專利名稱：一種溶菌酶制劑、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶學(xué)和藥物制劑學(xué)領(lǐng)域，涉及一種溶菌酶制劑、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
近年來，大量的眼科藥物制劑的臨床數(shù)據(jù)和研究資料表明，在眼部疾病的治療過程中產(chǎn)生的副作用或不良反應(yīng)有很多時(shí)候都是由于抑菌劑造成的。例如，眼部手術(shù)后使用藥物進(jìn)行術(shù)后治療時(shí)，由于抑菌劑的影響而造成的角膜上皮細(xì)胞脫落等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。并且，隨著電腦、空調(diào)等的普及，干眼癥患者人群也在不斷增加，這類患者的治療往往需要長期輔以人工淚液，而化學(xué)抑菌劑的長期使用會(huì)造成不同程度的角膜損傷。因此，眼用制劑中的抑菌劑帶來的副作用已成為社會(huì)普遍關(guān)注的問題，也是目前全球眼科藥物開發(fā)研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中采用多種方法來避免抑菌劑對眼部帶來的傷害，如制成不含抑菌劑的眼科單劑量產(chǎn)品:如日本參天公司的可樂必妥滴眼液；也可以使用除菌的眼用制劑容器如:日本點(diǎn)眼劑研究所開發(fā)的烏諾前列酮異丙酯滴眼液。但這些包裝方面的改善并不能保證完全無菌，且成本高，對于長期使用的人群來說，無疑會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。也有人嘗試過在喹諾酮類滴眼液中不加抑菌劑，直接依靠藥物的抗菌作用維持制劑的無菌狀態(tài)。但由于喹諾酮類藥物的抗菌譜及抑菌效力有限，其抑菌效果也不盡理想，不具備普遍應(yīng)用性。溶菌酶(Lysozyme)是分子量為14.4kDa 的酶類，1922 年 Alexander Fleming 在尋找抗生素的過程中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶。作為人體自身的抗感染天然屏障之一，它能夠通過催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡萄糖殘基間和殼糊精中N-乙酰葡糖胺殘基間的1，4-β鏈的水解，而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，達(dá)到殺死細(xì)菌的目的，因此可以作為抑菌劑，已經(jīng)在食物領(lǐng)域中得到應(yīng)用。溶菌酶作為酶類具高效性，其抗菌活性為同類化學(xué)物質(zhì)的幾十倍甚至上千倍；且作為人體固有活性物質(zhì)，對人體無任何副作用，可應(yīng)用于各類人群。除此之外，溶菌酶成本低廉、獲取途經(jīng)多、來源廣闊，在蛋清、乳汁中都含有大量的溶菌酶，特別是近年來隨著克隆技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得微生物提取溶菌酶也成為溶菌酶大量生產(chǎn)的一大途徑。然而，溶菌酶在水中的穩(wěn)定性較差，不能長時(shí)間保存。并且眼用制劑大多是水溶性制劑，因此溶菌酶應(yīng)用于眼用制劑受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，獲得了一種溶菌酶制劑。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該溶菌酶制劑能夠用于眼用制劑，并且溶菌酶在本發(fā)明的體系(包括合適的PH和穩(wěn)定劑鹽類濃度)中能夠保持良好的穩(wěn)定性。由此提供了下述發(fā)明:本發(fā)明者綜合以上問題，尋找到一種對眼部安全、無刺激且高效的抑菌劑一溶菌酶，該抑菌劑可適用于各類人群，且成本低廉。溶菌酶作為一種眼用制劑的抑菌劑用量范圍為 0.001%-25% (w/w)，優(yōu)選范圍為 0.01%-20% (w/w)，更優(yōu)選為 0.1 %-15% (w/w)；進(jìn)一步優(yōu)選為0.3% -10% (w/w)，特別優(yōu)選為0.5% -5% (w/w)。且在與其他抑菌劑聯(lián)合使用，可以使兩種抑菌劑的濃度同時(shí)降低，用量減小，降低其他抑菌劑對眼表的損害。
過去雖有人考慮到以其作為眼用制劑的抑菌劑，但由于其在水溶液中的穩(wěn)定性不佳，使得溶菌酶在此方面的應(yīng)用未能得到發(fā)展。為保證溶菌酶的穩(wěn)定性，發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)，處理溶菌酶原料，使獲得的精制溶菌酶可在水溶液中保持3-5年穩(wěn)定，攻克了這個(gè)難題。處理工藝如下:
I)將溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液；
2)向步驟I)中的溶菌酶溶液中加入穩(wěn)定劑鹽類；
3)調(diào)節(jié) pH 至 4.6-9.0。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，還包括步驟4)靜置，使溶菌酶與穩(wěn)定劑鹽類充分接觸后過濾；
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，還包括5)加入吸附性物質(zhì)對溶液中的雜質(zhì)進(jìn)行吸附，獲得澄清透明的溶液，吸附后過濾除去吸附性物質(zhì)后備用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，還包括6)得到的溶液可采用冷凍干燥、噴霧干燥等方式，使其以固體形式保存以備制劑用；亦可調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)后，收集固體，采用真空干燥等方式，收集固體；亦可以液體形式加入其他藥物、滲透壓調(diào)節(jié)劑、保濕增稠劑等原輔料直接投料制成眼用制劑，例如滴眼液、眼膏劑、眼用凝膠劑、眼用固體制劑等劑型。
下面是對上述工藝的詳細(xì)解釋:
發(fā)明中所涉及到的眼用制劑的劑型可以為滴眼液、眼膏劑、眼用凝膠劑、眼用固體制劑等眼科常用的液體、半固體、固體劑型。
發(fā)明中所涉及到的pH值調(diào)節(jié)劑，以調(diào)節(jié)注射用水的pH值，此時(shí)用到物質(zhì)可以為稀鹽酸、醋酸、氫氧化鈉等常用的酸堿調(diào)節(jié)劑，亦可以是一些具有酸堿度調(diào)節(jié)功能的鹽類，如枸櫞酸、硼酸，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，pH值是眼用制劑中非常重要的技術(shù)控制指標(biāo)，關(guān)系到本發(fā)明所述眼用制 劑的穩(wěn)定性、有效性及眼刺激性。此外，PH值對于蛋白質(zhì)亦是一個(gè)重要的控制指標(biāo)，眾所周知，蛋白質(zhì)具有一個(gè)特性指標(biāo)——等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的水溶液PH值離等電點(diǎn)越近，其在水溶液中的穩(wěn)定性越差，相反越遠(yuǎn)則越穩(wěn)定。且蛋白質(zhì)容易在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中發(fā)生不可逆的變性反應(yīng)，也就是我們通常所說的蛋白質(zhì)變質(zhì)。溶菌酶作為一種蛋白類的酶，同樣具有蛋白質(zhì)的共同性質(zhì)。
本發(fā)明為含有溶菌酶的眼用制劑，在制備過程中需同時(shí)兼顧溶菌酶與眼用制劑的特點(diǎn)，因此pH值的控制在本品中可以說是關(guān)鍵中的關(guān)鍵。
在以往溶菌酶純化的過程中，pH值均在4.6以下，其主要原因是在保證溶菌酶穩(wěn)定的前提下，提高溶菌酶的收率。但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在此PH值條件下，得到的溶菌酶制劑對人眼刺激過強(qiáng)，但將PH值增大后，其穩(wěn)定性又降低。本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶液pH值、鹽濃度及處理溶菌酶濃度在溶菌酶原料處理過程中至關(guān)重要，通過精密控制這三項(xiàng)參數(shù)值可實(shí)現(xiàn)在與人體接近的PH值下，獲得更為穩(wěn)定的溶菌酶溶液，且可將溶菌酶在處理過程中得到更高的收率。通過一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)明者將含溶菌酶的眼用制劑處理過程中的PH值控制在4.6-10.0間有利于提高溶菌酶的穩(wěn)定性，優(yōu)選為4.7-9.0 ;更優(yōu)選為4.8-8.5 ;特別優(yōu)選為5.0-8.0 ;進(jìn)一步優(yōu)選為5.0-7.0 ;更進(jìn)一步優(yōu)選為5.5-6.5，例如5.5,5.6,5.7,5.8、5.9、6.0、6.I>6.2、6.3、6.4、或 6.5。
本發(fā)明中所涉及的穩(wěn)定劑，多為鹽類，包括但不限于碳酸鈉、碳酸氫鈉、枸櫞酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣等中的一種或多種鹽類，優(yōu)選為選自硼酸、硼砂、枸櫞酸鈉、以及磷酸氫二鉀中的任一種或者多種。不拘于理論的限制，硼酸、硼砂、枸櫞酸鈉、以及磷酸氫二鉀同時(shí)兼具PH調(diào)節(jié)的作用。不拘于理論的限制，溶菌酶可能會(huì)與一些鹽作用產(chǎn)生沉淀，或者是溶菌酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致溶菌酶活性和/或穩(wěn)定性的改變。不拘于理論的限制，上述穩(wěn)定劑鹽類兼具兩種功效:其一為調(diào)節(jié)溶液滲透壓，保證眼用制劑與淚液的滲透壓相同而減少眼刺激。另一作用為，鹽類的存在可以驅(qū)使溶菌酶的構(gòu)型中同性電荷的分子以斥力在溶液中保持穩(wěn)定，而異性電荷的分子則會(huì)相互聚集而沉淀，從溶液中分離。鹽類的存在可有效的除去溶液中的不穩(wěn)定因素，從而保證溶菌酶穩(wěn)定性。本發(fā)明通過大量試驗(yàn)獲得穩(wěn)定劑的以上作用機(jī)理，打破以往普遍使用的氯化鈉等鹽類的單純局限，得到了更適合溶菌酶的穩(wěn)定劑鹽類，并且增加了穩(wěn)定劑鹽類的種類，使制劑的制備組方上更為多樣化。
發(fā)明人在對比處理與未處理過溶菌酶原料的活性時(shí)，驚奇地發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定劑鹽類的加入可以保持或增強(qiáng)溶菌酶原料的活性。有些鹽類甚至可以直接用于調(diào)節(jié)溶液的PH值，可作為之后所制備制劑中緩沖鹽。
在上述發(fā)明中已提及，本品是通過控制pH值、穩(wěn)定劑鹽濃度、溶菌酶濃度三個(gè)指標(biāo)來對溶菌酶濃溶液進(jìn)行處理，而得到穩(wěn)定的含有溶菌酶的眼用制劑。因此在本發(fā)明中，鹽類的用量亦是很重要的控制指標(biāo)之一。鹽的量通常在0.001%-30% (w/w)之間；優(yōu)選為0.01 % -25% (w/w),更優(yōu)選為 0.1% -2 0% (w/w);特別優(yōu)選為 1% -20% (w/w),進(jìn)一步優(yōu)選為 3% -15% (w/w)，例如 3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,或 15% (w/w)。
上述發(fā)明中所涉及的靜置是為保證在特定的pH值下，鹽類物質(zhì)與溶菌酶充分接觸而設(shè)計(jì)的，充分的接觸有利于更好的沉淀異性電荷，排除不穩(wěn)定性因素，使獲得的溶菌酶更加穩(wěn)定。靜置通常在0°C-40°C環(huán)境下(例如室溫或者常溫)進(jìn)行，靜置的時(shí)間在為不小于2小時(shí)，例如2-48小時(shí)。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，鹽析雖可以保證溶菌酶在一定時(shí)間的穩(wěn)定性，但是在長時(shí)間的儲(chǔ)存過程中，含溶菌酶的滴眼液仍會(huì)出現(xiàn)少量的析出物。經(jīng)發(fā)明人進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在上述鹽析過程的基礎(chǔ)上加上吸附沉降的過程，可以使得溶菌酶更加穩(wěn)定的存在于溶液體系中。
上述發(fā)明中所涉及的吸附性物質(zhì)，目的在于保證液體中的溶菌酶以最穩(wěn)定的構(gòu)型或者空間構(gòu)象存在。不拘于理論的限制作為蛋白質(zhì)，溶菌酶在水中會(huì)以各種構(gòu)型存在，而各種構(gòu)型之間會(huì)互相轉(zhuǎn)變。曾經(jīng)有人對其各種構(gòu)型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溶菌酶在水溶液中大部分都是表面帶負(fù)電的，而其帶正電為少量，正是由于這種正電構(gòu)型的分子對帶有異性電荷(負(fù)電)的分子具有一定的吸引力，從而造成蛋白質(zhì)聚集。因此，本發(fā)明者采用一些帶有負(fù)電的吸附劑，對溶液中的不穩(wěn)定因素進(jìn)行吸附，以使其溶液穩(wěn)定性增加。本發(fā)明中采用的吸附劑包括活性炭、硅藻土、膨潤土等。使用量為0.001%-10% (w/w)之間；優(yōu)選為0.01-8%;更優(yōu)選為 0.1% -6%。吸附的溫度為(TC -80°C;優(yōu)選為 5°C -75°C、10°C -70°C >20°C -65°C、或 30°C -60°C。吸附時(shí)間一般為 5min-48h ;優(yōu)選為 10min_36h、15min-24h、20min_12h、25min_6h、或 30min_2ho處理工藝中涉及到兩次過濾，此過濾可以為單層濾紙、濾膜的簡單過濾，亦可以為深層過濾，如砂濾棒、石英砂板、鈦棒、用于深層過濾的紙板以及適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的濾芯過濾等過濾方式。處理后的溶菌酶，可直接以液體形式進(jìn)行投料；亦可借助冷凍干燥等干燥技術(shù)，或者借助氫氧化鈉等堿性水溶液等物質(zhì)將其PH值調(diào)節(jié)至溶菌酶等電點(diǎn)附近，使其大量析出后，過濾干燥，以固體狀態(tài)使用。以上兩種狀態(tài)均可直接作為抑菌劑使用。如采用冷凍干燥工藝處理得到溶液，其凍干條件:將處理后到的溶液放入低溫冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍的溫度在_80°C -70°C間，通常預(yù)凍8-12小時(shí)后，取出迅速放入已降溫的冷阱中，冷阱的初始溫度在_50°C _30°C間，抽真空Ih后，緩慢升溫至-25°C _20°C后，繼續(xù)抽真空10h，待水分基本完全升華后轉(zhuǎn)入次級凍干，次級凍干過程中，將溫度升至10°C后，保溫5h左右，直至次級凍干結(jié)束。如采用噴霧干燥條件:加料速度通常在1.0-3.0ml/min，進(jìn)口氣流溫度通常為1050C _120°C，出口氣流溫度在 600C _80°C，噴頭壓力在 1.0-1.2kg/cm2。亦可采用氫氧化鈉水溶液等堿性溶液調(diào)節(jié)其pH至等電點(diǎn)，收集固體后，采用25 0C -40 V，真空干燥24h左右，至其完全干燥后，收集得到的固體粉末。本發(fā)明還涉及如下的(1)-(12)項(xiàng)中的任一項(xiàng):1.一種溶菌酶制劑的制備方法，包括下述步驟:
I)將溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液；2)向步驟I)中的溶菌酶溶液中加入穩(wěn)定劑鹽類；3)調(diào)節(jié) pH 至 4.6-9.0。2.根據(jù)第I項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶菌酶溶液中溶菌酶的濃度為0.001 % -50 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或0.5% -5% (w/w)。3.根據(jù)第I項(xiàng)所述的方法，其中，所述穩(wěn)定劑鹽類選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、枸櫞酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、以及氯化鈣中的一種或多種；優(yōu)選自硼酸、硼砂、枸櫞酸鈉、以及磷酸氫二鉀中的一種或多種。4.根據(jù)第 I 項(xiàng)所述的方法，其中，所述 pH 為 4.7-9.0,4.8-8.5,5.0-8.0,5.0-7.0、或 5.5-6.5。5.根據(jù)第I項(xiàng)所述的方法，其還包括下述步驟:4)靜置，使溶菌酶與穩(wěn)定劑鹽類充分接觸后過濾，得到濾液；優(yōu)選地，所述靜置在0°C -40°C環(huán)境下進(jìn)行，靜置時(shí)間為2-48小時(shí)之間。6.根據(jù)第I項(xiàng)所述的方法，其還包括下述步驟:5)加入帶負(fù)電的吸附劑對濾液中的雜質(zhì)進(jìn)行吸附，獲得澄清透明的溶液，然后過濾除去吸附性物質(zhì)；優(yōu)選地，所述吸附劑選自活性炭、硅藻土、和膨潤土中的一種或多種。7.根據(jù)第I項(xiàng)所述的方法，其中，所述吸附劑的使用量為0.001%-10% (w/w)，吸附時(shí)間為5min_48h。8.根據(jù)第I至7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括下述步驟:
將溶菌酶制劑溶液制成溶菌酶制劑固體粉末；具體地，使用冷凍干燥或者噴霧干燥制得溶菌酶制劑固體粉末。9.第I至8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法制得的溶菌酶制劑。10.第9項(xiàng)所述的溶菌酶制劑在制備眼用制劑中的用途；具體地，所述眼用制劑為滴眼液、眼膏劑、眼用凝膠劑、或眼用固體制劑。11.根據(jù)第10項(xiàng)所述的用途，其中，所述眼用制劑中的溶菌酶的含量為.0.001 % -25 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或.0.5% -5% (w/w)。12.第9項(xiàng)所述的溶菌酶制劑作為抑菌劑和/或防腐劑的用途；具體地，所述用途為第9項(xiàng)所述的溶菌酶制劑作為眼藥制劑的抑菌劑和/或防腐劑的用途。發(fā)明的有益效果溶菌酶為人體本身所固有，在淚液中作為一種抵御外界細(xì)菌等有害物質(zhì)侵襲的天然抗菌物質(zhì)，因此，對人體無任何危害，可以保證在長期使用的情況下對眼表無損傷，是一種理想抑菌劑。且作為天然抑菌劑，劑量的增大不會(huì)對人體產(chǎn)生任何副作用，因此為了加強(qiáng)抑菌效力可適當(dāng)增大劑量，使獲得的眼用制劑在達(dá)到良好穩(wěn)定性的同時(shí)保證絕對的安全性。且與化學(xué)抑菌劑組成復(fù)合抑菌劑，可使化學(xué)抑菌劑用量降低至對人體損害較小的用量，而不降低整體防腐效力。發(fā)明人解決了溶菌酶在溶液中穩(wěn)定性問題，從而擴(kuò)展了溶菌酶作為抑菌劑的使用范圍。在國內(nèi)乃至全球范圍內(nèi)首次將溶菌酶作為眼科抑菌劑應(yīng)用于眼科藥物制劑中。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1:溶菌酶制劑的制備(1)取0.5g溶菌酶原料加入注射用水IOOg中，攪拌溶解，待全部溶解后備用；(2)向其中加入磷酸二氫鈉16g，使用lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)注射用水的pH值至5.0±0.2 ；(3) 20°C靜置48h，混合纖維素膜過濾；(4)加入活性炭0.02g，70°C吸附20min，布氏漏斗過濾除去活性炭，將得到的溶液。(5)將處理后的到的溶液放入低溫冰箱中，-70°C預(yù)凍，通常預(yù)凍8h后，取出迅速放入已降溫的冷井中，冷井的初始溫度在_40°C間，抽真空Ih后，緩慢升溫至-20°C后，繼續(xù)抽真空10h，待水分基本完全升華后轉(zhuǎn)入次級凍干，將溫度升至10°C后，保溫5h左右，冷凍干燥后得到溶菌酶制劑。實(shí)施例2:溶菌酶制劑的制備(1)取硼酸6.2g，硼砂0.029g加入注射用水IOOg中，攪拌溶解，待全部溶解后備用；
(2)向其中加入2.5g溶菌酶原料，使其pH值至6.3±0.3 ;
(3) 4°C冷藏靜置2h，垂融漏斗過濾；
(4)加入膨潤土 2g，80°C吸附5min，砂濾棒過濾除去膨潤土，得到處理后的溶菌酶制劑備用。
實(shí)施例3:溶菌酶制劑的制備
(I)取硫酸鈉4.0g加入注射用水IOOg中，攪拌溶解，待全部溶解后備用；
(2)向其中加入5.0g溶菌酶原料，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0±0.2 ;
(3)室溫(25 °C )靜置6h，砂濾棒過濾；
(4)加入活性炭l0.0g，室溫(25°C )吸附24h，砂濾棒過濾除去活性炭后，10%氫氧化鈉濃溶液調(diào)節(jié)PH值至10.8±0.3，等電點(diǎn)沉降溶菌酶固體，過濾收集固體，在30°C下，真空干燥24h即得溶菌酶制劑。
實(shí)施例4:溶菌酶制劑的制備
(I)取20.0g溶菌酶原料加入注射用水50g中，攪拌溶解，待全部溶解后備用；
(2)向其中加入檸檬酸鈉0.2g，使其pH值至5.5±0.2 ；
(3) I (TC靜置12h，深層過濾紙板過濾；
(4)加入硅藻土 2.0g, 10°C吸附48h，砂濾棒過濾除去硅藻土后，得到溶菌酶制劑備用。
實(shí)施例5:溶菌酶制 劑的制備
(I)取10.0g溶菌酶原料加入注射用水IOOg中，攪拌溶解，待全部溶解后備用；
(2)向其中加入氯化鈉5.0g，三乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至7.5±0.3 ；
(3) 8°C靜置24h，濾芯過濾；
(4)加入活性炭5.0g，25°C吸附12h，砂濾棒過濾除去活性炭后，進(jìn)行噴霧干燥。
(5)噴霧干燥的加料速度為1.0ml/min，進(jìn)口氣流溫度通常為120°C，出口氣流溫度在60°C，噴頭壓力在1.2kg/cm2，干燥后得溶菌酶制劑。
注:上述實(shí)施例1-5中所使用的溶菌酶原料為溶菌酶的純品或基本上為純品(可視為純品)，其中溶菌酶的含量約為I萬U/mg。
實(shí)施例6-1:以溶菌酶制劑做為抑菌劑的聚乙烯醇滴眼液
I)處方:
聚乙烯醇1.4g硼酸1.24g硼砂0.057g甘油2.4g溶菌酶制劑40.0ml(約相當(dāng)于1000萬U)蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取70°C -80°C的注射用水適量，加入聚乙烯醇，攪勻，使其充分溶脹后，備用。
(2)取適量注射用水，依次加入硼酸、硼砂、甘油，攪拌使其溶解后備用。(3)取實(shí)施例2制備的溶菌酶制劑加入(2)中，待全部溶解后備用。(4)將已溶脹好的聚乙烯醇加入上述溶液中，補(bǔ)水至全量，攪勻即得。實(shí)施例6-2:以羥苯乙酯作為抑菌劑的聚乙烯醇滴眼液I)處方:
聚乙烯醇1.4g
硼酸1.24g
硼砂0.057g
甘油2.4g
羥苯乙酯0.05g
蒸餾水至100.0ml2)工藝:(I)取70°C -80°C的注射用水適量，加入聚乙烯醇，攪勻，使其充分溶脹后，備用。(2)取適量注射用水，依次加入硼酸、硼砂、甘油，攪拌使其溶解后備用。(3)取羥苯乙酯加入⑵中，待全部溶解后備用。(4)將已溶脹好的聚乙烯醇加入上述溶液中，補(bǔ)水至全量，攪勻即得。實(shí)施例7-1:以溶菌酶制劑為抑菌劑的復(fù)方門冬維甘滴眼液I)處方:
鹽酸萘?xí)踹蛄?.003g
甲疏酸新斯的明0.005g
馬來酸氯苯那敏0.0lg
門冬氨酸鉀1.0g
甘草酸二鉀0.1g
氯化鈉0.7g
溶菌酶制劑12ml (約相當(dāng)于300萬U)
蒸餾水至100.0ml2)工藝:(I)取80g左右注射用水，依次加入鹽酸萘甲唑林、甲硫酸新斯的明、馬來酸氯苯那敏、門冬氨酸鉀、甘草酸二鉀溶解后，加入氯化鈉溶解。(2)向上述溶液中加入實(shí)施例2制備的溶菌酶制劑，溶解后，補(bǔ)充注射用水至100ml,即得。實(shí)施例7-2:以未處理溶菌酶為抑菌劑的復(fù)方門冬維甘滴眼液
I)處方:
鹽酸萘?xí)踹蛄?.003g甲硫酸新斯的明0.005g馬來酸氯苯那敏0.0lg門冬氨酸鉀1.0g甘草酸二鉀0.1g 風(fēng)化納0.7g 溶菌酶 0.3g(約相當(dāng)于300萬U)蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取80g左右注射用水，依次加入鹽酸萘甲唑林、甲硫酸新斯的明、馬來酸氯苯那敏、門冬氨酸鉀、甘草酸二鉀溶解后，加入氯化鈉溶解。
(2)向上述溶液中加入未處理溶菌酶粉末溶解后，補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。
除應(yīng)用于溶液型滴眼液外，眼用混懸劑、乳劑中亦可采用溶菌酶作為防腐抑菌劑，以抑制溶液內(nèi)部微生物生長。具體由以下實(shí)施例3、實(shí)施例4加以說明。
實(shí)施例8-1:以溶菌酶制劑作為抑菌劑的復(fù)方硫酸新霉素混懸型滴眼液
I)處方:
疏酸新霉素0.5g醋酸潑尼松龍0.5g硫酸多黏菌素1，000，OOOIU羥丙甲纖維素0.5g磚酸二氫鈉0.4g 磚酸氫二鈉0.474g甘油1.3g溶菌酶制劑8_0g (約相當(dāng)于8000萬U)蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取適當(dāng)70°C -80°C注射用水，向其中加入羥丙甲纖維素后，攪拌均勻，使其溶脹完全；
(2)另取適當(dāng)注射用水向其中加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘油、實(shí)施例3制備的溶菌酶制劑，待全部溶解后加入硫酸新霉素、硫酸多黏菌素溶解后備用；
(3)將⑴加入⑵中攪拌混勻，備用；
(4)將醋酸潑尼松龍用少量上述溶液潤濕后研磨，使其分散均勻后，加入上述溶液中，攪拌混勻；(5)補(bǔ)充注射用水至100.0ml，攪勻即得。實(shí)施例8-2:以苯氧乙醇作為抑菌劑的復(fù)方硫酸新霉素混懸型滴眼液I)處方:
疏酸新霉素0.5g
醋酸潑尼松龍0.5g
硫酸多黏菌素1，000，OOOIU
羥丙甲纖維素0.5g
嶙酸二氫鈉0.4g
嶙酸氫二鈉0.474g
`甘油1.3g
苯氧乙醇0.1g
蒸餾水至100.0ml2)工藝:(I)取適當(dāng)70°C -80°C注射用水，向其中加入羥丙甲纖維素后，攪拌均勻，使其溶脹完全；(2)另取適當(dāng)注射用水向其中加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘油，苯氧乙醇，待全部溶解后加入硫酸新霉素、硫酸多黏菌素溶解后備用；(3)將(I)加入(2)中攪拌混勻，備用；(4)將醋酸潑尼松龍用少量上述溶液潤濕后研磨，使其分散均勻后，加入上述溶液中，攪拌混勻；(5)補(bǔ)充注射用水至100.0ml，攪勻即得。實(shí)施例9-1:以溶菌酶制劑為抑菌劑的維生素A眼用微乳I)處方:
維生素A1.0g
中鏈甘油酸酯0.3g
吐溫800.4g
依地酸二鈉0.0lg
BHA0.0lg
羥乙基纖維素0.02g
甘油1.3g
溶菌酶制劑22.5g (約相當(dāng)于15000萬U)
蒸餾水至100.0ml2)工藝:(1)取適當(dāng)50°C -60°C注射用水，向其中加入羥乙基纖維素后，攪拌均勻，使其溶脹完全；(2)取適量注射用水，向其中加入依地酸二鈉、實(shí)施例5制備的溶菌酶制劑、甘油、吐溫80溶解后,備用；(3)取處方量的中鏈甘油酸酯，向其中加入BHA溶解后，向其中加入維生素A混勻后，備用;(4)將(3)在攪拌下緩慢倒入(2)中，混合均勻后，補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。實(shí)施例9-2:以苯扎氯銨為抑菌劑的維牛素A眼用微乳I)處方:
維生素A1.0g
中鏈甘油酸醋0.3g
吐溫800.4g
依地酸二鈉0.0lg
BHA0.0lg
羥乙基纖維素0.02g
甘油1.Sg
苯扎氯銨0.1g
蒸鎦水至100.0ml2)工藝:(I)取適當(dāng)50°C -60°C注射用水，向其中加入羥乙基纖維素后，攪拌均勻，使其溶脹完全；(2)取適量注射用水，向其中加入依地酸二鈉、苯扎氯銨、甘油、吐溫80溶解后，備用；(3)取處方量的中鏈甘油酸酯，向其中加入BHA溶解后，向其中加入維生素A混勻后，備用;(4)將(3)在攪拌下緩慢倒入(2)中，混合均勻后，補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。溶菌酶除眼用液體制劑外，其亦可作為眼用半固體制劑如眼膏劑、眼用凝膠劑等劑型中的抑菌劑使用，以實(shí)驗(yàn)例3、5來進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例10-1:以溶菌酶制劑為抑菌劑的更昔洛韋眼用凝膠I)處方:更昔洛韋0.3g 黃原肢0.4g 卡波姆0.2g 甘油2.0g 三乙胺適量 依地酸二鈉0.0lg 硼砂0.36g 溶菌酶制劑 5.0g (約相當(dāng)于5000萬U) 蒸鎦水至IQQ.0ml
2)工藝:
(I)取適當(dāng)70°C -80°C注射用水，向其中加入羥丙甲纖維素、卡波姆后，攪拌均勻，使其溶脹完全；
(2)取適量注射用水，向其中依次加入甘油、更昔洛韋溶解后，另取少量稀鹽酸溶解實(shí)施例3制備的溶菌酶制劑，加入其中攪勻備用。
(3)將⑵加入⑴中攪拌均勻后，向其中加入適量的三乙胺，使其pH值至6.0-7.0范圍內(nèi)。加注射用水至IOOml后，攪勻即得。
實(shí)施例10-2:以硫柳汞為抑菌劑的更昔洛韋眼用凝膠
I)處方:
更昔洛韋0.Sg 黃原肢0.4g
卡波姆0.2g 甘油2.0g 三乙胺適量 依地酸二鈉0.0lg 硼砂0.36g 硫柳汞0.0 4g 蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取適當(dāng)70°C -80°C注射用水，向其中加入羥丙甲纖維素、卡波姆后，攪拌均勻，使其溶脹完全；
(2)取適量注射用水，向其中依次加入甘油、硫柳汞、更昔洛韋溶解后備用。
(3)將⑵加入⑴中攪拌均勻后，向其中加入適量的三乙胺，使其pH值至
6.0-7.0范圍內(nèi)。加注射用水水至IOOml后，攪勻即得。實(shí)施例11-1:以溶菌酶制劑為抑菌劑的鹽酸利多卡因眼用即型凝膠I)處方:
鹽酸利多卡因3.5g
海藻酸鈉1.0g
氯化鈉0.8g
溶菌酶制劑4.5g (約相當(dāng)于3000萬U)
蒸鎦水至100.0ml2)工藝:(I)取適量注射用水溶解海藻酸鈉后，備用。(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入并溶解氯化鈉、實(shí)施例5制備的溶菌酶制劑、鹽酸利多卡因后，將(I)加入其中攪拌均勻。(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。實(shí)施例11-2:以三氯叔丁醇為抑菌劑的鹽酸利多卡因眼用即型凝膠I)處方:
鹽酸利多卡因3.5g
海藻酸鈉1.0g
氯化鈉0.8g
三氯叔丁醇0.5g
蒸餾水至100.0ml2)工藝:(I)取適量注射用水溶解海藻酸鈉后，備用。(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入并溶解氯化鈉、三氯叔丁醇、鹽酸利多卡因后，將(I)加入其中攪拌均勻。(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。除此以外，溶菌酶還可以與其他抑菌劑共同使用作為復(fù)合抑菌劑，減小其他抑菌劑的用量的同時(shí)，不降低防腐效力，從而在保證制劑無菌的條件下，又可減小對眼部的傷害。具體通過實(shí)驗(yàn)例7加以詳細(xì)說明。

實(shí)施例12-1:溶菌酶制劑與苯扎氯銨組成復(fù)合抑菌劑制成的?；撬岬窝垡篒)處方:牛磺酸5.0g硼砂0.04g苯扎氯銨0.0Olg溶菌酶制劑4.0ml (約相當(dāng)于100萬U)蒸鎦水至100.0ml
2)工藝:
(I)取適量注射用水溶解苯扎氯銨后，全部溶解后備用。
(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入實(shí)施例1得到的溶菌酶制劑、牛磺酸溶解后，將(I)加入其中攪拌均勻。
(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。
實(shí)施例12-2:以苯扎氯銨單獨(dú)作為抑菌劑制成的?；撬岬窝垡?br> I)處方:
牛續(xù)酸5.0g硼砂0.04g苯扎氣按0.1g蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取適量注射用水溶解苯扎氯銨后，帶全部溶解后備用。
(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入硼砂、牛磺酸溶解后，將(I)加入其中攪拌均勻。
(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。
以上可見，在眼用液體制劑、半固體制劑中，均可以溶菌酶作為抑菌劑，除此以外，溶菌酶還可以在其他眼用制劑中作為抑菌劑使用，例如眼用固體制劑等，在此不加以一一說明。_5] 實(shí)施例13:溶菌酶制劑與羥苯乙酯組成復(fù)合抑菌劑制成的色甘酸鈉滴眼液
I)處方:
色甘酸納2.0g 磷酸二氫鈉0.48g嶙酸氫二鈉0.379g羥苯乙酯0.005g溶菌酶制劑0.2ml (約相當(dāng)于5萬U)蒸餾水至100.0ml
2)工藝:
(I)取適量注射用水溶解羥苯乙酯后，全部溶解后備用。(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、色甘酸鈉、實(shí)施例1制備的溶菌酶制劑溶解后，將(I)加入其中攪拌均勻。(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。實(shí)施例14:溶菌酶制劑作為抑菌劑制成的聚維酮滴眼液I)處方:
聚維酮5.0g
氯化鈉8.5g
溶菌酶制劑23.0g (約相當(dāng)于23000萬U)
蒸餾水至100.0ml
2)工藝:(I)取適量注射用水溶解聚維酮后,全部溶解后浸泡24h。(2)另取適當(dāng)注射用水，依次加入氯化鈉、實(shí)施例3制備的溶菌酶制劑溶解后，將
(I)加入其中攪拌均勻。(3)補(bǔ)充注射用水至100ml，即得。實(shí)施例15:眼用制劑和溶菌酶的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(I)1.實(shí)驗(yàn)樣品:在上述實(shí)施例7-1、7_2制成的樣品。2.實(shí)驗(yàn)方法:將7-1與7-2制成的樣品，灌裝于塑料滴眼劑瓶中。長期穩(wěn)定性考察在0、3、6、9、12、18、24、36個(gè)月取樣；加速考察在0、1、2、3、6個(gè)月取樣。檢測眼用制劑的性狀、可見異物、PH值、滲透壓以及溶菌酶含量。3.實(shí)驗(yàn)條件:長期穩(wěn)定性考察將樣品置于溫度為25°C ±2°C、相對濕度60% ±10%的條件下避
光考察。加速考察將樣品置于40°C ±2°C、相對濕度20% ±2%的條件下避光考察。4.溶菌酶含量測定方法:溶菌酶含量可以反應(yīng)溶菌酶活性，單位為U/ml。通常采用效價(jià)測定法對其含量進(jìn)行測定，方法如下:供試品溶液配制取本品1ml，置IOOml量瓶中，加磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉
10.4g，磷酸氫二鈉7.86g，依地酸二鈉0.37g，加水溶解使成為1000ml，調(diào)節(jié)pH值至6.2)稀釋至刻度，混合均勻。底物懸浮液的制備稱取溶酶小球菌10mg，加磷酸鹽緩沖液5滴，在研缽內(nèi)研磨3分鐘，再加磷酸鹽緩沖液適量，使總體積約IOOml,懸浮液于25±0.1°C時(shí),在450nm的波長處測得的吸收度為0.7±0.05 (臨用前配制)測定方法精密量取25±0.1°C的底物懸浮液3ml，置Icm比色池中，在450nm的波長處測定吸收度，作為零秒的讀數(shù)Atl，然后精密量取25±0.1°C的供試品溶液0.15ml，加至上述比色池中，迅速混勻，用秒表計(jì)時(shí)，至60秒時(shí)再測定吸收度A ;同時(shí)精密量取磷酸鹽緩沖液0.15ml，同法操作，作為空白試驗(yàn)，測得零秒的讀數(shù)Ac/及60秒的讀數(shù)A'。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶制劑的制備方法，包括下述步驟: 1)將溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液； 2)向步驟I)中的溶菌酶溶液中加入穩(wěn)定劑鹽類； 3)調(diào)節(jié)pH 至 4.6-9.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述溶菌酶溶液中溶菌酶的濃度為0.001 % -50 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或0.5% -5% (w/w)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述穩(wěn)定劑鹽類選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、枸櫞酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸二氫鉀、氯化鉀、以及氯化鈣中的一種或多種；優(yōu)選自硼酸、硼砂、枸櫞酸鈉、以及磷酸氫二鉀中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述pH為4.7-9.0,4.8-8.5,5.0-8.0,5.0-7.0、或 5.5-6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括下述步驟: 4)靜置，使溶菌酶與穩(wěn)定劑鹽類充分接觸后過濾，得到濾液；優(yōu)選地，所述靜置在0°C _40°C環(huán)境下進(jìn)行，靜置時(shí)間為2-48小時(shí)之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其還包括下述步驟: 5)加入帶負(fù)電的吸附劑對濾液中的雜質(zhì)進(jìn)行吸附，獲得澄清透明的溶液，然后過濾除去吸附性物質(zhì)；優(yōu)選地，所述吸附劑選自活性炭、硅藻土、和膨潤土中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述吸附劑的使用量為0.001%-10% (w/w)，吸附時(shí)間為5min_48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求 1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括下述步驟: 將溶菌酶制劑溶液制成溶菌酶制劑固體粉末；具體地，使用冷凍干燥或者噴霧干燥制得溶菌酶制劑固體粉末。
9.權(quán)利要求要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法制得的溶菌酶制劑。
10.權(quán)利要求9所述的溶菌酶制劑在制備眼用制劑中的用途；具體地，所述眼用制劑為滴眼液、眼膏劑、眼用凝膠劑、或眼用固體制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中，所述眼用制劑中的溶菌酶的含量為0.001 % -25 % (w/w)、0.01 % -20 % (w/w)、0.I % -15 % (w/w)、0.3 % -10 % (w/w)或0.5% -5% (w/w)。
12.權(quán)利要求9所述的溶菌酶制劑作為抑菌劑和/或防腐劑的用途；具體地，所述用途為權(quán)利要求9所述的溶菌酶制劑作為眼藥制劑的抑菌劑和/或防腐劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶學(xué)和藥物制劑學(xué)領(lǐng)域，涉及一種溶菌酶制劑、其制備方法及用途。具體地，所述溶菌酶制劑通過如下方法制得1)將溶菌酶溶于注射用水，得到溶菌酶溶液；2)向步驟1)中的溶菌酶溶液中加入穩(wěn)定劑鹽類；3)調(diào)節(jié)pH至4.6-9.0。本發(fā)明的溶菌酶制劑能夠用于眼用制劑，并且能夠保持良好的穩(wěn)定性。
文檔編號A61K47/42GK103182075SQ201110453880
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉繼東, 王寧利, 唐海, 王征月 申請人:沈陽興齊眼藥股份有限公司