿菌LWT113對(duì)所有測(cè)試抗生素都具有較好的敏感性。由此可以得 出3株乳酸菌都具有較好的安全性。
[0016] 唾液乳桿菌SaJiKariiAs· )LWT1、魏斯氏菌々areeftsis) LWT20,已于2015年7月17日送于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)保藏，地址： 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。唾液乳桿 菌（ZacioAaciUiA? SaJiKari?Λ? )LWT1 保藏編號(hào)：CGMCC No. Ill33 ;魏斯氏菌 LWT20 保藏編號(hào)：CGMCC No. 11134。
[0017] 實(shí)施例4唾液乳桿菌、魏斯氏菌、嗜酸乳桿菌對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞粘附研究 將細(xì)胞濃度為2X 105 CFU/mL的細(xì)胞懸浮液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至長(zhǎng)成單層 細(xì)胞。然后使用PBS沖洗3次后，每孔中加入1 mL細(xì)菌懸液和1 mL新鮮的DMEM/F12不完 全培養(yǎng)液，以無(wú)菌PBS緩沖液作為對(duì)照，置37 °C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min。培養(yǎng)完成 后用PBS沖洗單層細(xì)胞5次，除去未粘附的細(xì)菌。
[0018] 黏附結(jié)果： 平均每個(gè)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附的唾液乳桿菌、魏斯氏菌、嗜酸乳桿菌的細(xì)菌數(shù)分別 為70. 5、34. 1、40. 2,從黏附試驗(yàn)結(jié)果中可看到唾液乳桿菌LWT1的黏附能力顯著高于嗜酸 乳桿菌。
[0019] 實(shí)施例5乳酸菌組合對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性能研究 評(píng)價(jià)1株菌株是否可以作為開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑的益生菌使用，其最主要的性能是其對(duì)致 病菌的抑菌能力高低，從上表1可以看出，嗜酸乳桿菌LWT113和魏斯氏菌LWT20對(duì)4種致 病菌的抑菌能力相近，無(wú)顯著差異，但唾液乳桿菌LWT1對(duì)其余4種致病菌的抑菌能力要遠(yuǎn) 遠(yuǎn)高于嗜酸乳桿菌LWT113。本研究的目的是開(kāi)發(fā)一種用于治療奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎益生菌 組合，所以接下來(lái)就益生菌組合對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌的抑菌能力進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)本項(xiàng) 研究對(duì)每組益生菌組合的比例進(jìn)行篩選。
[0020] (1)唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌LWT20益生菌組合，組合比例為1 :1 ;2 :1 ;1 :2 ;3 : 1;1:3五組不同比例。其抑菌能力結(jié)果如下表：
(2) 唾液乳桿菌LWT1、嗜酸乳桿菌LWT113益生菌組合，組合比例為1 :1 ;2 :1 ;1 :2 :3 : 1;1:3五組不同比例。其抑菌能力結(jié)果如下表.
(3) 魏斯氏菌LWT20、嗜酸乳桿菌LWT113益生菌組合，組合比例為1 :1 ;2 :1 ;1 :2 ;3 :1 ; 1:3五組不同比例。其抑菌能力結(jié)果如下表：
從上述表格可知：當(dāng)唾液乳桿菌LWT1、魏斯氏菌LWT20組合最佳比例為2:1 ;唾液乳桿 菌LWT1和嗜酸乳桿菌LTW113組合最佳比例為1:1 ;魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳桿菌LTW113 組合最佳比例為1:3。然后以唾液乳桿菌LWT1和魏斯氏菌LWT20益生菌2:1組合、唾液乳 桿菌LWT1和嗜酸乳桿菌LTW113益生菌1:1組合、魏斯氏菌LWT20和嗜酸乳桿菌LTW113益 生菌1:3組合對(duì)大腸桿菌、鏈球菌和沙門氏菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)(見(jiàn)下表)。