本發(fā)明涉及一種磷脂的精確定量分析方法，屬于分析檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

磷脂是一類含有磷酸基團的脂質(zhì)，是脂類化合物的重要組成部分，是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，能夠?qū)λ猩矬w的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響，并在生物信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。磷脂有促進(jìn)脂類代謝和轉(zhuǎn)運、保證血管通暢及正常肝臟功能的作用，磷脂代謝與許多不同疾病如心血管疾病等密切相關(guān)，是重要的信號分子。通過了解磷脂化合物在生物體內(nèi)的代謝情況，結(jié)合磷脂化合物的主要生理功能，進(jìn)而可對磷脂化合物在生命活動中的作用進(jìn)行全面深入地研究。

生物質(zhì)譜技術(shù)是目前磷脂類化合物分析的核心工具。目前，鳥槍質(zhì)譜技術(shù)可對脂質(zhì)進(jìn)行高靈敏度，高通量的定性分析，但此技術(shù)應(yīng)用于復(fù)雜體系磷脂類化合物的定量分析，還存在許多問題。其中一個最主要的原因是進(jìn)行磷脂分析時，分析的不是單獨的某一個磷脂分子，而是復(fù)雜生物樣品中數(shù)以百計的磷脂分子含量的變化。理論上，通過質(zhì)譜定量任一化合物必須準(zhǔn)確的比較它本身的峰強度和其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)化合物的峰強度，或者用該化合物的標(biāo)準(zhǔn)品做校準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)定量分析。然而，生物樣品中磷脂分子不僅數(shù)量眾多，結(jié)構(gòu)也很復(fù)雜，不可能購買到數(shù)十個甚至數(shù)百個不同的磷脂同位素內(nèi)標(biāo)化合物去定量生物樣品中數(shù)以百計的磷脂組分；且由于商品化的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品價格高昂、種類有限，因此通過生物樣品中所有磷脂分子的校準(zhǔn)曲線來定量顯然也十分困難。

而影響磷脂分子在質(zhì)譜中的響應(yīng)的因素很多：不同種類的磷脂分子因其自身結(jié)構(gòu)(主要是極性頭部)及溶液組成的差異而具有不同的離子化傾向，從而具有不同的質(zhì)譜響應(yīng)；即使是同類磷脂，其分子中雙鍵數(shù)目及?；滈L不同，導(dǎo)致其在質(zhì)譜檢測中具有不同的離子化效率，從而也會表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。如果在進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)的磷脂定量分析時忽略了不同磷脂分子存在的質(zhì)譜響應(yīng)差異，將可能導(dǎo)致較大的定量誤差。傳統(tǒng)的基于質(zhì)譜技術(shù)的磷脂定量方法，通常在每類磷脂中選擇一個或者兩個生物樣品中不含有的磷脂化合物分子作為內(nèi)標(biāo)，來實現(xiàn)對生物樣品中這類磷脂的定量分析，但是該方法的局限性在于，由于生物樣品中存在的磷脂成分非常多，因此很難買到商品化的生物樣品中所不含有的磷脂分子標(biāo)準(zhǔn)品來作為內(nèi)標(biāo)，更不用說購買到多個結(jié)構(gòu)不同的生物樣品中所不含有的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品來作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行精確定量分析了。多數(shù)情況下還需要自行合成生物樣品中所不含有的磷脂分子來作為內(nèi)標(biāo)化合物，非常繁瑣和費時。此外，如果受條件限制(需要找到生物樣品中所不含有的磷脂分子來作為內(nèi)標(biāo))，每類磷脂只能采用一種內(nèi)標(biāo)化合物來進(jìn)行定量，由于即使是同類磷脂，其分子中雙鍵數(shù)目及酰基鏈長不同，其在質(zhì)譜檢測中也會表現(xiàn)出截然不同的響應(yīng)，因此會導(dǎo)致較大的定量誤差且和磷脂內(nèi)標(biāo)的碳數(shù)和雙鍵數(shù)相差越多，定量結(jié)果越不準(zhǔn)確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種磷脂的精確定量分析方法，每類磷脂中可以隨意選擇多個商品化的磷脂分子作為內(nèi)標(biāo)，同時準(zhǔn)確性高，對于不同碳鏈長度和不同雙鍵數(shù)的磷脂分子定量誤差小。

本發(fā)明為解決上述提出的技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案為：

一種磷脂的精確定量分析方法，包括如下步驟：

1)選取衍生試劑及其相應(yīng)的穩(wěn)定同位素衍生試劑；

2)從每類磷脂均選擇三個或三個以上不同碳鏈長度、不同雙鍵數(shù)的磷脂標(biāo)品，配制成一類或多類磷脂的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟1)所述衍生試劑進(jìn)行輕標(biāo)記后，得到磷脂標(biāo)品輕標(biāo)記衍生物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；

3)待測樣品中的磷脂經(jīng)提取后，采用步驟1)所述相應(yīng)的穩(wěn)定同位素衍生試劑發(fā)生衍生化反應(yīng)進(jìn)行重標(biāo)記后，平行定量加入步驟2)所得內(nèi)標(biāo)溶液，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析采集質(zhì)譜圖；

4)對于每類磷脂，以步驟2)所選擇的每一種磷脂標(biāo)品輕標(biāo)記衍生物的質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，根據(jù)質(zhì)譜圖所得每類磷脂標(biāo)品輕標(biāo)記衍生物在摩爾數(shù)相同的條件下所對應(yīng)的相對豐度值為縱坐標(biāo)，建立每類磷脂的校準(zhǔn)曲線；

5)待測樣品中磷脂所對應(yīng)輕標(biāo)記衍生物R的質(zhì)荷比記為M_R，將M_R代入該類別磷脂的校準(zhǔn)曲線，計算R的質(zhì)譜相對豐度理論值I；根據(jù)質(zhì)譜圖所得待測樣品中的磷脂重標(biāo)記衍生物的相對豐度測量值為I_R，計算待測樣品中磷脂所對應(yīng)衍生物的摩爾數(shù)n_R＝(n)(I_R)/I，即為待測樣品中磷脂的摩爾數(shù)，進(jìn)一步計算得到待測樣品中磷脂的含量。

按上述方案，所述步驟2)中磷脂的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液可以為一類或者多類磷脂的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，一般配制一個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液即可，如配制成多個混合溶液就要分別進(jìn)行衍生反應(yīng)，當(dāng)然可行，但較為繁瑣。磷脂的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中磷脂的類別主要根據(jù)目標(biāo)物來決定，例如如果分析的目標(biāo)物中只有一類磷脂，那么可以選擇這一類磷脂單獨做混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

按上述方案，所述磷脂為六大類磷脂，包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。

按上述方案，步驟1)中的化學(xué)衍生試劑及其相應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑均能與磷脂分子中的羥基或氨基等活性基團發(fā)生反應(yīng)，從而對磷脂分子分別進(jìn)行輕標(biāo)記和重標(biāo)記，產(chǎn)生物理和化學(xué)性質(zhì)相同但分子量存在差異的磷脂衍生化產(chǎn)物。

按上述方案，所述步驟2)中從選擇三個或三個以上不同碳鏈長度、不同雙鍵數(shù)的磷脂時，至少選擇一個具有較低碳數(shù)及較少雙鍵數(shù)的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品；至少選擇一個具有中等碳數(shù)和中等雙鍵數(shù)的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品；及至少選擇一個具有較高碳數(shù)和較多雙鍵數(shù)的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品。其中，所述較低碳數(shù)及較少雙鍵數(shù)為小于待測樣品中的磷脂的最小碳數(shù)和雙鍵數(shù)；其中，較高碳數(shù)及較多雙鍵數(shù)為大于待測樣品中的磷脂的最大碳數(shù)和雙鍵數(shù)；中等碳數(shù)和中等雙鍵數(shù)介于較低碳數(shù)及較少雙鍵數(shù)、較高數(shù)及較多雙鍵數(shù)之間。這樣能有效保證所得到的校準(zhǔn)曲線的質(zhì)荷比范圍能覆蓋實際待測樣品中待測磷脂的質(zhì)荷比范圍，從而對具有不同質(zhì)荷比的待測磷脂分子的質(zhì)譜豐度值進(jìn)行校正，校準(zhǔn)由于碳鏈長度和不飽和度不同對磷脂定量產(chǎn)生的影響，實現(xiàn)復(fù)雜待測樣品中存在的數(shù)以百計的磷脂化合物的精確定量分析。

按上述方案，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)選采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶劑配制。

按上述方案，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各磷脂的濃度優(yōu)選在0.1-5nmol/mL范圍內(nèi)。

按上述方案，所述步驟3)中待測磷脂提取液優(yōu)選通過液液萃取方法獲得，待測樣品為生物組織樣品或生物體液樣品。

按上述方案，若步驟2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，各類別的每種磷脂的摩爾數(shù)相同，則步驟4)中直接以步驟3)所采集質(zhì)譜圖中的相對豐度值為縱坐標(biāo)；若所述步驟2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，各類別的每種磷脂的摩爾數(shù)不相同，則步驟4)中需要將其步驟3)所采集質(zhì)譜圖中的相對豐度值統(tǒng)一換算為摩爾數(shù)為n時所對應(yīng)的相對豐度值，然后步驟4)中以摩爾數(shù)均為n的條件下所對應(yīng)的相對豐度值為縱坐標(biāo)。以其中一類磷脂-磷脂酰乙醇胺PE為例，具體說明如下：

若步驟2)中磷脂酰乙醇胺選擇標(biāo)準(zhǔn)品PE12:0-12:0，PE16:0-18:1和PE24:1-24:1配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)以輕標(biāo)記后作為內(nèi)標(biāo)，分別記為IS₁，IS₂和IS₃。若IS₁，IS₂和IS₃的摩爾數(shù)相同，均為n，質(zhì)荷比m/z分別為M₁，M₂和M₃，其在步驟3)所采集質(zhì)譜圖中的相對豐度值分別為I₁，I₂和I₃，則步驟4)中直接以I₁，I₂和I₃為縱坐標(biāo)，與之相對應(yīng)的M₁，M₂和M₃建立校準(zhǔn)曲線；若IS₁，IS₂和IS₃的摩爾數(shù)不同，分別為n₁，n₂和n₃，質(zhì)荷比m/z分別為M₁，M₂和M₃，步驟3)中所采集質(zhì)譜圖中的相對豐度值分別為I₁，I₂和I₃，則計算摩爾數(shù)為n₁時，IS₂和IS₃所對應(yīng)的相對豐度值分別為I_2a和I_3a，其中I_2a＝I₂(n₁/n₂)，I_3a＝I₃(n₁/n₃)，然后以I₁，I_2a和I_3a為縱坐標(biāo)，與之相對應(yīng)的M₁，M₂和M₃為橫坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜生物樣品中存在的數(shù)以百計的磷脂化合物的精確定量分析，準(zhǔn)確性、重復(fù)性良好，解決了傳統(tǒng)磷脂質(zhì)譜定量分析中，由于不同碳鏈長度和不同雙鍵數(shù)的磷脂分子存在不同的質(zhì)譜響應(yīng)，從而定量誤差較大的問題；

2、本發(fā)明提出的精確定量方法，每類磷脂中可以隨意選擇多個商品化的磷脂分子作為內(nèi)標(biāo)，來實現(xiàn)對生物樣品中這類磷脂的定量分析，可操作性極強，方便快捷，有效克服了傳統(tǒng)方法中需要選擇生物樣品中所不含有的磷脂分子來作為內(nèi)標(biāo)的限制。

附圖說明

圖1A：通過使用甲醇/氘代甲醇進(jìn)行酸催化下的氫、氘交換反應(yīng)實現(xiàn)三甲基硅烷化重氮甲烷對磷脂分子的輕、重標(biāo)記原理圖；

圖1B：六類磷脂(磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA))結(jié)構(gòu)圖及其與三甲基硅烷化重氮甲烷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖；

圖2：以丙酮/氘帶丙酮為衍生試劑對帶氨基基團的磷脂分子(磷脂酰乙醇胺)進(jìn)行輕、重標(biāo)記原理圖；

圖3：磷脂精確定量分析方法步驟流程圖；

圖4A：甲基化衍生―輕標(biāo)記、重標(biāo)記PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1(0.5nmol/mL)質(zhì)譜圖及以甲基化衍生―輕標(biāo)記PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1(0.5nmol/mL)質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)其質(zhì)譜相對豐度值為縱坐標(biāo)的校準(zhǔn)曲線；

圖4B：采用圖4A校準(zhǔn)曲線對甲基化衍生―重標(biāo)記PC15:0-15:0，PC18:1-18:1和PC22:6-22:6(0.5nmol/mL)的相對豐度值進(jìn)行校正后的質(zhì)譜圖；

圖5：高血脂病人和對照組血漿中六類磷脂總量。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明中用到的磷脂縮寫說明：PC，磷脂酰膽堿；PE，磷脂酰乙醇胺；PS，磷脂酰絲氨酸；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；和PA，磷脂酸。磷脂分子結(jié)構(gòu)中甘油骨架上脂肪?；s寫說明：10:0，癸酸；12:0，月桂酸；14:0，肉豆蔻酸；15:0，十五烷酸；16:1，棕櫚油酸；16:0，棕櫚酸；18:3，亞麻酸；18:2，亞油酸；18:1，油酸；18:0，硬脂酸；19:0，十九烷酸；20:5，二十碳五烯酸；20:4，花生四烯酸；20:1，二十碳烯酸；20:0，花生酸；22:6，二十二碳六烯酸。

本發(fā)明中所涉及到的衍生化反應(yīng)可以采用：

1)以三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSCHN₂)作為衍生試劑，對磷脂分子進(jìn)行化學(xué)衍生，通過使用甲醇/氘代甲醇進(jìn)行酸催化下的氫、氘交換反應(yīng)實現(xiàn)磷脂分子的輕、重標(biāo)記。

三甲基硅烷化重氮甲烷與磷脂反應(yīng)的原理如圖1所示，TMSCHN₂對磷脂分子上的羥基、氨基和羧基等基團進(jìn)行甲基化反應(yīng)，對于磷脂的重標(biāo)記通過使用氘代甲醇進(jìn)行酸催化下的氫、氘交換反應(yīng)實現(xiàn)。

取100-200μL，0.1nmol-0.5nmol磷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入300μL-600μL甲醇，700μL-1400μL無水乙醚，于10mL離心管中；加入10μL-50μL新鮮配制的1.5nM-5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL-200μL TMSCHN₂(2mol/L-4mol/L)使溶液呈黃色；渦旋30s-60s后50℃-100℃水浴反應(yīng)30min-60min；然后加入6μL-10μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL-2mL甲醇/20mM-40mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中。

對于從待測樣品中提取的待測磷脂并用氮氣吹干后，加入100-200μL乙腈溶液復(fù)溶，通過使用氘代甲醇進(jìn)行酸催化下的氫、氘交換反應(yīng)實現(xiàn)TMSCHN₂對磷脂分子上的羥基、氨基和羧基等基團進(jìn)行甲基化的重標(biāo)記。

加入300μL-600μL氘帶甲醇，700μL-1400μL無水乙醚，于10mL離心管中；加入10μL-50μL新鮮配制的1.5nM-5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL-200μL TMSCHN₂(2mol/L-4mol/L)使溶液呈黃色；渦旋30s-60s后50℃-100℃水浴反應(yīng)30min-60min；然后加入6μL-10μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL-2mL甲醇/20mM-40mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中。

2)以丙酮/氘帶丙酮作為衍生試劑，可以對帶氨基基團的磷脂分子，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸進(jìn)行化學(xué)衍生，實現(xiàn)對帶氨基基團的磷脂分子的輕、重標(biāo)記，如圖2所示。

取100μL-200μL，1nmol/mL-5nmol/mL的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，100μL-200μL d0-丙酮和氰基硼氫化鈉，NaBH₃CN溶液(0.5μg/uL-2μg/uL)于5mL玻璃管中，30℃-50℃水浴反應(yīng)30-60min；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后，溶于1mL-2mL氯仿中，在溶解的反應(yīng)產(chǎn)物中加入1mL-2mL超純水，渦旋后靜置分層，棄去上層水相，反復(fù)5次，以完全去除反應(yīng)物中的NaBH₃CN；氯仿層用氮氣吹干后重新溶解于甲醇/20-40mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中。

對于從待測實際樣品中提取的待測磷脂氮氣吹干后，用100μL-200μL乙腈溶液復(fù)溶，加入100μL-200μL d6-丙酮和氰基硼氫化鈉，NaBH₃CN溶液(0.5μg/uL-2μg/uL)于5mL玻璃管中，30℃-50℃水浴反應(yīng)30-60min；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后,溶于1mL-2mL氯仿中，在溶解的反應(yīng)產(chǎn)物中加入1mL-2mL超純水，渦旋后靜置分層，棄去上層水相，反復(fù)5次，以完全去除反應(yīng)物中的NaBH₃CN；氯仿層用氮氣吹干后重新溶解于甲醇/20-40mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中。

本發(fā)明所述衍生試劑不只限于上述兩種，只要能利用磷脂分子中特有的磷酸基，羥基，氨基等基團將磷脂化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)，并同時能實現(xiàn)輕/重標(biāo)記的衍生化方法均可適用于本發(fā)明。

本發(fā)明所涉及到的質(zhì)譜分析的條件可以采用如下兩種，但不限于此，針對其他對磷脂進(jìn)行輕/重標(biāo)記的衍生化方法相對應(yīng)的質(zhì)譜分析方法均可使用。

1)以三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSCHN₂)作為衍生試劑，對磷脂分子進(jìn)行化學(xué)衍生，通過使用甲醇/氘代甲醇進(jìn)行酸催化下的氫、氘交換反應(yīng)，實現(xiàn)磷脂分子的輕、重標(biāo)記的質(zhì)譜分析條件為：質(zhì)譜分析采用直接進(jìn)樣的方式，所用儀器為AB 4000 Qtrap MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)，該儀器配有一電噴霧電離源和微量注射泵。離子源和質(zhì)量分析器的電壓參數(shù)：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(Collision Energy,CE)；掃描模式采用中性丟失掃描(NLS)或前體離子掃描模式(PIS)，見表1。掃描范圍：350-1050m/z，反吹氣27psi，離子源電壓5400V，加熱溫度(TEM)540℃，輔助氣49psi，進(jìn)樣速度：10μL/min。數(shù)據(jù)采集和處理采用AB SCIEX Analyst1.5 Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。由于經(jīng)輕標(biāo)記和重標(biāo)記后的磷脂衍生化產(chǎn)物存在質(zhì)量差，通過上述表1中所示不同的輕標(biāo)記和重標(biāo)記的掃描質(zhì)量數(shù)，在質(zhì)譜分析中能將輕標(biāo)記的磷脂內(nèi)標(biāo)和重標(biāo)記的待測樣品中的磷脂分子分別鑒定出來。

表1對衍生反應(yīng)(輕標(biāo)記和重標(biāo)記)后六類磷脂進(jìn)行質(zhì)譜分析的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)

2)以丙酮/氘帶丙酮作為衍生試劑，對磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸進(jìn)行化學(xué)衍生，實現(xiàn)對帶氨基基團的磷脂分子的輕、重標(biāo)記的質(zhì)譜分析條件為：質(zhì)譜分析采用直接進(jìn)樣的方式，所用儀器為AB 4000Qtrap MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)，所用離子源為ESI源。掃描方式分別為：未衍生磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸：正離子模式中性丟失掃描質(zhì)量數(shù)分別為141和185Da；d0/d6-丙酮標(biāo)記磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸：正離子模式雙中性丟失掃描質(zhì)量數(shù)分別為183/189和277/283。進(jìn)樣流速為10μL/min，反吹氣27psi，離子源電壓5400V，加熱溫度(TEM)540℃，輔助氣49psi，去簇電壓：117.67eV，碰撞能量：32.5eV。掃描所有譜圖均在正離子模式下采集，掃描范圍：m/z為400-900。數(shù)據(jù)采集和處理采用AB SCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。由于經(jīng)輕標(biāo)記和重標(biāo)記后的磷脂衍生化產(chǎn)物存在質(zhì)量差，通過不同的輕標(biāo)記和重標(biāo)記的掃描質(zhì)量數(shù)，在質(zhì)譜分析中能將輕標(biāo)記的磷脂內(nèi)標(biāo)和重標(biāo)記的樣品中的磷脂分子分別鑒定出來。

下述實施例中質(zhì)譜分析條件為美國Applied Biosystems公司4000Q-Trap質(zhì)譜檢測器。

實施例1

一種磷脂酰膽堿(PCs)的精確定量分析方法，包括如下步驟：

1)取100μL磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5nmol/mL的PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1六種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)作為溶劑配制(本實施例以此已知濃度的磷脂標(biāo)品作為待測溶液，以驗證定量方法的準(zhǔn)確性)，加入300μL氘帶甲醇，700μL無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色；渦旋30s后50℃-水浴反應(yīng)30min；然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中；

2)取100μL磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度均為0.5nmol/mL的PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶劑配制)，加入300μL甲醇，700μL無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色；渦旋30s后50℃-水浴反應(yīng)30min，然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中，作為輕標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)溶液；

3)取步驟2)所得經(jīng)過輕標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)溶液100μL與步驟1)所得經(jīng)過重標(biāo)記后待測溶液混合后直接進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析條件如下：

采用直接進(jìn)樣的方式，所用儀器為AB 4000Qtrap MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)，該儀器配有一電噴霧電離源和微量注射泵：離子源和質(zhì)量分析器的電壓參數(shù)：去簇能量(Declustering Potential,DP)：122.5，碎裂能量(Collision Energy,CE)：45.2；掃描模式采用前體離子掃描模式(PIS)，輕標(biāo)記磷脂酰膽堿分子掃描質(zhì)量數(shù)為198，重標(biāo)記磷脂酰膽堿分子掃描質(zhì)量數(shù)為200；掃描范圍:350-1050m/z，反吹氣27psi,離子源電壓5400V,加熱溫度(TEM)540℃,輔助氣49psi，進(jìn)樣速度:10μL/min；數(shù)據(jù)采集和處理采用ABSCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。

4)步驟2)所得經(jīng)過輕標(biāo)記的磷脂酰膽堿對應(yīng)的衍生物的質(zhì)荷比PC12:0-12:0 637.4，PC16:0-18:1 775.6和PC24:1-24:1 979.8為橫坐標(biāo)，直接以步驟3)質(zhì)譜分析得到的其相對豐度值為縱坐標(biāo)(每種磷脂的摩爾數(shù)相同)，建立校準(zhǔn)曲線(如圖4A所示)；

5)將步驟1)磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液中PC12:0-12:0，PC15:0-15:0，PC16:0-18:1，PC18:1-18:1，PC22:6-22:6和PC24:1-24:1的分子質(zhì)量數(shù)換算成經(jīng)過輕標(biāo)記的衍生物質(zhì)荷比，分別代入步驟4)所得校準(zhǔn)曲線中(由于校準(zhǔn)曲線是用輕標(biāo)記的磷脂分子的質(zhì)荷比和質(zhì)譜相對豐度做的，因此需要將待測磷脂分子的質(zhì)量數(shù)換算成其相應(yīng)輕標(biāo)記的質(zhì)荷比，再帶入校準(zhǔn)方程進(jìn)行計算其相對豐度理論值；此外由于輕標(biāo)記和重標(biāo)記后的磷脂分子的質(zhì)譜相對豐度值是一致的，因此采用校準(zhǔn)曲線計算出來的相對豐度理論值同時適用于輕標(biāo)記和重標(biāo)記的磷脂分子)，分別計算其相對豐度理論值I(如圖4B所示)，然后結(jié)合步驟3)中所得重標(biāo)記磷脂酰膽堿衍生物的相對豐度測量值I_R，計算步驟1)磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各磷脂的摩爾數(shù)n_R＝(n)(I_R)/I(其中，n為輕標(biāo)記的各磷脂標(biāo)品衍生物的摩爾數(shù)，實施例中為0.5nmol/mL)，進(jìn)一步計算得到步驟1)磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各磷脂的理論含量(見表2)，進(jìn)而與其實際含量(0.5μM即0.5nmol/mL)相比對，以驗證本發(fā)明的可行性與準(zhǔn)確性，結(jié)果如表2所示。

作為比較，表2也給出了采用PC12:0-12:0和PC24:1-24:1兩種輕標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品做為內(nèi)標(biāo)溶液，以及僅以PC24:1-24:1輕標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品做為內(nèi)標(biāo)溶液，分別進(jìn)行校準(zhǔn)，進(jìn)而計算得到步驟1)磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各磷脂的理論含量，并與其實際含量相比對。

表2定量方法準(zhǔn)確性比較和驗證

由表2可知，通過一種輕標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品做為內(nèi)標(biāo)求得的磷脂酰膽堿計算值與實際值之間的差異較大，且碳數(shù)相差越多，定量結(jié)果越不準(zhǔn)確。這是由于同類磷脂分子的碳鏈長度和脂肪?；湹牟伙柡投榷紩绊懨款惲字肿拥姆肿淤|(zhì)量，而離子化效率和質(zhì)譜響應(yīng)受碳鏈長度和不飽和度的影響較大，因此本發(fā)明通過在每類磷脂中選擇不同鏈長和雙鍵數(shù)的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品輕標(biāo)記后作為內(nèi)標(biāo)，然后以其以質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，對相對豐度值做校準(zhǔn)曲線，一定程度上可校準(zhǔn)由于碳鏈長度和不飽和度對磷脂定量產(chǎn)生的影響。

同時，表2表明，通過一種輕標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品做為內(nèi)標(biāo)，較之添加一種內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性顯著提高。而本發(fā)明加入三種輕標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品做為內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)后，大多數(shù)理論計算值都與實際值較為符合，能獲得較為精確的定量結(jié)果，且極大的增加了磷脂定量過程中內(nèi)標(biāo)物選擇的范圍和廣度；僅僅對于PC22:6-22:6這種不飽和度過大的PC定量結(jié)果仍存在一些偏差，原因是所選擇的內(nèi)標(biāo)雙鍵數(shù)過少，沒有涵蓋待測PC分子中所含有的最大雙鍵數(shù)。

實施例2

一種人血漿中六類磷脂的精確定量分析方法，包括如下步驟：

1)從人血漿樣品中提取待檢測磷脂；

i)樣品準(zhǔn)備：取40μL血漿加入900μL含4％甲酸的甲醇溶液于2mL離心管中，渦旋1min后，3000rps離心5min，取上層清液備用；

ii)柱子活化：取1mL HybridSPE柱(sigma-aldrich公司)，加入2mL甲醇活化萃取柱；

iii)上樣：將步驟i)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，流速控制為<5mL/min；

iv)淋洗：分別用1mL含1％甲酸的甲醇溶液和1mL甲醇淋洗，使固相萃取柱處于酸性環(huán)境中；

v)洗脫：先用6mL含5％氨水的甲醇溶液洗脫PC，PE，PS，PG，PI；再用6mL含20％氨水的甲醇溶液洗脫PA；將上述洗脫液用氮氣吹干后作為待測樣品，置于-80℃冰箱中待衍生化反應(yīng)；

2)取1)中待測樣品，加入100μL乙腈溶液復(fù)溶，加入300μL氘帶甲醇，700μL L無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色，渦旋30s后50℃水浴反應(yīng)30min；然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中，作為待測溶液；

3)每類磷脂PC、PE、PS、PG、PI和PA中均選擇三個不同碳鏈長度、不同雙鍵數(shù)的商品化的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，具體選擇PC12:0-12:0，PC16:0-18:1和PC24:1-24:1；PE12:0-12:0，PE16:0-18:1和PE24:1-24:1；PS12:0-12:0，PS16:0-18:1和PS24:1-24:1；PG12:0-12:0，PG16:0-18:1和PG24:1-24:1；PI12:0-12:0，PI16:0-18:1和PI24:1-24:1；PA12:0-12:0，PA16:0-18:1和PA24:1-24:1，混合后，均混合配制為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為0.5nmol/mL，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶劑配制；

取100μL 0.5nmol/mL的上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入300μL甲醇，700μL無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色，渦旋30s后50℃水浴反應(yīng)30min；然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中，作為內(nèi)標(biāo)溶液；

4)將步驟3)所得經(jīng)過輕標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)溶液與步驟2)所得經(jīng)過重標(biāo)記后待測溶液混合后直接進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析條件如下：

質(zhì)譜分析采用直接進(jìn)樣的方式，所用儀器為AB 4000Qtrap MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)，該儀器配有一電噴霧電離源和微量注射泵；離子源和質(zhì)量分析器的電壓參數(shù)：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(Collision Energy,CE)；掃描模式采用中性丟失掃描(NLS)或前體離子掃描模式(PIS)，見表1；掃描范圍:350-1050m/z，反吹氣27psi,離子源電壓5400V,加熱溫度(TEM)540℃,輔助氣49psi，進(jìn)樣速度：10μL/min；數(shù)據(jù)采集和處理采用AB SCIEX Analyst1.5Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)；

5)步驟3)所得經(jīng)過輕標(biāo)記的每種磷脂對應(yīng)的衍生物的質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，直接以步驟4)質(zhì)譜分析得到的其相對豐度值為縱坐標(biāo)(每種磷脂的摩爾數(shù)相同)，建立每種類別磷脂的校準(zhǔn)曲線；

6)步驟2)待測溶液中各磷脂經(jīng)過輕標(biāo)記的衍生物質(zhì)荷比(如表3所示)分別代入步驟5)所得其對應(yīng)類別的校準(zhǔn)曲線中，分別計算其相對豐度理論值I，然后結(jié)合步驟4)中質(zhì)譜分析所得重標(biāo)記的磷脂分子衍生物的相對豐度測量值I_R，計算步驟2)待測溶液中各磷脂的摩爾數(shù)n_R＝(n)(I_R)/I(其中，n為輕標(biāo)記的各磷脂衍生物的摩爾數(shù))，進(jìn)一步計算得到步驟1)血漿中各磷脂的含量。

本實施例中的人血漿樣品分別選擇高血脂病人的血漿樣品和普通正常人的血漿樣品作為檢測對象，結(jié)果如表3所示。

表3高血脂病人和對照組血漿中磷脂分子種類及含量

從磷脂總量上看，與正常對照相比，高血脂病人血漿中PC含量顯著升高，PL總量顯著升高，而PE，PA和PS的含量均顯著降低，PI和PG無顯著變化。通過對六類磷脂的不同磷脂分子種類進(jìn)行分析，共定性定量了血漿中33種PC，25種PE，22種PG，15種PS，17種PI和，18種PA，其中具有顯著差異的PLs分子種類有30種。與正常健康對照相比，高血脂病人血漿中有21種PL分子顯著下調(diào)，9種PL分子顯著上調(diào)。此外，從磷脂中脂肪酸組成看，高血脂病人血漿中的飽和脂肪酸含量為957.75μM，相比對照組的804.38μM，其含量明顯上調(diào)；而單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量分別為146.42μM和1454.79μM，較之對照組的289.66μM和1704.09μM，顯著下調(diào)。

實施例3

為驗證磷脂精確定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，將實施例2中所得到的精確定量分析結(jié)果與下述高血脂組與對照組的相對定量分析結(jié)果進(jìn)行了比較，包括如下步驟：

1)人血漿中六類磷脂的精確定量步驟同實施例2中的步驟1)至步驟5)；

2)高血脂組與對照組的相對定量分析步驟，包括如下步驟：

(1)分別從人血漿樣品(高血脂組與對照組)中提取待檢測磷脂，具體方法如下：

i)樣品準(zhǔn)備：取40μL血漿加入900μL含4％甲酸的甲醇溶液于2mL離心管中，渦旋1min后，3000rps離心5min，取上層清液備用；

ii)柱子活化：取1mL HybridSPE柱(sigma-aldrich公司)，加入2mL甲醇活化萃取柱；

iii)上樣：將步驟i)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，流速控制為<5mL/min；

iv)淋洗：分別用1mL含1％甲酸的甲醇溶液和1mL甲醇淋洗，使固相萃取柱處于酸性環(huán)境中；

v)洗脫：先用6mL含5％氨水的甲醇溶液洗脫PC，PE，PS，PG，PI；再用6mL含20％氨水的甲醇溶液洗脫PA；將上述洗脫液用氮氣吹干后置于-80℃冰箱中待衍生化反應(yīng)；

(2)取(1)中已提取的對照組樣品，加入100μL乙腈溶液復(fù)溶，加入300μL甲醇，700μL無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色，渦旋30s后50℃水浴反應(yīng)30min；然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中；

(3)取(1)中已提取的高血脂組樣品，加入100μL乙腈溶液復(fù)溶，加入300μL氘帶甲醇，700μL L無水乙醚，于10mL離心管中；然后加入10μL新鮮配制的1.5nM四氟硼酸的甲醇溶液，再加入100μL TMSCHN₂(2mol/L)使溶液呈黃色，渦旋30s后50℃水浴反應(yīng)30min；然后加入6μL醋酸終止衍生化反應(yīng)，與此同時，溶液由黃色變?yōu)闊o色；反應(yīng)產(chǎn)物用氮氣吹干后溶解于1mL甲醇/20mM醋酸銨(90/10,v/v)溶液中；

(4)將步驟(3)得的經(jīng)過重標(biāo)記的高血脂組樣品，與步驟(2)得到的經(jīng)過輕標(biāo)記的對照組樣品混合后直接進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析；然后，重標(biāo)記衍生化高血脂組樣本所測得的質(zhì)譜豐度值與輕標(biāo)記衍生化對照組樣本所測得的質(zhì)譜豐度值之比即為相對定量分析結(jié)果(表4)；

質(zhì)譜分析條件為：質(zhì)譜分析采用直接進(jìn)樣的方式，所用儀器為AB 4000 Qtrap MS/MS系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)，該儀器配有一電噴霧電離源和微量注射泵；離子源和質(zhì)量分析器的電壓參數(shù)：去簇能量(Declustering Potential,DP)，碎裂能量(Collision Energy,CE)；掃描模式采用中性丟失掃描(NLS)或前體離子掃描模式(PIS)，見表1；掃描范圍：350-1050m/z，反吹氣27psi，離子源電壓5400V，加熱溫度(TEM)540℃，輔助氣49psi，進(jìn)樣速度：10μL/min。數(shù)據(jù)采集和處理采用AB SCIEX Analyst1.5 Software(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)；

3)將表3中所得到的精確定量結(jié)果換算成相對值，即高血脂精確定量值/對照組精確定量值(表4中對應(yīng)于精確定量結(jié)果換算值)，并將換算值與步驟2)中相對定量所得到的檢測值(表4中對應(yīng)于相對定量結(jié)果)相比較，如表4所示。

表4高血脂病人和對照組血漿中磷脂分子相對定量結(jié)果與精確定量結(jié)果換算值比較

由表4可知：精確定量后的高血脂組含量與對照組含量的比值，同相對定量結(jié)果大多數(shù)都較為一致。雖然無論是精確定量方法還是相對定量方法都存在一些無法避免的誤差，但是相較傳統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法仍具有較大的優(yōu)勢，因此對生物樣本中復(fù)雜磷脂類化合物的定量是非常有意義的。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。