一種含重組乙肝表面抗原的納米顆粒疫苗制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別是一種可鼻腔免疫的、具有pH值敏感性和抗原遞呈細(xì) 胞靶向性的、包裹乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物（PLGA)納米顆粒疫苗制 劑，屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002] 乙型肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的世界性傳染疾病，它是由乙型肝炎病毒（HBV)的 感染而引起的疾病。目前，接種乙肝疫苗是預(yù)防和控制HBV傳播的最有效的措施之一。最 常使用的乙肝疫苗是由基因重組技術(shù)獲得的乙肝表面抗原（HBsAg)經(jīng)純化、滅活及加入鋁 佐劑吸附而成的鋁佐劑乙肝疫苗。為了達(dá)到持久而有效的免疫應(yīng)答效果，鋁佐劑乙肝疫苗 需在0,1，2個(gè)月或0,1，6個(gè)月進(jìn)行三次注射的免疫程序。由于需要專業(yè)人員進(jìn)行注射免疫 接種，且免疫程序復(fù)雜，導(dǎo)致相當(dāng)一部分人難以完成免疫程序，這種現(xiàn)象在不發(fā)達(dá)地區(qū)尤為 嚴(yán)重。此外，鋁佐劑乙肝疫苗僅選擇性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，而不能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì) 胞免疫應(yīng)答，不能有效清除細(xì)胞內(nèi)存在的HBV病毒；也不能產(chǎn)生粘膜免疫、產(chǎn)生粘膜抗體， 防止病毒通過粘膜進(jìn)行入侵。因而，臨床需要研發(fā)免疫方法簡便的、免疫效果更強(qiáng)的新型乙 肝疫苗，使更廣泛的人群受到有效的保護(hù)。與注射接種相比，鼻腔粘膜免疫接種方法簡便， 不需要侵入接種，可避免專業(yè)人員參與，自己即可進(jìn)行接種；同時(shí)，也可避免注射時(shí)針刺導(dǎo) 致的疼痛和損傷，患者依從性好，尤其對(duì)于兒童。此外，鼻腔粘膜免疫接種可減少使用污染 針頭導(dǎo)致的意外風(fēng)險(xiǎn)，增加疫苗接種的安全性，降低接種費(fèi)用，適合大范圍人群免疫接種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種含重組乙肝表面抗原的納米顆粒疫苗制劑，克服了鋁佐 劑乙肝疫苗需要注射帶來的諸多問題及其不能誘導(dǎo)粘膜免疫和細(xì)胞免疫的缺點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含重組乙肝表面抗原的納米顆粒疫苗制劑的制備 方法。
[0005] 具體的，本發(fā)明的一種含重組乙肝表面抗原的納米顆粒疫苗制劑的組成是這樣 的，以穩(wěn)定性保護(hù)劑人血清白蛋白、重組乙肝表面抗原和釋放促進(jìn)劑碳酸氫鈉組成內(nèi)核，由 高分子材料聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物作為包封層將內(nèi)核包裹，最外層包覆有殼聚糖 或甘露聚糖或它們的混合物。
[0006] 本發(fā)明中，重組乙肝表面抗原為酵母乙型肝炎表面抗原或中國倉鼠卵巢細(xì)胞分泌 的乙型肝炎表面抗原。
[0007] 本發(fā)明中，聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物分子量為9. 0 X 103~8. 7 X 10 4,其中 聚乳酸與聚羥基乙酸（PLA:PLG)的質(zhì)量比為（50:50)~（85:15)。
[0008] 本發(fā)明中，殼聚糖為低分子量殼聚糖，分子量低于5000 Da。
[0009] 本發(fā)明中，甘露聚糖為從釀酒酵母提取的細(xì)胞壁多糖，分子量35000 - 60000 Da。
[0010] 本發(fā)明的含重組乙肝表面抗原的納米顆粒疫苗制劑的制備方法，包括以下步驟： (1) 將重組乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氫鈉加入到含有聚乙烯醇的磷酸鹽緩 沖溶液中，混合得到內(nèi)水相； (2) 將聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物溶于有機(jī)溶劑中制成油相，取步驟（1)所得內(nèi)水 相加入油相中，高速攪拌形成W/0初乳液； (3) 將W/0初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中，高速攪拌形成W/0/W復(fù)乳液；再 低速攪拌6~8小時(shí)，離心洗滌，收集納米顆粒，真空冷凍干燥后，即可得到含重組乙肝表面 抗原的納米顆粒疫苗制劑成品；外水相中或者添加殼聚糖和甘露聚糖。
[0011] 本發(fā)明的制備方法，步驟（1)，乙肝表面抗原與血清白蛋白的質(zhì)量比為1 : 5 ;內(nèi)水 相乳化劑聚乙稀醇濃度為5 mg/ml~20 mg/ml ;內(nèi)水相中碳酸氫鈉的濃度為1.25 mg/ml~ 5 mg/ml〇
[0012] 本發(fā)明的制備方法，步驟（2)，內(nèi)水相與油相的體積比為1: (2~4)。
[0013] 本發(fā)明的制備方法，步驟（2)，攪拌轉(zhuǎn)速為8500~20000轉(zhuǎn)/分；以15000轉(zhuǎn)/ 分為佳；攪拌時(shí)間為30~300秒；第（3)步中攪拌乳化的轉(zhuǎn)速為8500~15000轉(zhuǎn)/分，以 12000轉(zhuǎn)/分為佳；攪拌時(shí)間為10~20分鐘。
[0014] 本發(fā)明的制備方法，步驟（2)，有機(jī)溶劑是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液， 其中，有機(jī)溶劑是二氯甲烷和丙酮的混合液時(shí)，二氯甲烷與丙酮的體積比為75:25。
[0015] 本發(fā)明的制備方法，油相中聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物的濃度為50~100 mg/ml。外水相分散介質(zhì)聚乙稀醇的濃度為5 mg/ml~50 mg/ml，可加入濃度為20~50 mg/ml的無機(jī)鹽，以增加抗原的包封率；外水相中殼聚糖的濃度為5~50 mg/ml，以20 mg/ ml為佳；外水相中甘露聚糖的濃度為2~20 Pg/ml，以10 Pg/ml為佳。本發(fā)明中內(nèi)水相、 外水相的pH值為7.0。
[0016] 本發(fā)明選擇人血清白蛋白作為穩(wěn)定劑保護(hù)乙肝表面抗原在納米顆粒制備過程中 的穩(wěn)定性；然后使用生物可降解高分子材料聚乳酸-聚羥基乙酸嵌段共聚物（PLGA)為載體 材料包封穩(wěn)定劑和重組乙肝表面抗原，制備得到重組乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羥基乙酸 嵌段共聚物納米顆粒，可以有效保證在納米顆粒制備和釋放過程中乙肝表面抗原的免疫原 性不被破壞。
[0017] 本發(fā)明提供的納米顆粒疫苗制劑，將乙肝表面抗原包裹在具有pH值敏感性和抗 原遞呈細(xì)胞靶向性的PLGA納米顆粒內(nèi)，這種納米顆粒疫苗制劑是將碳酸氫鈉與抗原一起 包裹在PLGA納米顆粒內(nèi)，在中性pH，納米顆粒釋放抗原速度很慢，但是，酸性pH (溶酶體 中）條件下，納米顆粒會(huì)快速釋放抗原。因而，抗原的釋放會(huì)受到外部環(huán)境的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞 外部，抗原釋放很慢，可避免抗原在進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞前被蛋白酶降解。只有在細(xì)胞內(nèi)的溶 酶體中才會(huì)快速釋放抗原。并且，本發(fā)明提供的納米顆粒表明經(jīng)過了甘露聚糖和殼聚糖修 飾，這種修飾具有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1)可以增強(qiáng)納米顆粒靶向抗原遞呈細(xì)胞的能力，增強(qiáng)抗原遞 呈細(xì)胞對(duì)納米粒的攝?。唬?)可以增加納米顆粒在鼻腔粘膜上的滯留時(shí)間，促進(jìn)抗原進(jìn)入 體內(nèi)，增強(qiáng)納米顆粒疫苗的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供的表面經(jīng)過修飾的、具有pH值敏感性和 抗原遞呈細(xì)胞靶向性的納米顆粒疫苗適宜于鼻腔免疫，可誘導(dǎo)產(chǎn)生HBsAg特異性的強(qiáng)體液 免疫應(yīng)答、粘膜免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，明顯優(yōu)于鋁佐劑乙肝疫苗，可以克服鋁佐劑乙肝 疫苗的缺點(diǎn)。
[0018] 本發(fā)明通過在納米顆粒表面包被甘露聚糖和殼聚糖，不僅可以增強(qiáng)納米顆粒靶向 抗原遞呈細(xì)胞的能力，增加抗原遞呈細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取，而且，可以增加納米顆粒在鼻 腔的滯留時(shí)間，促進(jìn)納米顆粒透過鼻粘膜，誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答。更為重要的是甘露聚 糖和殼聚糖修飾的pH敏感性納米顆粒在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)釋放抗原存在可調(diào)控的兩種釋放 模式，在溶酶體中的快速釋放和在細(xì)胞外部環(huán)境中的緩慢釋放。
[0019] 本發(fā)明取得的有益效果是：通過添加穩(wěn)定性保護(hù)劑制得的納米顆粒，顆粒規(guī)則無 粘連，平均粒徑在〇. 5 - 1. 5 μ m，載藥量、包封率高。作為鼻腔接種的預(yù)防乙肝病毒傳播的 納米顆粒制劑，抗原穩(wěn)定性好，免疫活性高，易于形成混懸液，適合于鼻腔接種免疫健康人 群，不僅可提高人群HBsAb水平，誘導(dǎo)粘膜免疫，預(yù)防乙肝病毒的侵入；而且可以誘導(dǎo)細(xì)胞 免疫，用于清除感染的細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒。因此，本制劑不僅可以預(yù)防乙肝病毒的傳播，又可 達(dá)到治療慢性乙肝和乙肝病毒攜帶者的效果。其制備過程簡單，易行。
【附圖說明】
[0020] 圖1為甘露聚糖和殼聚糖修飾的、PH敏感的、包裹HBsAg的聚乳酸-聚羥基乙酸 嵌段共聚物納米顆粒的掃描電鏡照片。
[0021] 圖2為巨噬細(xì)胞對(duì)不同納米顆粒的攝取量對(duì)比。
[0022] 圖3為甘露聚糖和殼聚糖修飾的、PH敏感的、包裹HBsAg的聚乳酸-聚羥基乙酸 嵌段共聚物納米顆粒的體外抗原釋放曲線。
[0023] 圖4為不同納米顆粒在鼻腔中的滯留時(shí)間對(duì)比。
[0024] 圖5為大鼠血清中抗HBsAg IgG抗體水平隨時(shí)間的變化。
[0025] 圖6為大鼠脾臟中不同制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-2