Gspe在治療細(xì)胞鈣超載損傷靶向藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種GSPE在治療細(xì)胞鈣超載損傷靶向藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]已知鈣離子通道Orai 1介導(dǎo)的鈣池可控性鈣通道或鈣離子釋放活化鈣通道(store-operated calcium/calcium release activated calcium, SOC/CRAC)是非興奮性細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要機(jī)制。革蘭氏陰性細(xì)菌及其釋放的內(nèi)毒素造成的菌血癥、內(nèi)毒素血癥直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙，毛細(xì)血管通透性增加，炎癥介質(zhì)釋放，啟動(dòng)膿毒癥的發(fā)生，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是膿毒癥發(fā)生的始動(dòng)信號，居于中心環(huán)節(jié)。在此背景基礎(chǔ)上，我們創(chuàng)新的發(fā)現(xiàn):0rail介導(dǎo)的鈣池可控性鈣離子內(nèi)流機(jī)制(store-operated calcium entry, S0CE)直接造成全身毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞|丐超載損傷，啟動(dòng)膿毒癥的發(fā)生。而針對Orai 1的靶向性藥物可以有效的阻斷Orai 1介導(dǎo)的S0CE機(jī)制，從而逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷，有效的治療膿毒癥。葡萄籽原花青素提取物GSPE(grapeseed procyanidin extract, GSPE)的主要作用具有抗氧化和抗炎癥反應(yīng)，但對細(xì)胞|丐離子代謝的作用沒有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)對治療膿毒癥存在的技術(shù)難題，本發(fā)明的目的在于提供一種GSPE在治療血管細(xì)胞鈣超載損傷靶向藥物中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了 GSPE在治療細(xì)胞鈣超載損傷靶向藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所述細(xì)胞鈣超載損傷為致膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷。
[0006]本發(fā)明所述GSPE預(yù)處理的Orail表達(dá)正常的小鼠膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)Orail顯著被抑制，膿毒癥小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載被顯著逆轉(zhuǎn)，從而證明GSPE是Orai 1的天然的特異性抑制劑，能阻斷Orail介導(dǎo)的S0CE信號，逆轉(zhuǎn)膿毒癥Orail介導(dǎo)的細(xì)胞鈣超載損傷。
[0007]本發(fā)明所述GSPE對LPS經(jīng)典的信號通路TLR4、NFkB沒有影響，特異性阻斷Orail信號，實(shí)現(xiàn)阻斷鈣超載信號的目的。
[0008]本發(fā)明首次提供了Orai 1介導(dǎo)的S0CE機(jī)制是GSPE阻斷小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷的藥物作用靶點(diǎn)。
[0009]所述的GSPE在制備治療膿毒癥靶向藥物中的應(yīng)用，以治療膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷。
[0010]本發(fā)明所述的GSPE還可加入其它治療膿毒癥的藥物中，起到靶向作用，其中所述的其它治療藥物為抗感染類藥物或重組人活化蛋白C，所述抗感染類藥物為抗生素類、抗真菌類、抗病毒類、抗支原體類、抗腫瘤類或免疫抑制劑;其中所述抗生素類為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、四環(huán)素類、酰胺醇類或大環(huán)內(nèi)脂類，所述抗真菌類為多烯類、三唑類、嘧啶類或棘白菌素類。
[0011]本發(fā)明所述GSPE可和適量藥學(xué)上可以接受的載體制備成藥物制劑，其中所述藥用載體可以是pH緩沖系統(tǒng)，滲透壓調(diào)節(jié)劑，防腐劑，穩(wěn)定劑等輔助成分，優(yōu)選自:磷酸鈉(Sodium Phosphate)、琥泊酸鈉(SodiumSuccinate)、組氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯 20/80(Polysorbate20/80)、氯化鈉(30(1;[1111101101^(16)、鹿糖(Sucrose)、三輕甲基氨基甲燒(Trometamol)和乳糖等。
[0012]本發(fā)明所述的藥物制劑為溶液制劑或干粉制劑，所述藥物制劑的給藥形式為靜脈給藥，皮下注射，腹腔內(nèi)注射或肌肉注射。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:首次發(fā)現(xiàn)Orai 1介導(dǎo)的S0CE機(jī)制是GSPE阻斷小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷的藥物作用靶點(diǎn)，經(jīng)試驗(yàn)證明，GSPE預(yù)處理的膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Or a i 1表達(dá)被顯著抑制，而T L R4、NF kB表達(dá)則沒有被抑制，因此證明G S PE特異性抑制Orail，阻斷Orail介導(dǎo)的S0CE機(jī)制，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞鈣超載損傷。
【附圖說明】
[0014]以下結(jié)合附圖所示實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0015]圖1為GSPE對膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)0ra1、TLR4、NFkB水平的影響。
[0016]圖2為GSPE對膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響。
[0017]圖3為GSPE對膿毒癥小鼠的死亡率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0019]本研究采用基因敲除的方法構(gòu)建Orai1基因表達(dá)缺陷的BALB/c小鼠模型，采用盲腸結(jié)扎穿孔CLP方法復(fù)制BALB/c小鼠腹腔感染膿毒癥模型。應(yīng)用鈣成像及分子生物學(xué)的方法確定Orail介導(dǎo)的S0CE是參與膿毒癥細(xì)胞鈣超載損傷的主要機(jī)制。LPS通過識(shí)別和活化TLR4信號、NFkB信號，進(jìn)一步活化Orail信號，啟動(dòng)Orail介導(dǎo)的S0CE，引發(fā)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流機(jī)制，導(dǎo)致膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載損傷。應(yīng)用GSPE預(yù)處理的Orail表達(dá)正常的小鼠膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)Orai 1顯著被抑制，膿毒癥小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載被顯著逆轉(zhuǎn)，從而證明GSPE是Orail的天然的特異性抑制劑，能阻斷Orail介導(dǎo)的S0CE信號，逆轉(zhuǎn)膿毒癥Orail介導(dǎo)的細(xì)胞鈣超載損傷。
[0020](一)實(shí)驗(yàn)材料:
1、構(gòu)建Orai 1基因敲除小鼠模型:采用RNA干擾技術(shù)原理，成功敲除的Orai 1基因，制備Orail基因表達(dá)沉默小鼠，并獲得子代，通過鑒定符合Orail基因表達(dá)缺陷。
[0021]2、構(gòu)建Or a i 1基因表達(dá)缺陷的膿毒癥小鼠模型:采用CLP法(盲腸結(jié)扎穿孔)構(gòu)建Orai 1表達(dá)缺陷的膿毒癥動(dòng)物模型。
[0022]3、獲得原代血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞)、以及原代腹腔巨噬細(xì)胞:摘取膿毒癥小鼠肺組織分離小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞;采用腹腔灌洗法獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
[0023]4、葡萄籽原花青素提取物GSPE，濃度200mg/kg，具有抗氧化和抗炎癥的功效。
[0024]5、0rai 1、TLR4、NFkB抗體，鈣離子熒光探針，鈣成像儀等。
[0025](二)實(shí)驗(yàn)原理:
l、0rail基因缺陷表達(dá)的膿毒癥小鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的獲得原理:
A)獲得Orai 1基因敲除小鼠:利用基因打靶技術(shù)和RNA干擾技術(shù)構(gòu)建BAB/c小鼠Orai 1純合子表達(dá)缺陷小鼠，委托廣州賽業(yè)有生物技術(shù)有限公司給予構(gòu)建和鑒定。Orail基因缺陷的小鼠的特點(diǎn)是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞膜S0C鈣離子通道被關(guān)閉，細(xì)胞外鈣離子無法通過S0C進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而完成細(xì)胞鈣內(nèi)流。
[0026]B)0rail表達(dá)缺陷小鼠膿毒癥模型建立:采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)實(shí)驗(yàn)的原理，在麻醉狀態(tài)下給予Orail表達(dá)缺陷小鼠開腹手術(shù)，暴露盲腸，對盲腸用4號注射器針頭進(jìn)行穿刺打孔，并橫向貫穿盲腸，并使適量腸內(nèi)容物流出，結(jié)扎盲腸，還納經(jīng)過穿孔并結(jié)扎的盲腸于腹腔，逐層關(guān)腹，手畢腹腔注射500ul無菌生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇，然后正常飼養(yǎng)，觀察小鼠的死亡率。CLP模型小鼠的死亡率為90%以上。
[0027]C)獲得膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞:采用酶消化、免疫磁珠二次分選法分離純化小鼠原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)Orai 1是否被敲除，分離Orai 1基因敲除小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及Orail基因表達(dá)正常的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0028]D)獲得膿毒癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞:采用腹腔灌洗的方法收集獲得膿毒癥小鼠原