一種雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于神經(jīng)再生組織工程以及血管組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞激活，迀移形成Bungner帶，引導(dǎo)再生軸突向受損遠(yuǎn)端延伸，通過受損部位。在神經(jīng)挫傷，由于神經(jīng)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，雪旺細(xì)胞以其為支架進(jìn)行迀移。但是，最新的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)橫斷后，神經(jīng)內(nèi)膜連接結(jié)構(gòu)破壞，雪旺細(xì)胞迀移是通過再生的血管為支架。并且血管的方向生長對于引導(dǎo)雪旺細(xì)胞方向性迀移和軸突方向性生長至關(guān)重要。
[0003]在神經(jīng)損傷長節(jié)段神經(jīng)缺損時(shí)，必須通過導(dǎo)管橋接，實(shí)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)連接。因此，如何實(shí)現(xiàn)神經(jīng)導(dǎo)管快速方向性血管化，并引導(dǎo)雪旺細(xì)胞分別由受損遠(yuǎn)端和近端快速方向性迀移入神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，成為加速軸突快速通過橋接部位，促進(jìn)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。
[0004]VEGF具有趨化內(nèi)皮細(xì)胞迀移并促進(jìn)血管生成作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，通過基因工程高表達(dá)VEGF具有神經(jīng)保護(hù)作用，并促進(jìn)神經(jīng)再生。但是這些研究沒有解決如何加速神經(jīng)導(dǎo)管血管化，促進(jìn)神經(jīng)快速通過橋接部位的問題。馬福凱等研究發(fā)現(xiàn)通過與普通膠原導(dǎo)管相比，VEGF功能化的導(dǎo)管能夠顯著的促進(jìn)神經(jīng)再生。有研究發(fā)現(xiàn)，度梯度的引導(dǎo)，不能實(shí)現(xiàn)快速的向神經(jīng)導(dǎo)管中央方向性的血管化，限制內(nèi)皮細(xì)胞能夠向高濃度極化，并加速向高VEGF濃度方向性迀移成血管。因此，不具有濃度梯度神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)神經(jīng)導(dǎo)管，由于沒有方向性濃弓I導(dǎo)雪旺細(xì)胞迀移入導(dǎo)管內(nèi)速度，進(jìn)而限制VEGF通過神經(jīng)導(dǎo)管的速度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法，旨在通過制備具有雙向梯度的VEGF的導(dǎo)管，可以加速神經(jīng)導(dǎo)管方向性血管化，引導(dǎo)雪旺細(xì)胞由受損兩端快速方向性迀移如神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，從而促進(jìn)神經(jīng)再生，解決無濃度梯度VEGF導(dǎo)管促進(jìn)血管化不具有方向性問題。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法，該雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法包括以下步驟:
[0007]步驟一，靜電紡絲PCL導(dǎo)管的制備:將PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液制備靜電紡絲溶液，通過微量注射栗控制電紡溶液的流速為2ml /h-4ml /h，靜電紡絲裝置兩極間電壓設(shè)定為20kV，注射器和接收器之間的距離為15cm，應(yīng)用21-G針形噴嘴，接收器為直徑1.5mm的鋼棒，制備內(nèi)徑為1.5mm，長度為1.5cm的PCL導(dǎo)管，在真空干燥箱中干燥，除去殘余溶劑，得到PCL導(dǎo)管；
[0008]步驟二，PCL導(dǎo)管雙向梯度氨解:將PCL導(dǎo)管用細(xì)鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應(yīng)5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當(dāng)浸沒導(dǎo)管后停止加水，繼續(xù)反應(yīng)5min-10min;之后用PBS洗去未反應(yīng)的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向兩端-NH2密度逐漸減低的梯度導(dǎo)管；
[0009]步驟三，肝素偶聯(lián)反應(yīng)制備雙向梯度的肝素化導(dǎo)管:將步驟二所得具有雙向梯度-NH2的PCL導(dǎo)管放入嗎啉乙磺酸緩沖體30min，移除嗎啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺/肝素溶液，避光脫色搖床過夜，將肝素共價(jià)結(jié)合到攜帶氨基的導(dǎo)管上，PBS洗去未結(jié)合的肝素，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的肝素化導(dǎo)管；
[0010]步驟四，雙向梯度VEGF導(dǎo)管制備:雙向梯度的肝素化導(dǎo)管，放入2mlEP管中，加入2ml 100ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡過夜，吸出VEGF溶液，加入PBS溶液潤洗，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的VEGF功能化的導(dǎo)管。
[0011 ] 進(jìn)一步，所述步驟一中將PCL溶于10 %的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按體積質(zhì)量比占混合溶液的10%，按體積比甲醇:氯仿=1:5。
[0012]進(jìn)一步，所述步驟二中，將1.5cmPCL導(dǎo)管用細(xì)鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應(yīng)5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當(dāng)浸沒導(dǎo)管后停止加水，繼續(xù)反應(yīng)5min-10min。
[0013]本發(fā)明另一目的在于提供一種PCL導(dǎo)管雙向氨解裝置，該P(yáng)CL導(dǎo)管雙向氨解裝置包括2ml EP管、細(xì)鐵絲、PCL導(dǎo)管和微量注射栗。所述PCL導(dǎo)管設(shè)置在內(nèi)部盛有乙二胺溶液2mlEP管內(nèi)部，所述細(xì)鐵絲穿過PCL導(dǎo)管，所述內(nèi)部裝有蒸餾水的微量注射栗與2ml EP管連接。
[0014]進(jìn)一步，所述PCL導(dǎo)管通過彎曲對折垂直設(shè)置在2ml EP管內(nèi)部。
[0015]本發(fā)明另一目的在于提供一種雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)神經(jīng)再生方法，該雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)神經(jīng)再生方法包括:
[0016]雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管中央部釋放高濃度的VEGF，通過趨化作用，加速受損神經(jīng)兩端的內(nèi)皮細(xì)胞向雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管中央高濃度處迀移;加速神經(jīng)導(dǎo)管由兩端向中央方向性血管化，生成的血管作為支架，引導(dǎo)雪旺細(xì)胞快速方向性迀移進(jìn)入神經(jīng)導(dǎo)管，從而加速神經(jīng)再生并沿雪旺細(xì)胞向遠(yuǎn)端延伸。
[0017]進(jìn)一步，所述雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管，其中央所負(fù)載的VEGF量高，而兩端所負(fù)載的VEGF量相對較少
[0018]本發(fā)明提供的雙向梯度的VEGF功能化的神經(jīng)導(dǎo)管，其中央所負(fù)載的VEGF量高，而兩端所負(fù)載的VEGF量相對較少，能夠通過趨化作用受損神經(jīng)兩端的內(nèi)皮細(xì)胞向?qū)Ч苤醒敫邼舛忍庌|移，加速神經(jīng)導(dǎo)管由兩端向中央方向性血管化。同時(shí)生成的血管能夠作為支架引導(dǎo)雪旺細(xì)胞快速迀移進(jìn)入神經(jīng)導(dǎo)管，從而促進(jìn)神經(jīng)的再生并沿雪旺細(xì)胞向遠(yuǎn)端延伸。但是本發(fā)明中VEGF在整個(gè)神經(jīng)導(dǎo)管中結(jié)合均一，不具有濃度梯度。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法流程圖；
[0020]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的PCL導(dǎo)管雙向氨解裝置示意圖；
[0021]圖中:l、2mlEP管;2、細(xì)鐵絲;3、PCL導(dǎo)管;4、微量注射栗。
[0022]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的神經(jīng)修復(fù)4周后導(dǎo)管中央雪旺細(xì)胞迀移及神經(jīng)再生情況圖；
[0023]圖中:A-C、單純PCL神經(jīng)導(dǎo)管組;D-F、PCL神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合VEGF，沒有梯度;G-1、PCL神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合VEGF，具有雙向梯度。
[0024]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的感覺神經(jīng)及運(yùn)動神經(jīng)再生情況圖。
[0025]圖中:(A_C，G)、檢測的背根神經(jīng)節(jié)中感覺神經(jīng)元情況；(D_F，H)、檢測的脊髓中運(yùn)動神經(jīng)再生情況。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0028]如圖1，所示，本發(fā)明實(shí)施例的雙向梯度血管內(nèi)皮生長因子的神經(jīng)導(dǎo)管制備方法包括以下步驟:
[0029 ] S11:靜電紡絲PCL導(dǎo)管的制備:將PCL溶于1 %的甲醇/氯仿的混合溶液制備靜電紡絲溶液，通過微量注射栗控制電紡溶液的流速為2ml/h-4ml/h，靜電紡絲裝置兩極間電壓設(shè)定為20kV，注射器和接收器之間的距離為15cm，應(yīng)用21-G針形噴嘴，接收器為直徑1.5mm的鋼棒，制備內(nèi)徑為1.5mm，長度為1.5cm的PCL導(dǎo)管，在真空干燥箱中干燥，除去殘余溶劑，得到PCL導(dǎo)管；
[0030]5102:?(^導(dǎo)管雙向梯度氨解:將1.5(^ PCL導(dǎo)管用細(xì)鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應(yīng)5min-20min，然后微量注射栗以lml/h-3ml/h速度向EP管中加入蒸餾水，當(dāng)浸沒導(dǎo)管后停止加水，繼續(xù)反應(yīng)5min-10min;之后用PBS洗去未反應(yīng)的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向兩端-NH2密度逐漸減低的梯度導(dǎo)管；
[0031]S103:肝素偶聯(lián)反應(yīng)制備雙向梯度的肝素化導(dǎo)管:將S102所得具有雙向梯度-NH2的PCL導(dǎo)管放入嗎啉乙磺酸緩沖體30min，移除嗎啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺/肝素溶液，避光脫色搖床過夜，將肝素共價(jià)結(jié)合到攜帶氨基的導(dǎo)管上，PBS洗去未結(jié)合的肝素，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的肝素化導(dǎo)管；
[0032]S104:雙向梯度VEGF導(dǎo)管制備:雙向梯度的肝素化導(dǎo)管，放入2mlEP管中，加入2mll00ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡過夜，吸出VEGF溶液，加入I3BS溶液潤洗，超凈臺晾干，制得具有雙向梯度的VEGF功能化的導(dǎo)管。
[0033]所述SlOl中將PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按體積質(zhì)量比占混合溶液的10%，按體積比甲醇:氯仿=1:5。
[0034]所述S102中，將PCL導(dǎo)管用細(xì)鐵絲穿過，彎曲對折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反應(yīng)5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加