用于治療血管生成依賴性和淋巴管生成依賴性疾病的生物模擬肽和生物可降解的遞送平臺(tái)的制作方法
【專利說明】用于治療血管生成依賴性和淋己管生成依賴性疾病的生物 模擬化和生物可降解的遞送平臺(tái)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年6月7日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/832,290的權(quán)益，其通過 引用W其整體并入本文。
[0003] 聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)
[0004] 本發(fā)明根據(jù)由美國國立衛(wèi)生研究院（the化tionalInstitutesofHealth)給予 的R21CA131931和ROlCA138264在美國政府支持下做出。美國政府在本發(fā)明中擁有某 些權(quán)利。
[0005] 電子提交的材料的通過引用并入
[0006] 本申請包含序列表。該序列表已作為名稱為"111232-00291_ST25.txt"的ASCII 文本文件經(jīng)EFS-WebW電子形式提交。該序列表大小為1，966字節(jié)，且創(chuàng)建日期為2014年 6月9日。該序列表在此通過引用W其整體并入。
[0007] 背景
[0008] 癌癥是美國和世界其他地區(qū)的重要的公共衛(wèi)生問題。目前，在美國1/4死亡數(shù)是 由于癌癥。血管生成在大部分類型的癌癥的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起重要的作用。特別地， 其重要性已在美國最常診斷出的女性惡性腫瘤乳腺癌中被證實(shí)?？寡苌莎煼ㄗ鳛閱?一療法或與其他療法組合是有希望的并且正在臨床前和臨床研究兩者中被緊張地研究。 抗VEGF療法顯示了臨床試驗(yàn)中的早期希望；然而，盡管在2008年抗VEGF抗體貝伐單抗 (Genentech/Roche)經(jīng)美國食品與藥物管理局（FDA)批準(zhǔn)與化療組合用于乳腺癌，在2011 年11月，抑A撤銷了乳腺癌適應(yīng)癥，因?yàn)槠湮达@示總存活益處。
[0009] 治療乳腺癌和其他癌癥，W及眼部增殖性疾病，諸如年齡相關(guān)性黃斑變性的抗血 管生成療法的開發(fā)正在進(jìn)行中。淋己管生成在癌癥轉(zhuǎn)移中還起重要作用化olopainen等 人，2011)。迄今為止，膚類藥物未被批準(zhǔn)用于治療癌癥或其他血管生成依賴性疾病和淋己 管生成依賴性疾病。
[0010] 膚已被用作多種疾病的治療劑并且最近在祀向腫瘤的臨床應(yīng)用中被研究用于成 像或治療（Fo化man, 2010;Senger等，1983;Leung等，1989 ;Ca;rmeliet, 2005 ;Ca;rmeliet 和Jain, 2000 ;Carmeliet和化in, 2011 ;Rosea等，2011)。模擬膚是生物學(xué)上模擬生物 分子上的活性決定簇的膚。通常，由于膚特異性祀向結(jié)合、穿透細(xì)胞的能力和給予不同 應(yīng)用的靈活性的修飾方便性，膚作為療法是有吸引力的工具（Carmeliet和化in, 2000; Folkman，2006)。另外，由于它們W高度特異性結(jié)合其祀它們毒性較低且它們生產(chǎn)低廉。
[0011] 然而，使膚成為有吸引力的候選者的特性中的一些也有其缺點(diǎn)。盡管膚可與細(xì)胞 受體特異性相互作用，有時(shí)運(yùn)些相互作用可W是低親和力的。另外，目前膚由于其短的半衰 期和減少的生物利用度作為治療劑的使用受限。
[0012] 修飾膚W增加其生物利用度的嘗試包括膚的非天然氨基酸置換、聚乙二醇化及膚 W納米粒子和微米粒子遞送。
[0013] 概述
[0014] 本發(fā)明公開的主題提供了用于治療與血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或 腫瘤發(fā)生相關(guān)的疾病、素亂或功能障礙的膚組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明公開的膚組合物 和方法在一些方面抑制在多種疾病或素亂中起關(guān)鍵作用的血管生成、淋己管生成、血管通 透性和/或腫瘤發(fā)生。因此，在一些方面，本發(fā)明公開的主題的組合物和方法允許預(yù)防或減 少牽設(shè)細(xì)胞、組織或器官的血管、淋己管或腫瘤形成。
[0015] 在一些方面，本發(fā)明公開的主題提供了分離的膚，所述分離的膚包含與 LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列，其中所述膚展現(xiàn)出抗 血管生成、抗血管通透性、抗腫瘤發(fā)生和/或抗淋己管生成特性。
[0016] 在其他方面，本發(fā)明公開的主題提供了組合物，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的 載體和有效量的分離的膚，所述分離的膚包含與LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至 少85%同一的氨基酸序列，其中所述膚展現(xiàn)出抗血管生成、抗血管通透性、抗腫瘤發(fā)生和/ 或抗淋己管生成特性。
[0017] 在另外的方面，本發(fā)明公開的主題提供了試劑盒，所述試劑盒包含分離的膚，所述 分離的膚包含與LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列，其中 所述膚展現(xiàn)出抗血管生成、抗血管通透性、抗腫瘤發(fā)生和/或抗淋己管生成特性。
[0018] 在仍另外的方面，本發(fā)明公開的主題提供了納米粒子或微米粒子，所述納米粒子 或微米粒子包含分離的膚，所述分離的膚包含與LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至 少85%同一的氨基酸序列，其中所述膚展現(xiàn)出抗血管生成、抗血管通透性、抗腫瘤發(fā)生和/ 或抗淋己管生成特性。
[0019] 在一些方面，本發(fā)明公開的主題提供了用于抑制牽設(shè)細(xì)胞的血管生成、淋己管生 成、血管通透性和/或腫瘤發(fā)生的方法，所述方法包括：使所述細(xì)胞與足W抑制牽設(shè)所述細(xì) 胞的血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或腫瘤發(fā)生的量的分離的膚接觸，所述分離的 膚包含與LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列。
[0020] 在一些其他方面，本發(fā)明公開的主題提供了用于治療患有與血管生成、淋己管生 成、血管通透性和/或腫瘤發(fā)生相關(guān)的疾病的受試者，或預(yù)防或延遲受試者發(fā)展與血管生 成、淋己管生成、血管通透性和/或腫瘤發(fā)生相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括：將分離的 膚W足W治療、延遲或預(yù)防所述受試者中所述疾病的量施用至所述受試者，所述分離的膚 包含與LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列。
[0021] 本發(fā)明公開的主題的某些方面在上文已被列舉，其全部或部分由本發(fā)明公開的主 題所解決，其他方面當(dāng)結(jié)合本文W下作為最好描述的所附實(shí)施例和圖考慮時(shí)，隨著描述進(jìn) 行將變得明顯。
[0022] 附圖簡述
[0023] 由此已用一般術(shù)語描述本發(fā)明公開的主題，現(xiàn)將參考附圖，其不一定按比例繪制， 且其中：
[0024] 圖1A-1C示出了使用SP2043膚（SEQIDN0:1)與人廝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)的 增殖（圖A)、附著（圖B)和遷移（圖C);
[002引圖2A-2C示出了使用SP2043膚（SEQIDNO: 1)與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HREC)的附 著（圖A)、增殖（圖B)和遷移（圖C);
[0026]圖 3A-3D示出 了使用CM對照（圖A)和SP2043膚（SEQIDN0:1)但5μΜSP2043膚； 圖B)的HUVEC管形成測定（tubeformationassay);和使用對照（Ctrl;圖C)和SP2043 膚（SEQIDNO: 1) (25μΜSP2043膚；圖D)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MEC)管形成測定；
[0027] 圖4示出了在本文和附圖中還稱為SE化1的SP2043膚（SEQIDNO: 1)對淋己管 內(nèi)皮細(xì)胞（LEC)附著的影響；
[0028] 圖5示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對淋己管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC)管形成的影響；
[0029] 圖6A-她示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MEC;圖A)和淋己 管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC;圖B)的肝細(xì)胞生長因子化G巧和膜島素生長因子（IGF1)的體外信號(hào) 傳導(dǎo)的影響；
[0030] 圖7示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對S陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和 SUM149W及雌激素受體陽性細(xì)胞系MCF-7的增殖的影響；
[0031] 圖8示出了SP2043膚（SEQIDN0:1)對MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞生長因子（HGF) 信號(hào)傳導(dǎo)的影響；
[0032]圖 9 示出了 33 天內(nèi)SP2043 膚（SEQIDNO: 1)對SCID小鼠內(nèi)MDA-MB-231 原位腫 瘤生長（ip，腹腔內(nèi)注射）的影響；
[0033] 圖10A-10B示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)(圖B)對體內(nèi)c-Met憐酸化和血管 生成的影響（圖A，對照）；
[0034] 圖11A-11G示出了SP2043膚（SEQIDN0:1)對血管生成的影響，如通過用于免疫 組織化學(xué)（1肥）的凝集素染色和用于體內(nèi)淋己管生成的LYVE-1染色所見：用凝集素染色的 對照（圖A)和用LYVE-1染色的對照（圖B);用凝集素染色的SP2043膚（SEQIDNO: 1)(圖 C)和用LYVE-1 染色的SP2043 膚（SEQIDNO: 1)(圖D);對照和SP2043 膚（SEQIDNO: 1) (圖巧；W及使用凝集素（圖巧和LYVE-1 (圖G)的像素密度；
[0035]圖 12A-12B示出了SP2043 膚（SEQIDN0:1)對MDA-MB-231-luc腫瘤在腫瘤條件 介質(zhì)預(yù)處理的轉(zhuǎn)移模型中的多個(gè)器官中轉(zhuǎn)移的影響，運(yùn)通過來自腫瘤細(xì)胞的光子通量得到 (圖A)，W及SP2043膚（SEQIDN0:1)對MDA-MB-231-luc腫瘤至淋己結(jié)的轉(zhuǎn)移的影響，如 通過對于人細(xì)胞的存在通過波形蛋白抗體染色所見（圖B);
[0036] 圖13A-13E示出了SP2043膚（SEQIDN0:1)與在CNV模型中的阿柏西普（圖A-B) 相比，和與在rho-VEGF小鼠模型中的對照（圖C-巧相比，對新血管形成的影響；
[0037] 圖14示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對激光誘導(dǎo)的CNV模型中小鼠眼睛新血管 系統(tǒng)的影響；
[0038]圖 15A-15B示出了SP2043 膚（SEQIDN0:1)對Tet/視蛋白（Opsin)AEGF小鼠 模型中血管滲漏（vascularleakage)的影響；
[0039] 圖16示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對兔眼睛中VEGF介導(dǎo)的血管通透性的影 響；
[0040]圖 17示出了聚乳酸-?基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolicacid)) (PLGA) 微米粒子中負(fù)載的SP2043膚（SEQIDN0:1)(2%)的代表性實(shí)例；PLGAW65/35的L:G比， MW= 40-75kDa來使用。比例尺為10微米；
[0041]圖184-186示出了：（圖4)負(fù)載2%和5%5口2043 膚（56910^:1)的？11；八微 米粒子和大?。╯izing);數(shù)目平均粒子分布（Num.Avg)和體積平均粒子分布（Vol.Avg)被 指明（平均值+SD);和（圖B)負(fù)載2%和5%SP2043膚（SEQIDN0:1)的PLGA微米粒子 的ζ電勢（表面電荷）；
[0042] 圖19示出了來自PLGA微米粒子的SP2043的標(biāo)記的膚類似物在生理?xiàng)l件下原位 的控釋；
[0043] 圖20示出了在PLGA微米粒子中沒有任何標(biāo)記或修飾的SP2043膚（SEQIDN0:1) 在生理?xiàng)l件下的原位控釋（W下圖32中所示方法）；
[0044] 圖21示出了滲入按重量計(jì)2%SP2043 (左）和按重量計(jì)5%SP2043 (右）的PLGA 微米粒子的沈Μ圖。PLGA在該實(shí)施例中W85/15的L:G比，MW= 190-240kDa來使用。比 例尺為10微米；
[0045] 圖22示出了使用包封進(jìn)納米粒子PLGA65/35中的SP2043膚（SEQIDNO: 1)。楠 球形納米粒子（左）和球形納米粒子（右）；
[0046] 圖23示出了包封SP2043膚（SEQIDNO: 1)的PLGA85/15微米粒子對激光誘導(dǎo) 小鼠模型中脈絡(luò)膜新血管形成后小鼠眼睛中消退的影響（示出了2周數(shù)據(jù)）；
[0047] 圖24示出了包含SP2043膚（SEQIDNO: 1)的PLGA85/15微米粒子對激光誘導(dǎo) 的濕性AMD小鼠模型中新血管形成隨時(shí)間的影響；
[0048] 圖25示出了包含SP2043膚（SEQIDNO: 1)的PLGA65/35微米粒子對激光誘導(dǎo) 的濕性AMD小鼠模型中新血管形成隨時(shí)間的影響；
[0049] 圖26示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)對兔模型中新血管形成抑制的影響。在玻 璃體內(nèi)注射進(jìn)兔眼睛之后第34天的數(shù)據(jù)；
[0050] 圖27示出了在rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠中的包封SP2043膚（SEQIDNO: 1)的 PLGA(85/15)；
[0051] 圖28示出了與其他抗血管生成劑組合的SP2043膚（SEQIDNO: 1)對小鼠中激光 誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成模型的影響；
[0052] 圖29示出了聚合物諸如PBAE對SP2043膚（SEQIDNO: 1)自組裝成約100-nm 納米粒子的能力的影響。聚合物447指（3-氨丙基）-4-甲基贓嗦封端的聚（1，4-下二醇 二丙締酸醋-共-4-氨基-1-下醇）且聚合物657指（3-氨丙基）-4-甲基贓嗦封端的聚 (1，6-己二醇二丙締酸醋-共-5-氨基-1-戊醇）度6-S5-E7)。+/-指有或沒有SP2043膚 (SEQIDN0:1)。當(dāng)SP2043膚（SEQIDN0:1)與聚合物一起自組裝時(shí)，粒徑較大且納米粒 子濃度較大；
[0053] 圖30示出了包封SP2043的PLGA納米粒子和PLGA-PEG納米粒子；
[0054] 圖31A-31B示出了系統(tǒng)靜脈內(nèi)注射的包含SP2043膚（SEQIDN0:1)的納米粒子 或游離膚對在腫瘤W及其他器官內(nèi)積累的影響。圖31A示出了每一器官的積累且圖31B示 出了總積累。在兩個(gè)圖中，術(shù)語"裸的"指游離膚，而術(shù)語"球形"、"楠球形"和"PEG"即聚 乙二醇，指包含SP2043膚（SEQIDN0:1)的納米粒子的Ξ種不同的類型；且
[00巧]圖32A-32B示出了通過使用電泳和用SimplyBlue染色（圖A)隨后通過質(zhì)譜 法（圖B)定量本發(fā)明公開的膚的方法。圖A包含W下樣品：泳道1，標(biāo)志物；泳道2,4μg SP2043膚（SEQIDNO: 1)陽性對照；泳道3,在PBS介質(zhì)中的4μgSP2043膚（SEQID N0:1);泳道4,在FBS介質(zhì)中的 4ygSP2043 膚（SEQIDN0:1)。
[0056] 詳述
[0057] 本發(fā)明公開的主題現(xiàn)將參考附圖在下文中被更充分描述，其中示出本發(fā)明公開的 主題中的一些而非全部實(shí)施方案。同樣的數(shù)字始終指相同的要素。本發(fā)明公開的主題可w W許多不同的形式來體現(xiàn)并且不應(yīng)該被解釋為限于本文闡述的實(shí)施方案；相反，提供運(yùn)些 實(shí)施方案使得本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。事實(shí)上，本文闡述的本發(fā)明公開的主題 的許多修飾和其他實(shí)施方案將為本發(fā)明公開的主題所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員想到具有上 述說明和相關(guān)附圖中呈現(xiàn)的教導(dǎo)的益處。此外，應(yīng)該理解，本發(fā)明公開的主題不限于公開的 具體實(shí)施方案且修飾和其他實(shí)施方案旨在被包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[005引I.來源于IV型膠原的模擬膚
[0059] 對于某些疾病，相比于其他類型的療法，膚通常提供許多優(yōu)勢，由于它們是無免疫 原性的、因?yàn)樗鼈僕高度特異性結(jié)合至其祀而毒性較低，并且生產(chǎn)成本低廉。參見，例如，國 際PCT專利公布號(hào)W0 2008/085828和國際PCT專利申請公布號(hào)W0 2007/033215,其每個(gè)通 過引用W其整體并入本文。本發(fā)明公開的膚展現(xiàn)出抗血管生成、抗血管通透性、抗腫瘤發(fā)生 和/或抗淋己管生成特性，其可導(dǎo)致某些疾病中總存活率的增加。例如，本發(fā)明公開的膚可 有益于癌癥患者并可有助于治療眼部增殖性疾病，諸如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視 網(wǎng)膜病變。
[0060] 通常，本發(fā)明公開的膚被表征為具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQ IDNo:2)的基序。表征為具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXNINNVXNF(SEQIDNo:4)的 基序的膚已在國際公布WO2012/079088(通過引用W其整體并入本文）中被公開。該基序 通過做出pentastatin-1膚中的置換來確定。W0 2012/079088出版物公開了，在一些實(shí)施 方案中，SEQIDNo:3中由X指示的位置可W是變化的并且所得的膚還可用于，且在一些實(shí) 施方案中更好用于抑制血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或腫瘤發(fā)生，W及其用于治 療運(yùn)些病的受試者，而SEQIDNo:3中其他位置可W是不變的W保留抑制特征。在其他實(shí) 施方案中，發(fā)現(xiàn)了在W下位置上的X可W具有SEQIDNo:3中W下置換：位置7可W是M、 A或G;位置9可W是F、A、Y或G;位置10可W是M、A、G、dA或Nle;位置11可W是F、A、 ￥、0或4-(：1化6;位置12和位置18可^是4扣、6、5、4、￥、1\1、1或4117617。在一個(gè)實(shí)施 方案中，公開了表征為具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFININNVINF(SEQIDNo:3;還稱為 SP2036)的基序的膚。
[0061] 本發(fā)明公開的膚被表征為具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQID No:2)的基序，其在位置13和16不同于先前公開的SEQIDNo:4(表1)。在特定的實(shí)施 方案中，公開了表征為具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDNo:l;還稱為 SP2043和SEQ. 1)的基序的膚，其在位置13和16不同于先前公開的SEQIDNo:3(還稱為 SP2036)(表1)。本文公開了位置13和16上的天冬氨酸的置換導(dǎo)致運(yùn)樣的膚，所述膚疏 水性更低，但仍可用于抑制牽設(shè)細(xì)胞、組織或器官的血管生成、淋己管生成、血管通透性和/ 或腫瘤發(fā)生，W及其用于治療運(yùn)些病的受試者。另外，由于該膚疏水性更低，更容易產(chǎn)生。 [006引表1.代表性膚
[0063]
[0064]A.代表性實(shí)施方案
[0065] 在特定的實(shí)施方案中，分離的膚包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQID N0:1)ο
[0066] 在一些實(shí)施方案中，膚包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQIDNO: 2)，且 其中X是任何氨基酸。X可W是天然氨基酸或非天然氨基酸。
[0067] 在其他實(shí)施方案中，膚包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQIDNO: 2)，其 中X在位置7上是Μ、A或G;X在位置9上是F、A、Y或G;X在位置10上是Μ、A、G、dA或 Nle;X在位置11上是F、A、Y、G或4-ClI%e;X在位置12和位置18上是Abu、G、S、A、V、T、 I、L或AllyGly。在該實(shí)施方案中在X殘基上的每個(gè)置換已被測試（如在國際PCT專利申 請公布號(hào)W0 2012/079088中所示，其通過引用W其整體并入本文，或在本文W下提供的實(shí) 施例中示出）或是測試的氨基酸的保守氨基酸置換。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的膚具有數(shù)個(gè)X殘基，其可W是任何氨基酸，無論 天然或非天然狂7、乂9^10^11^12和乂18)。就天然氨基酸而言，意指自然界中存在的那 些氨基酸，諸如甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、天冬 酷胺、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酷胺、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、半脫氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲 硫氨酸、脯氨酸、化咯賴氨酸和砸代半脫氨酸。就非天然氨基酸而言，意指自然界中不存在， 但可被滲入多膚鏈中的氨基酸。非天然氨基酸包括但不限于：2-氨基下酸（Abu)、