一種用于抗阿茲海默癥功能性紅曲的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于抗阿茲海默癥功能性紅曲的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿茲海默癥(Alzheimer'S disease,簡(jiǎn)稱AD)又稱老人癡呆癥，是一種持續(xù)性神經(jīng) 功能障礙。最顯著的早期癥狀為健忘，通常表現(xiàn)為逐漸增加的短期記憶缺失，隨著病情的加 重，病人的語(yǔ)言能力，空間辨別能力，認(rèn)知能力會(huì)逐步衰退。由于阿茲海默癥對(duì)老年人之生 活會(huì)造成非常多的不便，且會(huì)使子女在精神上與經(jīng)濟(jì)上造成很大的負(fù)擔(dān)，對(duì)于研究開發(fā)用 于抗阿茲海默癥藥物具有重要的意義。
[0003] 目前，已有一些核準(zhǔn)上市用于預(yù)防和治療阿茲海默癥的藥物：乙酷膽堿酶抑制劑 (Ach-I)如 Co 即 ex(Tac;rine)(1993)、Ar icept( Donepezil)愛憶欣（1996);Exelon (Rivastigmine)憶思能（2000)及ReminyI (Galantamine)利憶靈（2001)。教胺酸受體枯抗劑 則有Memantine化Mxa憶必佳，Witgen威智）。運(yùn)些藥物可W延緩記憶的喪失，并且有助于患 者執(zhí)行日常起居所需的動(dòng)作。但很重要的一點(diǎn)是運(yùn)些藥物并不能治愈阿茲海默癥，它們只 能減輕阿茲海默癥的癥狀。此外，運(yùn)些藥物大多是化學(xué)合成的，會(huì)對(duì)患者造成一些副作用， 如惡屯、、頭疼、腹瀉、失眠、疼痛、幻覺或暈眩等，因此它們并非實(shí)用的阿茲海默癥治療藥物。
[0004] 最新研究表明，紅曲中含有許多生理活性物質(zhì)，目前研究較完整的成分包括降膽 固醇合成功效的Monacolins、降血壓功效的丫-氨基下酸（丫-aminobutyric acid，GABA)， 加上它含有抗氧化物質(zhì)，多元效能生理活性物質(zhì)的協(xié)同作用可做預(yù)防和治療阿茲海默癥之 用。
[0005] 申請(qǐng)?zhí)枮?00710306125.7的中國(guó)發(fā)明專利公開了一種治療與預(yù)防阿茲海默癥的 組合物及其制備方法，其為一包含莫納可林、抗發(fā)炎物質(zhì)與抗氧化物質(zhì)的組合物。利用包含 此=類物質(zhì)的組合物來(lái)治療與預(yù)防阿茲海默癥，并通過(guò)本發(fā)明的制備方法加 W實(shí)施，可達(dá) 到確實(shí)治療與預(yù)防W及不會(huì)產(chǎn)生明顯毒副作用的功效。
[0006] 該組合物中的莫納可林、抗發(fā)炎物質(zhì)與抗氧化物質(zhì)可W為紅曲發(fā)酵物，但是該紅 曲發(fā)酵物的制備方法采用普通的紅曲制備工藝，并不是專用于治療阿茲海默癥而培養(yǎng)的， 因此該紅曲發(fā)酵物中的用于治療阿茲海默癥的有效成分含量較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于抗阿茲海默癥功能性紅曲的制備 方法。本發(fā)明采用特殊的工藝，制備的紅曲有效成分含量高，適用于預(yù)防和治療阿茲海默 癥。
[000引本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種用于抗阿茲海默癥功能性紅曲的制備方法，按W 下步驟進(jìn)行： A)、培養(yǎng)基制備:將大米進(jìn)行粉碎制得米粉，然后將所述米粉先與山藥粉、葛根粉、慧米 粉混合后再與蒸饋水混合制得固體培養(yǎng)基，最后對(duì)所述固體培養(yǎng)基先后進(jìn)行滅菌、松散。
[0009] 本發(fā)明選用優(yōu)質(zhì)大米，經(jīng)粉碎處理后，加入適量水和輔料進(jìn)行配制，與直接采用大 米浸泡的常規(guī)工藝有很大的改進(jìn)。運(yùn)有利于米粉快速吸收水分，營(yíng)養(yǎng)物的均勻調(diào)配W及米 粉充分吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有助于紅曲霉菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的合成。
[0010] B)、接種:將紅曲霉菌種接種至所述固體培養(yǎng)基。
[0011] C)、培養(yǎng):培養(yǎng)過(guò)程依次分為第一階段、第二階段和第=階段;第一階段:將培養(yǎng)基 先在30-35°C下培養(yǎng)3-5天;第二階段:在25-30°C下培養(yǎng)5-10天，第S階段:在20-25°C下培 養(yǎng)10-20天。
[0012] 溫度對(duì)發(fā)酵的影響及其調(diào)節(jié)控制是影響微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一，因?yàn)?任何生物化學(xué)的酶促反應(yīng)與溫度變化有關(guān)的。根據(jù)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)來(lái)看，溫度升高，反應(yīng) 速度加快，呼吸強(qiáng)度增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖加快。但隨著溫度的上升，酶失活的速度 也越大，使衰老提前，發(fā)酵周期縮短，運(yùn)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)是極為不利的。最適溫度是一種相對(duì)概 念，是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或發(fā)酵產(chǎn)物的生成。選擇最適溫度應(yīng)該考慮微生物生 長(zhǎng)的最適溫度和產(chǎn)物合成的最適溫度。最適發(fā)酵溫度與菌種，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件和菌體 生長(zhǎng)階段有關(guān)。在紅曲固態(tài)發(fā)酵中，細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累的最適溫度往往不同。至于何 時(shí)應(yīng)該選擇何種溫度，則要看當(dāng)時(shí)生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物合成哪一個(gè)是主要方面，需要在不同的 發(fā)酵階段選擇不同的最適溫度。在紅曲霉生長(zhǎng)初期，菌絲體濃度很低時(shí)，W促進(jìn)菌絲體迅速 生長(zhǎng)繁殖為目的時(shí)，應(yīng)該選擇最適于菌絲體生長(zhǎng)的溫度，在本發(fā)酵工藝中選擇高溫區(qū)（30~ 35°C)。當(dāng)菌絲體濃度達(dá)到一定程度，到了代謝產(chǎn)物分泌期時(shí)，此時(shí)生物合成成為主要方面， 就應(yīng)該滿足生物合成的最適溫度，在本發(fā)酵工藝中選擇中溫區(qū)（25~3(TC)，運(yùn)樣才能促進(jìn) 目標(biāo)產(chǎn)物的大量合成。為了減少紅曲霉細(xì)胞的老化，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，獲得更多的活性產(chǎn)物， 進(jìn)一步降低培養(yǎng)溫度，在本發(fā)酵工藝中選擇低溫區(qū)（20~25°C)。
[0013] D)、烘干:將步驟C)后的固體培養(yǎng)基在45-65°C下進(jìn)行烘干5-化，烘干后制得用于 抗阿茲海默癥功能性紅曲。干燥溫度控制在45°C~65°C，有利于生理活性物質(zhì)不受破壞。
[0014] 作為優(yōu)選，所述固體培養(yǎng)基中米粉、山藥粉、葛根粉、慧米粉和蒸饋水的質(zhì)量比為 (85-88):(5-10):(3-5):(1-3):40。
[0015] 本發(fā)明在大米粉的基礎(chǔ)上添加了山藥粉、葛根粉W及慧米粉，豐富了固態(tài)發(fā)酵基 質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)。山藥除含蛋白質(zhì)、碳水化合物、巧、憐、鐵、胡蘿h素及維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分外， 尚含淀粉酶、膽堿、粘液汁酶及馨葫皂巧等。葛根內(nèi)含黃酬類化合物，如葛根素、大豆黃酬 巧、花生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖、和人體必需的鐵、巧、銅、砸等礦物質(zhì)?；勖?中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、B族維生素，礦物質(zhì)，膳食纖維等，還含有慧米醋、亞油酸等物質(zhì)。 而正是運(yùn)些物質(zhì)的存在，能夠使紅曲霉菌特定地增加目標(biāo)活性物質(zhì)的產(chǎn)量。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟A)中的滅菌溫度為120-122°C，壓力為0.11-0.12M化，時(shí)間為30-45min。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟B)中所述紅曲霉菌種為固含量為8-12wt%的液體種，且每100g固 體培養(yǎng)基的紅曲霉菌種接種量為10-20mL。菌種采用液體種，有利于提高接種量，縮短固態(tài) 發(fā)酵時(shí)間。
[0018] 作為優(yōu)選，所述紅曲霉菌種經(jīng)過(guò)馴化： 選取紅曲霉菌，在30°C下培養(yǎng)于PDA斜面上3天。
[0019] 紫外線照射馴化:取5mL上述培養(yǎng)的濃度為106spores/mL的紅曲霉菌液均勻涂布 于平板上，并利用1抓的紫外燈W20-40cm距離對(duì)所述紅曲霉菌液進(jìn)行照射直至紅曲霉菌的 致死率達(dá)到90%，照射后將紅曲霉菌液于暗室內(nèi)靜置30min，然后將紅曲霉菌液進(jìn)行離屯、并 用無(wú)菌生理鹽水洗涂S次后涂布于PDA培養(yǎng)基上，在30°C下培養(yǎng)3-4天，待單菌落形成后轉(zhuǎn) 接至斜面培養(yǎng)基上保存，篩選后W進(jìn)行代謝活性物質(zhì)Monacolin K的產(chǎn)量分析，選取一株 Monacolin K產(chǎn)量最高的紅曲霉菌株并標(biāo)記為Monas州S shsw-123。
[0020] 硫酸二乙脂化學(xué)誘變處理:取2.5mL濃度為30化/mL的硫酸二乙脂并加入2.5mL濃 度為IO 6Spores/mL的Monascus shsw-123菌液，搖勻后置于30 °C下反應(yīng)直至Monascus shsw-123的致死率達(dá)到90%，然后立即加入1000血無(wú)菌水W終止反應(yīng)，之后經(jīng)過(guò)離屯、，并用 無(wú)菌水洗涂=次后涂布于PDA培養(yǎng)基上，于3(TC培養(yǎng)3-4天，待單菌落形成后轉(zhuǎn)接至斜面培 養(yǎng)基上保存，篩選后W進(jìn)行代謝活性物質(zhì)Monacolin K的產(chǎn)量分析，選取一株Monacolin K 產(chǎn)量最高的紅曲霉菌株并標(biāo)記為Monas州S shsw-267。
[0021] 亞硝基脈化學(xué)誘變處理:取2.5血濃度為10化g/mL的亞硝基脈并加入2.5mL濃度為 10 639〇'日3/11止的齡]1日3。113 8113￥-67菌液，搖勻后置于30°[下反應(yīng)直至齡]1日3州3 3113￥-267 的致死率達(dá)到90%，然后立即加入1000 mL無(wú)菌水W終止反應(yīng)，之后經(jīng)過(guò)離屯、，并用無(wú)菌水洗 涂S次后涂布于PDA培養(yǎng)基上，于3(TC培養(yǎng)3-4天，待單菌落形成后轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上保 存，篩選后W進(jìn)行代謝活性物質(zhì)Monacolin K的產(chǎn)量分析，選取一株Monacolin K產(chǎn)量最高 的紅曲霉菌株并標(biāo)記為Monas州S shsw-308。
[0022] WMonacolin K為主體的有效活性物質(zhì)是紅曲霉在代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的次級(jí)代謝 產(chǎn)