EG得到2 % (或其他 期望的比）的最終膚w/w%。對于空白的納米粒子，將等同體積的僅DMF添加至PLGA-PEG。 將PLGA-PEG/膚/DMF溶液逐滴添加至在攬拌板上旋轉(zhuǎn)的Milli-Q水至1:10有機(jī)：水的 最終體積比。將混合物在化學(xué)通風(fēng)楓下旋轉(zhuǎn)4小時。粒子使用AmiconUltra-15離屯、管 (Millipore)在4°C下洗涂兩次，每次旋轉(zhuǎn)lOmin。將濃縮的粒子在4°C下儲存于水中，或與 不同量的薦糖（Sigma-Al化ich)凍干。
[0187] 聚合物-膚復(fù)合物：將每種類型的聚合物（PBA巧和膚（SP2043;SEQIDN0:1)取 決于期望的PBAE:2043質(zhì)量比（從1:1至100:1)W不同的濃度在NaAc緩沖液中稀釋。將 該P(yáng)BAE溶液用移液器吸取至2043溶液并在室溫下解育5分鐘。粒子通過Nanosi曲t納米 粒子追蹤分析、動態(tài)光散射和/或透射電子顯微鏡來表征。
[0188]PLGA和PLGA-PEG粒子表征：對于尺寸，微米粒子或納米粒子首先在水或PBS中被 稀釋至Img/mL，并然后通過使用適當(dāng)?shù)幕疭、NTA、SEM或TEM定尺寸。對于載量，將粒子首 先溶解于DMS0中。對樣品的部分，將DMS0樣品添加至更大水體積，W沉淀PLGA。對于標(biāo)記 的膚，BiotekSynergy2板閱讀器被用來測量樣品和標(biāo)記的膚唯一標(biāo)準(zhǔn)的巧光。對于未標(biāo) 記的2043樣品，PAGE和銀染被用來定量膚。
[0189] 微米粒子的SEM成像和ImageJ量化：將凍干的粒子放置在碳帶巧lectron MicroscopySciences,Hatfield,PA)上，并放置在侶制支架（aluminummount)上。將樣品 噴瓣金鈕，并且沈Μ成像用LEO/Zeiss陽沈Μ(JohnsHopkinsSchoolofMedicine)來進(jìn) 行。
[0190] 實(shí)施例2
[0191]SP2043 化（SEQIDN0:1)
[0192] 發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDNO: 1)抑制人廝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC;圖1)和視網(wǎng)膜內(nèi) 皮細(xì)胞（HREC;圖。的增殖、遷移和附著。另外，發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDN0:1) (25μM)抑 制冊VEC管形成（圖3,圖A和Β)和微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MEC)管形成（圖3,圖C和D)。此 夕F，發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDN0:1)抑制淋己管內(nèi)皮細(xì)胞附著（LEC;圖4)和LEC管形成（圖 5)。
[0193] 還發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDN0:1)抑制MEC和LEC細(xì)胞中的肝細(xì)胞生長因子（服F) 和膜島素生長因子UIGF1)的體外信號傳導(dǎo)（圖6)。另外，發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDN0:1) 抑制Ξ陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和SUM149W及雌激素受體陽性細(xì)胞系MCF-7的體外 增殖（圖7)。此外，發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDNO: 1)抑制MDA-MB-231細(xì)胞中的HGF信號傳 導(dǎo)（圖8)。
[0194]SP2043膚（SEQIDNO: 1)還顯示了通過抑制MDA-MB-231原位腫瘤在SCID小鼠中 的生長的體內(nèi)抑制（圖9)。在將SP2043膚（SEQIDNO: 1)注入小鼠33天之后，腫瘤的生長 被抑制約82% (使用20mg的SP2043/kg用腹腔內(nèi)注射）。還發(fā)現(xiàn)SP2043膚（SEQIDNO: 1) 抑制體內(nèi)c-Met的憐酸化和血管生成（圖10)。SP2043膚（SEQIDN0:1)抑制血管生成 (如通過用于免疫組織化學(xué)（1肥）的凝集素染色所見）和淋己管生成（如通過體內(nèi)LYVE-1 染色所見）（圖11)。SP2043在腫瘤條件培養(yǎng)基預(yù)處理的轉(zhuǎn)移模型中抑制MDA-MB-231-luc 腫瘤轉(zhuǎn)移至多個器官，運(yùn)通過來自腫瘤細(xì)胞的光子通量得到（圖12A)。SP2043膚（SEQID N0:1)還抑制MDA-MB-231-luc腫瘤轉(zhuǎn)移至淋己結(jié)（如對于人細(xì)胞的存在通過用波形蛋白抗 體染色所見）（圖12B)。
[0195]SP2043膚（SEQIDN0:1)的影響還見于人眼部疾病諸如年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD)、黃斑水腫（M巧和糖尿病性黃斑水腫（DME)的眼模型中。SP2043膚（SEQIDN0:1) 在激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)模型中抑制新血管形成比阿柏西普更有效力（圖 13A-B)，并在rhoVEGF小鼠模型中抑制新血管形成比對照更有效力（圖13C-E)。另外， SP2043膚（SEQIDN0:1)導(dǎo)致激光誘導(dǎo)的CNV模型中小鼠眼睛新血管系統(tǒng)的消退（圖14) 此外，SP2043膚（SEQIDNO: 1)抑制Tet/視蛋白/VEGF小鼠模型中血管滲漏（圖15A-B)。 此外，SP2043膚（SEQIDNO: 1)抑制兔眼睛中VEGF介導(dǎo)的血管通透性（圖16)。
[0196] 實(shí)施例3 陽197] 在微乂粒子中的SP2043化（SEQIDN0:1)
[019引本發(fā)明公開的分離的膚可被配制于并用于微米粒子或納米粒子中。將SP2043膚(SEQIDN0:1)配制到PLGA微米粒子中W能夠長期緩釋并通過掃描電子顯微鏡（SEM)成 像來示出（2%負(fù)載的；圖17)。圖18A示出了負(fù)載2%和5%SP2043的PLGA微米粒子的尺 寸的一個代表性的實(shí)例。微米粒子的尺寸用沈Μ圖像的ImageJ(Rasband，1997-2012)來測 量。結(jié)果示出了具有SP2043膚（SEQIDNO: 1)的負(fù)載不顯著影響粒徑分布。在一些實(shí)施方 案中，負(fù)載約2%至5%膚的PLGA被用于本發(fā)明公開的方法。對于體內(nèi)使用，按質(zhì)量計(jì)5% SP2043膚（SEQIDNO: 1)相當(dāng)于在1μL注射的微米粒子溶液中的1μgSP2043膚（SEQ IDNO: 1)。負(fù)載2%和5%SP2043膚（SEQIDNO: 1)的微米粒子的ζ電勢（表面電荷）在 MalvernZetasizer(MalvernInstruments，有限責(zé)任公司，Malvern,Worcestershire,UK; 圖18B)上來測量。結(jié)果顯示，在對照（空白）和負(fù)載膚的微米粒子之間的表面電荷中無顯 著差異。
[0199]SP2043膚（SEQIDN0:1)的標(biāo)記的膚類似物從PLGA微米粒子的控釋經(jīng)六個月在 原位生理?xiàng)l件（PBS37°C下；圖19)下被觀察到。另外，沒有任何標(biāo)簽或修飾的SP2043膚 (SEQIDNO: 1)在PLGA微米粒子中在生理?xiàng)l件下的原位控釋也被觀察到（圖20)。
[0200] 圖21示出了，滲入按重量計(jì)2%的SP2043膚（SEQIDN0:1)(左）和按重量計(jì)5% 2043(右）的PLGA微米粒子的沈Μ成像。SP2043膚（SEQIDNO: 1)還可被包封進(jìn)納米粒 子且運(yùn)些粒子（微米或納米）可具有不同的非球形，諸如楠球形W及球形（圖22)。
[020。 包封SP2043膚（SEQIDN0:1)的PLGA85/15微米粒子在激光誘導(dǎo)小鼠模型中脈 絡(luò)膜新血管形成后的小鼠眼睛中引起消退（圖23)。另外，運(yùn)些微米粒子在激光誘導(dǎo)的濕性 AMD小鼠模型中隨時間抑制新血管形成（圖24)。包封2043的PLGA85/15微米粒子顯示在 單玻璃體內(nèi)注射后體內(nèi)效力持續(xù)至少3個月。
[0202] 包含SP2043膚（SEQIDNO: 1)的PLGA65/35微米粒子在激光誘導(dǎo)的濕性AMD小 鼠模型中隨時間抑制新血管形成（圖25)。新血管形成被SP2043膚（SEQIDNO: 1)的抑制 還見于兔模型中（圖26)。
[020引 圖27示出了在rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠中的包封SP2043膚（SEQIDNO: 1)的PLGA(85/15)。圖28示出了SP2043膚（SEQIDNO: 1)可與其他抗血管生成劑，諸如阿柏西 普組合使用，W增加效應(yīng)，如在小鼠激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形成模型中所見。
[0204] 可將聚合物諸如PBAE添加至SP2043W將其自組裝成約lOOnm納米粒子（圖29)。 發(fā)現(xiàn)當(dāng)SP2043膚（SEQIDNO: 1)與聚合物一起自組裝時，粒徑和納米粒子濃度更大；圖30 示出了包封SP2043膚（SEQIDN0:1)的PLGA和PLGA-PEG納米粒子的效應(yīng)。
[0205] 全身靜脈注射的包含SP2043膚（SEQIDN0:1)的納米粒子或游離膚積累在腫瘤 W及其他器官中（圖31)。
[0206] 用于定量SP2043膚（SEQIDN0:1)的方法包括電泳和用SimplyBlue染色（圖 32,圖A)隨后是質(zhì)譜（圖32,圖B)。
[0207] 實(shí)施例4
[020引 討論
[0209] 本發(fā)明公開的主題提供了模擬膚，所述模擬膚可用于不同形式的癌癥，眼部疾病， 諸如年齡相關(guān)性黃斑變性，和其他血管生成依賴性疾病和淋己管生成依賴性疾病。特別地， 活性模擬膚SP2043(SEQIDN0:1)在體外血管生成和淋己管生成測定中被測試。更具體 地，SP2043膚（SEQIDN0:1)顯示在血液內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、附著和管形成測定中的抗血 管生成活性，W及在乳腺癌異種移植物模型和年齡相關(guān)性黃斑變性模型中的體內(nèi)抗血管生 成活性和抗腫瘤發(fā)生活性。SP2043膚（SEQIDNO: 1)還具有抗淋己管生成特性。另外，顯 示了SP2043膚（SEQIDN0:1)可被配制于和用于微米粒子或納米粒子。
[0210] 參考文獻(xiàn)
[0211] 在說明書中提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)表示本發(fā)明公開 的主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)在此通過 引用并入，其程度如同每個單獨(dú)出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)被具體和單獨(dú)指明 通過引用并入的相同程度。將理解，盡管一些專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)在本文中被提 及，這樣的參考文獻(xiàn)并不構(gòu)成任何這些文件形成本領(lǐng)域公知常識的部分的承認(rèn)。
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