一種在醫(yī)用植入材料表面制備無(wú)毒法抗菌涂層的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用植入材料，尤其是涉及一種在醫(yī)用植入材料表面制備無(wú)毒法抗菌 涂層的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，醫(yī)用植入材料，包括鈦及其合金、不銹鋼、陶瓷及聚合物等醫(yī)用植入體，已 被廣泛地應(yīng)用于外科植入材料，如人工關(guān)節(jié)、牙種植體、血管支架、骨板骨釘以及其他植入 物和醫(yī)療器械。生物無(wú)機(jī)非金屬?gòu)?fù)合材料和高分子材料等廣泛應(yīng)用于人體軟、硬組織修復(fù) 體、人工器官等方面。醫(yī)用植入材料的抗菌性在植入初期非常重要，納米銀作為一種廣譜抗 菌劑引入醫(yī)用植入材料的表面，可有效提高材料表面抗菌性，大幅度降低植入體因植入初 期致病菌在植入體表面的黏附和生長(zhǎng)，進(jìn)而降低術(shù)后感染。然而Ag納米粒子的引入在一定 程度存在細(xì)胞毒性增加的風(fēng)險(xiǎn)，如何保持植入體表面抗菌特性，又能大幅度降低或消除毒 性，是當(dāng)今醫(yī)用生物材料表面功能化的一大挑戰(zhàn)，亟需研究解決。
[0003] 短肽是兩個(gè)或以上的氨基酸脫水縮合形成若干個(gè)肽鍵組成一個(gè)肽，多個(gè)肽進(jìn)行多 級(jí)折疊組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子，短肽具有極強(qiáng)的活性和能量，是細(xì)胞極佳的營(yíng)養(yǎng)劑。短肽如丙 谷二肽(N-(2)_L-丙氨酰-L-谷氨酰胺），已作為腸外營(yíng)養(yǎng)藥品廣泛應(yīng)用于嚴(yán)重感染、復(fù)合性 折、創(chuàng)傷、大手術(shù)、面積燒傷，化學(xué)毒物傷害、輻射傷害、有害物傷害病人的治療和恢復(fù)。在市 場(chǎng)上有多家企業(yè)生產(chǎn)的丙谷二肽注射液產(chǎn)品銷(xiāo)售。短肽對(duì)于處于惡劣環(huán)境和狀態(tài)的細(xì)胞有 明顯的調(diào)節(jié)作用，可有效恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供可顯著降低植入體材料表面銀復(fù)合膜層的細(xì)胞毒性，并保持優(yōu) 異抗菌性，主要應(yīng)用于骨、齒替換及組織再生醫(yī)學(xué)的植入物表面抗菌改性的一種在醫(yī)用植 入材料表面制備無(wú)毒法抗菌涂層的方法。
[0005] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0006] 1)將待處理的醫(yī)用植入材料預(yù)處理；
[0007] 在步驟1)中，所述醫(yī)用植入材料包括醫(yī)用植入金屬、醫(yī)用陶瓷、醫(yī)用高分子材料、 醫(yī)用植入體等;所述醫(yī)用植入金屬包括鈦、鈦合金、不銹鋼等;所述預(yù)處理可采用砂紙對(duì)待 處理的醫(yī)用植入材料表面逐級(jí)打磨去除氧化膜，再依次浸泡于丙酮、乙醇、去離子水中超聲 除油清洗后，干燥；
[0008] 2)配制含AgN03、短肽和電解質(zhì)或還原性物質(zhì)的溶液，在醫(yī)用植入材料表面構(gòu)筑納 米銀/短肽復(fù)合膜層。
[0009] 在步驟2)中，所述短肽可選自二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽等中 的一種;所述電解質(zhì)可選自NaN03等，作為電沉積過(guò)程的支持電解質(zhì)；所述還原性物質(zhì)可選 自葡萄糖、多巴胺等中的一種;所述在醫(yī)用植入材料表面構(gòu)筑納米銀/短肽復(fù)合膜層可采用 脈沖電沉積法、銀鏡反應(yīng)、紫外光還原法或多巴胺還原法等在醫(yī)用植入材料表面構(gòu)筑納米 銀/短肽復(fù)合膜層；
[0010 ] 所述脈沖電沉積法的具體步驟可為：電解液含A g N 0 3 0.0 0 1~0 . 1 m ο 1 / L和 NaN030.001~0.1mol/L/L，短肽的摩爾濃度為0.001~lmol/L，以待處理基底(可導(dǎo)電）為工 作電極，鉑片為對(duì)電極，脈沖電流密度為1~50mA/cm 2，電流通斷比為0.1/0.3，脈沖圈數(shù)為 10 ~1000 圈；
[0011] 所述銀鏡反應(yīng)的具體步驟可為:現(xiàn)配銀氨溶液，在銀氨溶液中添加摩爾濃度為0.1 ~10m〇l/L葡萄糖溶液，得混合溶液，銀氨溶液與葡萄糖溶液的體積比為5:3，短肽的摩爾濃 度為0.001~lmol/L，將待處理基底浸入混合溶液中，反應(yīng)后用去離子水沖洗、晾干，反應(yīng)時(shí) 間為1~60min;
[0012] 所述紫外光還原法的具體步驟可為:配制含AgN〇3和短肽的混合溶液，所述AgN〇3溶 液的摩爾濃度為0.001~lmo 1/L，短肽的摩爾濃度為0.001~lmo 1/L，將待處理基底浸入混 合溶液中，用去離子水沖洗、晾干，浸泡1~30min，取出后放在汞燈（200W，lOOmW/cm 2)下照 射，光照時(shí)間為10~60min;
[0013] 所述多巴胺還原法的具體步驟可為：以Tris-HCl緩沖液配制質(zhì)量濃度為0.01~ 2 · 0mg/ml的多巴胺溶液，pH為8~10;配制AgN〇3/短肽溶液，AgN〇3的摩爾濃度為0.01~lmol/ L，短肽的摩爾濃度為0.001~lmo 1 /L，將陽(yáng)極氧化后的鈦或鈦合金浸入多巴胺溶液進(jìn)行多 巴胺聚合反應(yīng)，震蕩或攪拌1~48h，用去離子水沖洗、晾干，再浸入AgN0 3/短肽溶液進(jìn)行銀 還原反應(yīng)，震蕩或攪拌，還原反應(yīng)時(shí)間為1~48h，用去離子水沖洗、晾干。
[0014]本發(fā)明將短肽引入納米銀膜層的構(gòu)筑過(guò)程，可在顯著優(yōu)化膜層表面結(jié)構(gòu)，并且使 植入體周?chē)榷臐舛染植吭黾?，有效發(fā)揮細(xì)胞環(huán)境調(diào)節(jié)作用，有利于降低Ag納米粒子 造成的細(xì)胞毒性，同時(shí)又不影響納米銀本身的抗菌性能。對(duì)于不同的醫(yī)用植入材料，均可直 接在其表面構(gòu)筑納米銀/短肽復(fù)合膜層，從而有效增強(qiáng)植入體材料表面的生物醫(yī)學(xué)功能。
[0015] 本發(fā)明以醫(yī)用植入材料表面為基底，采用電化學(xué)共沉積法、脈沖電沉積法、化學(xué)還 原法、紫外光還原法等方法在待處理基底上構(gòu)筑短肽和納米銀的復(fù)合膜層。該膜層與不添 加短肽構(gòu)筑的膜層相比，顯著降低植入體材料表面銀復(fù)合膜層的細(xì)胞毒性，且不影響膜層 抗菌性。該方法可應(yīng)用多種醫(yī)用植入物表面生物活性?xún)?yōu)化改性。
[0016] 本發(fā)明以金屬、高分子、陶瓷等醫(yī)用植入物表面為基底，構(gòu)筑了納米銀/短肽的復(fù) 合膜層，通過(guò)選擇相應(yīng)的構(gòu)筑方法、溶液配方和反應(yīng)參數(shù)可獲得不同表面形貌，可優(yōu)選概括 為以下四種，其分別具有如下特征：
[0017] (1)形貌一，納米銀/短肽復(fù)合膜層，在可導(dǎo)電的醫(yī)用植入物表面通過(guò)脈沖電沉積 法制備得到，Ag納米顆粒粒徑10~100nm，單次制備顆粒粒徑在20nm區(qū)間內(nèi)變化，均勾分布， Ag納米顆粒粒徑和負(fù)載量通過(guò)沉積條件可控；
[0018] (2)形貌二，納米銀/短肽復(fù)合膜層，在醫(yī)用植入物表面通過(guò)銀鏡反應(yīng)制備得到，Ag 納米顆粒粒徑1~200nm，單次制備顆粒粒徑在30nm區(qū)間內(nèi)變化，均勾分布，Ag納米顆粒粒徑 和負(fù)載量通過(guò)反應(yīng)時(shí)間可控；
[0019] (3)形貌三，納米銀/短肽復(fù)合膜層，在醫(yī)用植入物表面通過(guò)紫外光還原制備得到， Ag納米顆粒粒徑1~30nm，單次制備顆粒粒徑在10nm區(qū)間內(nèi)變化，均勾分布，Ag納米顆粒粒 徑和負(fù)載量通過(guò)反應(yīng)時(shí)間可控；
[0020] (4)形貌四，納米銀/短肽復(fù)合膜層，在醫(yī)用植入物表面通過(guò)多巴胺還原制備得到， 膜層表面由聚多巴胺膜層和Ag納米顆粒共同構(gòu)成，Ag納米顆粒粒徑5~50nm，單次制備顆粒 粒徑在20nm區(qū)間內(nèi)變化，均勾分布，Ag納米顆粒粒徑和負(fù)載量通過(guò)反應(yīng)時(shí)間可控。
[0021] 經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)調(diào)控溶質(zhì)物種、溶質(zhì)濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、電 化學(xué)反應(yīng)過(guò)程條件等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)可控制備不同形貌和組成納米銀/短肽復(fù)合膜層。
[0022] 本發(fā)明通過(guò)多種載銀方式、優(yōu)選條件制備的納米銀/短肽復(fù)合膜層，Ag納米顆粒在 待處理醫(yī)用植入物基底表面實(shí)現(xiàn)了均勻分布，且顆粒粒徑較一致。通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞 增殖實(shí)驗(yàn)可知，與未添加短肽制備得到納米銀膜層相比，納米銀/短肽復(fù)合膜層在一定程度 上有優(yōu)化或不影響納米銀膜層本身的抗菌性能，且明顯降低了納米銀膜層的細(xì)胞毒性，細(xì) 胞增殖程度顯著提高。
[0023] 本發(fā)明可用于所有鈦及其合金、不銹鋼等金屬醫(yī)療器械或植入物的表面改性，如 骨釘骨板、牙種植體、人工關(guān)節(jié)及其它硬組織植入器械等，也可應(yīng)用于醫(yī)用高分子和醫(yī)用陶 瓷等其他醫(yī)用植入體的表面處理和功能化。
[0024] 本發(fā)明以金屬、陶瓷及聚合物等醫(yī)用植入物為基底，在表面構(gòu)筑一層短肽和納米 銀的復(fù)合膜層。該膜層與無(wú)修飾短肽膜層相比，可顯著降低植入體材料表面納米銀膜層的 細(xì)胞毒性，且保持優(yōu)異的抗菌特性?？蓱?yīng)用于多種植入物表面的無(wú)毒抗菌改性。除脈沖電沉 積法、銀鏡反應(yīng)、紫外光還原法和多巴胺還原法外，還可以為其他復(fù)合添加短肽的載銀方法 如等離子噴涂法、微弧氧化法、溶膠凝膠法、磁控濺射法等。
[0025]本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)在于：
[0026] 1、本發(fā)明所構(gòu)筑的納米銀/短肽復(fù)合膜層與不添加丙谷二肽構(gòu)筑的膜層相比，可 顯著改善銀納米顆粒粒徑的細(xì)化和均勻分布。
[0027] 2、本發(fā)明所構(gòu)筑的納米銀/短肽復(fù)合膜層，可使植入體周?chē)屉臐舛染植吭黾樱?加有效的發(fā)揮細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控作用，在不影響植入體材料表面銀復(fù)合膜層抗菌性的同時(shí) 的顯著降低細(xì)胞毒性。
[0028] 3、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、投資少、可廣泛應(yīng)用于醫(yī)用植入體表面改性，可規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的脈沖電沉積法制備納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層掃描電鏡 圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中的銀鏡反應(yīng)制備納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層掃描電鏡圖。
[0031] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中的紫外光還原法制備納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層掃描電鏡 圖。
[0032] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中的多巴胺還原法制備納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層掃描電鏡 圖。
[0033]圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中的以實(shí)施例1、2、3中的納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層與相同 條件下制備的不含丙谷二肽的納米銀膜層為對(duì)比樣，用WST-1試劑盒得到的細(xì)胞增殖測(cè)試 結(jié)果。圖中E:脈沖電沉積法制備的納米銀膜層;E-A:脈沖電沉積法制備的納米銀/丙谷二肽 復(fù)合膜層;M:銀鏡反應(yīng)制備的納米銀膜層;Μ-A:銀鏡反應(yīng)制備的納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜 層;L:紫外光還原法制備的納米銀膜層;L-A:紫外光還原法制備的納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜 層;Blank:空白Ti〇2納米管膜層，*: p〈0 · 05 〇
[0034]圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中的以實(shí)施例1、2、3、4中的納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層與相 同條件下制備的不含丙谷二肽的納米銀膜層為對(duì)比樣進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]本發(fā)明所述實(shí)施例為優(yōu)選實(shí)施例，用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明以及各因素的影響規(guī) 律，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明做出的 任何修改和改變，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0036] 實(shí)施例1:
[0037] 脈沖電沉積法制備納米銀/丙谷二肽復(fù)合膜層。將10mmX 10mmX 2mm純鈦板用砂紙 逐級(jí)打磨至1500號(hào)，再用去離子水、丙酮、乙醇和去離子水分別超聲清洗lOmin后涼干。配制 0.5%HF溶液為電解液，將打磨好的鈦板為陽(yáng)極，大面積鉑電極為陰極，形成兩電極電解池。 對(duì)體系施予200r/min的機(jī)械攪拌，水浴恒溫，