標準化鞏膜蛋白質樣品且在10 % SDS-PAGE凝 膠上電泳，接著在2IV轉印至聚偏二氟乙稀轉印膜（I m m u η - B1 〇 t? PVDF Membrane，伯樂） 1小時。膜在室溫以5 %奶粉于PBS內與0.1 %土溫乳化劑(Tween)阻斷1小時，接著以一級抗 體在4°C培養(yǎng)整夜。膜被洗滌且以結合至山葵過氫化酶的1:10，000山羊抗小鼠或抗兔IgG抗 體(圣塔克魯茲生物科技公司（Santa Cruz))在室溫下培養(yǎng)1小時，并再次洗滌。膜借由以試 劑Lumigen TMA-6(GE醫(yī)療集團英國有限公司，白金漢郡，英國（GE Healthcare UK I imi ted，Buckinghamshire，UK))化學發(fā)光而顯影，且圖像以LAS-4000攝像系統(tǒng)（富士膠卷， 東京，日本(Fujifi Im ,Toky 〇，Japan))捕捉。蛋白質亮帶使用Image J軟件量化。
[0069]統(tǒng)計分析
[0070] 針對體外研究，統(tǒng)計顯著以ANOVA檢測與龐費洛尼事后比較檢定（Bonferroni post hoc test)計算。針對體內研究，統(tǒng)計顯著以方差的分析(配對樣本t檢定(the paired t-test))計算。統(tǒng)計顯著被定義為小于0.05的p值。
[0071]實施例
[0072] 實施例1 :TGF_f3處理之后SSPC形態(tài)改變
[0073] 執(zhí)行TGF-β處理之后SSPC形態(tài)改變的體外研究。SSPC以TGF-β處理（0.1-10ng/ml) 培養(yǎng)24小時，如同先前所述。顯微鏡研究顯示無 TGF-β處理或低濃度(0.1ng/ml)的TGF-β處 理，許多SSPCs有薄紡錘形狀并顯示加寬的表現(xiàn)型。另外，SSPCs的細胞骨架微絲不突出。在 暴露在較高濃度（1至l〇ng/ml)的TGF-02下，SSPCs變得廣并有突出的細胞骨架微絲。免疫熒 光顯微鏡顯示在l〇ng/ml TGF-02的處理之后，α-SMA正SSPCs(具有突出細胞內α-SMA微絲染 色）的數(shù)目增加。
[0074] 實施例2:在a-SMA和Col2表現(xiàn)上TGF-β處理的效果
[0075] 使用SSPC和SSPC的3-D片狀沉淀物執(zhí)行在a-SMA和Col2的表現(xiàn)上TGF-β處理的效果 的體外研究。SSPC和SSPC的3-D片狀沉淀物以TGF-02的多種濃度處理，如先前描述。
[0076] 分析全部mRNA以決定在以0.1至10ng/ml的TGF-02處理24小時之后，有無任何a- SMA和C〇12基因表現(xiàn)的變化。圖2顯示使用定量實時-PCR分析，經過TGF-02處理之后，隨著不 同劑量(分別口〈0.0001及=0.011)在〇-3嫩和〇)12基因表現(xiàn)有統(tǒng)計顯著的增加。
[0077] SSPC片狀沉淀物在控制組培養(yǎng)基內培養(yǎng)，且培養(yǎng)基含有10ng/ml的TGF-i32(TM-片 狀沉淀物)4個星期。組織學分析顯示最多SSPC被定位在圍繞TM片狀沉淀物內的中間基質組 織的中間周邊和周邊區(qū)域。免疫組織化學分析顯示C〇12表現(xiàn)在局部，TM片狀沉淀物的中間 周邊區(qū)域，然而在TM片狀沉淀物內a-SMA表現(xiàn)地更廣泛，特別是在中間周邊區(qū)域和周邊區(qū) 域。相反地，Col2和α-SM的表現(xiàn)在控制組較少。
[0078] 實施例3:在FDM小鼠的鞏膜內Col2和α-SMA的表現(xiàn)
[0079] 使用FDM小鼠以評定評估在鞏膜內C〇12和a-SMA的表現(xiàn)的體內研究。FDM被引入小 鼠的右眼內，如同先前描述，且左眼作為控制組。各個小鼠的兩眼之間在眼軸長度的差異在 開始時并不顯著(P = 〇. 378)。到21天，形覺剝奪的眼睛有著眼軸長3055±39μπι的近視，其眼 軸長顯著地長于對側的控制組眼睛（3015 ±40μπι，p〈0.001)。
[0080]圖3顯示視覺剝奪的21天之后，使用西方墨點分析，F(xiàn)DM眼睛的鞏膜內，C〇12和α-SMA的表現(xiàn)較高。圖3Α區(qū)塊及B區(qū)塊顯示在FDM眼睛內Col2和a-SMA的表現(xiàn)明顯地高于相同小 鼠的對側控制組眼睛（對Col2p = 0.021且對a-SMA p = 0.042)。免疫染色顯示Col2表現(xiàn)在 FDM眼睛內的鞏膜區(qū)域高于在控制組眼睛內，而相較于控制組眼睛。a-SMA表現(xiàn)在FDM眼睛的 鞏膜區(qū)域(接近脈絡膜側)和脈絡膜區(qū)域較大。
[0081 ] 實施例4:在FDM小鼠的脈絡膜內的TGF-ftnRNA的表現(xiàn)
[0082]使用FDM小鼠執(zhí)行評估在脈絡膜內的TGF-β表現(xiàn)的體內研究。FDM如先前描述地被 引入小鼠。
[0083] FDM小鼠的脈絡膜內的TGF-m、TGF-02和TGF-03mRNA的相對表現(xiàn)明顯地高于對側 控制組脈絡膜(2.98、4.44和3.86倍數(shù)變化，分別為p = 0.042、0.045和0.041，圖4)。
[0084] 實施例5:在Col2和a-SMA表現(xiàn)上抗蕈毒堿劑和NSAID的效果
[0085]使用人類SSPC執(zhí)行檢測抗蕈毒堿劑和NSAID在C〇12和a-SMA表現(xiàn)上的效果的體內 研究。SSPCs以ImM阿托平、5mM酮咯酸和ImM雙氯芬酸，在TGF-02 (10ng/ml)的存在下處理，如 先前描述。
[0086] 圖5A區(qū)塊及圖5B區(qū)塊顯示在TGF-02的存在下，Col2和a-SMA的表現(xiàn)被阿托平、酮咯 酸和雙氯芬酸抑制。
[0087]實施例6:以含有抗蕈毒堿劑和NSAID的醫(yī)藥組成物治療近視個體
[0088]進行使用阿托平和包含阿托平及酮咯酸的醫(yī)藥組成物的11個近視病人的臨床研 究。
[0089] 11個近視病人以阿托平的劑量范圍從每單位劑量(約0.05至0.5ml )0.005%至每 單位劑量1%阿托平重量，接受阿托平治療至少一年。每個受影響的眼睛在夜晚被給予一滴 (約0.05至0.5ml)阿托平眼藥水。在阿托平治療期間，這11個近視病人的平均近視加深速率 為-0.9屈光度/年。
[0090] 隨后，這11個近視病人接受含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物至少3個月。阿托平 的劑量范圍從每單位劑量(約〇. 05至0.5ml )0.005 %至每單位劑量1 %阿托平重量且酮咯酸 的劑量范圍從每單位劑量(〇. 5ml )0.25 %至每單位劑量約0.5 %酮略酸重量。每個受影響的 眼睛在夜晚被給予一滴（約0.05至0.5ml)阿托平和酮咯酸組合的眼藥水。在阿托平和酮咯 酸組合的治療期間，這11個近視病人的平均近視加深速率降低至-0.38屈光度/年（圖6)。
[0091] 實施例7:以NSAID治療近視個體
[0092] 近視病人可不忍受阿托平的副作用且被給予NSAID以治療他的近視。酮咯酸的劑 量為每單位劑量(約〇. 05至0.5ml)約0.5 %酮咯酸重量，且受影響的眼睛在夜晚被給予一滴 (約0 · 05至0 · 5ml)的酮咯酸眼藥水。
[0093] 這名病人的平均近視加深速率在無任何治療下，右眼為每年-0.78屈光度而左眼 為每年-0.91屈光度。在NSAID治療三個月后，在兩眼皆無近視加深（圖7)。
[0094]實施例8:FDM小鼠的脈絡膜內的發(fā)炎標志物的表現(xiàn)
[0095]使用FDM小鼠評估評定在脈絡膜內的發(fā)炎標志物的表現(xiàn)的體內研究。FDM如先前描 述地被引入小鼠的右眼且左眼作為控制組。
[0096]圖8A顯示借著實時PCR，IL-6的水平在FDM眼睛的脈絡膜內高于控制組的眼睛。圖 8B顯示借著實時PCR，TNF-α的水平在Π)Μ眼睛的脈絡膜內高于在控制組的眼睛。TNF-α水平 被一天一滴地給藥酮咯酸眼藥水予FDM眼睛而抑制。
[0097] 實施例9:以含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物對SSPC的處理降低a-SMA和Col2
[0098] 使用SSPCs執(zhí)行含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物在a-SMA和C〇12表現(xiàn)上的效果 的體內研究。SSPCs以I Ong/ml的TGF-02處理，如先前描述。
[0099] 圖9A顯示在有TGF-02 (T2)的存在下，a-SMA的表現(xiàn)增加，但在有TGF-02 (T2)的存在 下，具有〇.5mM阿托平(A)、0.25mM的酮咯酸(XI)、和含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物，a-SMA的表現(xiàn)降低。
[0100] 圖9B顯示在有TGF-02 (T2)的存在下，Co 12的表現(xiàn)增加，但在有TGF-02 (T2)的存在 下，具有〇.5mM阿托平(A)、0.25mM的酮咯酸（XI)、和含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物， Co 12表現(xiàn)降低。
[0101] 結果顯示含有阿托平和酮咯酸的醫(yī)藥組成物對a-SMA和C〇12的降低有協(xié)同效應。
【主權項】
1. 一種醫(yī)藥組成物，其包含:兩種抗軟骨生成劑。2. 如權利要求1所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該兩種抗軟骨生成劑的其中之一為一 抗蕈毒堿劑。3. 如權利要求2所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該抗蕈毒堿劑為阿托平。4. 如權利要求2所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該抗蕈毒堿劑包含約0.001 %至約1 % 重量的阿托平。5. 如權利要求2所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該抗蕈毒堿劑包含約0.005%至約 0.05%重量的阿托平。6. 如權利要求1所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該兩種抗軟骨生成劑的其中之一為一 非類固醇抗發(fā)炎藥(NSAID)。7. 如權利要求6所述的該醫(yī)藥組成物，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥為選自酮咯 酸、雙氯芬酸、吲哚美辛、溴芬酸、奈帕芬胺、氟比洛芬、或其組合。8. 如權利要求6所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥包含約0.05%至 約1 %重量的酮咯酸。9. 如權利要求6所述的醫(yī)藥組成物，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥包含約0.01 %至 約0.2 %重量的雙氯芬酸。10. -種包含一或多個抗軟骨生成劑的用途，其用于制造用以治療近視的藥劑。11. 如權利要求10所述的用途，其特征在于，該抗軟骨生成劑是一非類固醇抗發(fā)炎藥。12. 如權利要求11所述的用途，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥為選自酮咯酸、雙芬 氯酸、吲哚美辛、溴芬酸、奈帕芬胺、氟比洛芬、或其組合。13. 如權利要求11所述的用途，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥包含約0.05%至約 1 %重量的酮咯酸。14. 如權利要求11所述的用途，其特征在于，該非類固醇抗發(fā)炎藥包含約0.01 %至約 0.2 %重量的雙氯芬酸。15. 如權利要求10所述的用途，其特征在于，該抗軟骨生成劑為一抗蕈毒堿劑。16. 如權利要求15所述的用途，其特征在于，該抗蕈毒堿劑為阿托平。17. 如權利要求15所述的用途，其特征在于，該抗蕈毒堿劑包含約0.001 %至約1 %重量 的阿托平。18. 如權利要求15所述的用途，其特征在于，該抗蕈毒堿劑包含約0.005%至約0.05% 重量的阿托平。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種含有抗軟骨生成劑的組合的醫(yī)藥組成物。本發(fā)明亦提供一種借由施予有效量的一或多種抗軟骨生成劑以減低鞏膜軟骨生成、減低一或多個眼部軟骨生成蛋白、減低誘發(fā)軟骨生成的炎癥以及借著投藥一或多種抗軟骨生成劑的有效量治療近視的方法也被提供。該醫(yī)藥組成物對治療近視是有用的。
【IPC分類】A61P27/02
【公開號】CN105555363
【申請?zhí)枴緾N201480024605
【發(fā)明人】吳佩昌, 陳玨曇, 蔡佳玲
【申請人】長庚醫(yī)療財團法人高雄長庚紀念醫(yī)院, 吳佩勛
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2014年5月5日
【公告號】CA2911298A1, EP2994197A1, US20160067238, WO2014182620A1