一種提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助 制劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感(Avian influenza,Al)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引 起的呼吸道傳染病，對人類健康和世界經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影響。由H5和H7亞型禽流感病毒引起 的高致病性禽流感化ighly pathogenic avian influenza,HPAI)，一旦爆發(fā)，往往造成家 禽的大量死亡。更為嚴(yán)重的是，隨著病毒的進(jìn)化，冊Nl亞型禽流感病毒已經(jīng)突破了禽類與哺 乳動物的種間屏障，可直接感染人。從2003年開始高致病性H5N1成為主要的人獸共患病之 一并且不斷的衍生出新的譜系，因此有效防控冊Nl亞型禽流感不僅能夠挽回大量的經(jīng)濟(jì)損 失，而且具有重要的公共衛(wèi)生意義。當(dāng)前冊亞型禽流感的防控主要依賴全病毒滅活苗，通過 強(qiáng)制接種滅活苗，我國在冊Nl HPAI防控方面取得了不錯的效果。但是近年來H5N1 AIV變異 日趨頻繁，滅活苗保護(hù)力特異性強(qiáng)，對異源毒株或者變異毒株的保護(hù)力不足，在臨床上常造 成免疫失敗的現(xiàn)象，因此，需要不斷地更換疫苗毒株來應(yīng)對AIV的變異。近年來，中國政府陸 續(xù)推出了 一系列H5N1 腫AI 滅活疫苗，包括Re-I (CladeO)，Re-4 ( C lade7)，Re-5 (clade2.3.4)，Re-6(clade2.3.2.1)，Re-7(clade7.2)，病毒變異的速度不斷加快，給冊 NI HPAI的防控帶來了巨大壓力。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)流感病毒保守的抗原表位主要集中在血凝素蛋白莖區(qū)HA2、基質(zhì)蛋白M2、 核蛋白NP,病毒不同蛋白化A、M、NP)多個表位(B、T細(xì)胞表位)的結(jié)合能夠誘導(dǎo)交叉保護(hù)性免 疫。Palese等證明HA2的第76-106氨基酸為單克隆抗體12D1的作用祀點，12D1可提供一定程 度交叉保護(hù)，人工合成76-130位氨基酸，制成膚苗，輔WKLH佐劑，免疫后攻毒有較高異源保 護(hù);Townsend等證明NP蛋白第55-69個氨基酸為CD4輔助性T細(xì)胞表位，在所有禽流感病毒中 高度保守;Arnon等發(fā)現(xiàn)NP第380-393氨基酸為CTL表位，人工合成基因，與鞭毛蛋白融合表 達(dá)，體外制備亞單位疫苗，免疫小鼠后用高致病性H5N1禽流感病毒攻擊，可提供一定程度的 保護(hù);流感病毒基質(zhì)蛋白M2的氨基酸序列高度保守，其胞外域的24個氨基酸(M2e)在禽流感 病毒中幾乎完全相同，研究表明，M2e含有M2的主要保護(hù)性抗原決定簇，其作為抗原可W誘 導(dǎo)免疫保護(hù)，并且具有一定程度的交叉保護(hù)力。
[0004] 針對當(dāng)前禽流感防控面臨的問題，亟需一種提高禽流感滅火疫苗異源保護(hù)力的輔 助制劑，彌補(bǔ)了禽流感滅活疫苗對異源毒株或變異毒株異源保護(hù)力不足的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種提高禽流感 滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑。本發(fā)明的輔助制劑W桿狀病毒為載體，可提高H5N1亞型 滅活疫苗對異源毒株的保護(hù)力，制備簡單，便于大批量生產(chǎn);所述的輔助制劑提高禽流感滅 活疫苗的異源保護(hù)效力，減少滅活疫苗的更換頻率。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述輔助制劑的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述輔助制劑的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔 助制劑，包括重組修飾的昆蟲桿狀病毒，所述的昆蟲桿狀病毒能夠表達(dá)禽流感病毒保守抗 原表位。
[0009] 所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒血凝素蛋白莖區(qū)HA2的76-130位 氨基酸(HA2 76-130)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒基質(zhì)蛋白M2胞外域(M2e)的24個 氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011] 所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒核蛋白NP的第55-69(NP55-69) 位氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0012] 所述的禽流感病毒保守抗原表位包括禽流感病毒核蛋白NP的第380-393(NP380-393)位氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0013] 所述的禽流感病毒基質(zhì)蛋白M2胞外域(M2e)24個氨基酸殘基優(yōu)選為具有S個拷貝 的串聯(lián)重復(fù)。
[0014] 所述的禽流感病毒保守抗原分子還包括柔性連接分子linker,所述的柔性連接分 子實現(xiàn)對HA2 76-130、3126、肥55-69、肥380-393氨基酸殘基的連接，所述的柔性連接分子 的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0015] 所述的禽流感病毒保守抗原的核巧酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0016] 所述的重組修飾的昆蟲桿狀病毒的基因組中插入增強(qiáng)型雙啟動子基因盒，所述雙 啟動子基因盒自上游至下游包括如下組件：多角體蛋白（PoIyhe化on，PH)啟動子，巨細(xì)胞病 毒早期增強(qiáng)子（the巧tomegalovirus early enhancer),血凝素蛋白莖區(qū)HA2的76-130位 氨基酸編碼基因，3個拷貝的M2e編碼基因，核蛋白NP的第55-69位氨基酸編碼基因，核蛋白 NP的第380-393位氨基酸編碼基因。
[0017] 所述的重組修飾的昆蟲桿狀病毒的構(gòu)建所用的出發(fā)載體為pFastBac? Dual-WPRE，所述出發(fā)載體的PH啟動子下游含有±撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控原件（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element,WPRE)。
[0018] 所述的桿狀病毒為首猜丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。
[0019] 所述的重組修飾的昆蟲桿狀病毒命名為重組桿狀病毒
[0020] 上述的W桿狀病毒為載體的禽流感疫苗輔助制劑的制備方法，包括W下步驟:首 先通過人工合成HA2 76-130、3M2e、NP55-69、NP380-393氨基酸殘基通過linker連接的編碼 基因（核巧酸序列信息如SEQ ID N0:6所示），插入PCDNA3.U + )的CMV啟動子后，獲得重組質(zhì) 粒pcDNA-HMNN;然后將包含CMV-HMN的基因片段插入到Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 改造的pFastBac?Dual-WPRE轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的PH啟動子后面，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-CMV-HMNN-WPRE ;將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac大腸桿菌，通過轉(zhuǎn)座重組，獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒 Bacmid-HMNN-WPRE;最后用脂質(zhì)體法將Bacmid-HMNN-WPRE轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞從而獲得重組 桿狀病毒BV-HMNN，即獲得W桿狀病毒為載體的禽流感滅活疫苗輔助制劑。
[0021] 上述的輔助制劑在制備禽流感滅活疫苗中應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明所述的提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑W桿狀病毒為載體，表 達(dá)了 4個冊NlAIV高度保守的且能誘導(dǎo)交叉保護(hù)力的抗原表位，即血凝素蛋白莖區(qū)HA2的76-130位氨基酸編碼基因，3個拷貝的M2e編碼基因，核蛋白NP的第55-69位氨基酸編碼基因，核 蛋白NP的第380-393位氨基酸編碼基因，配合禽流感滅活疫苗使用，可W減少攻毒后雞群的 排毒量，提高存活率，抵抗異源毒株的攻擊，彌補(bǔ)了禽流感滅活疫苗對異源毒株或變異毒株 異源保護(hù)力不足的缺陷。W上內(nèi)容為研制禽流感滅活疫苗輔助制劑的研究提供了新的思 路。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點：
[0024] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)禽流感滅活苗在應(yīng)對異源保護(hù)方面的不足，提供一種 提高禽流感滅活疫苗異源保護(hù)力的輔助制劑，所述的輔助制劑W桿狀病毒為載體的禽流感 滅活疫苗輔助制劑，本發(fā)明的疫苗輔助制劑可提高H5N1禽流感滅活疫苗對異源毒株的保護(hù) 力，制備簡單，便于大批量生產(chǎn)。本發(fā)明選擇禽流感病毒高度保守的表位作為抗原，W昆蟲 桿狀病毒作為載體，制備了經(jīng)肌肉注射免疫的禽流感滅活疫苗輔助制劑，該輔助制劑具有 W下特點：（1)能夠進(jìn)入動物細(xì)胞介導(dǎo)抗原表達(dá)，具有核酸疫苗的特點；（2)與禽流感滅活疫 苗聯(lián)合使用后，在應(yīng)對異