一種用于抑制冠狀病毒感染的制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于抑制冠狀病毒感染的制劑。
【背景技術】
[0002] 冠狀病毒不僅可以引起許多動物疫情的暴發(fā)，同時，也是人類普通感冒的主要病 原之一，兒童感染率較高，主要是上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道，潛伏期2~5天，各 年齡組均有發(fā)病，兒童多見，以上呼吸道感染為特征，少數(shù)可致腹瀉、支氣管炎、肺炎和胸腔 積液等。近年來，尤其值得注意是病冠狀病毒常常引起人類嚴重的呼吸系統(tǒng)感染，導致嚴重 急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)等烈性傳染病的暴發(fā)，對全球公共衛(wèi)生系 統(tǒng)造成極大的沖擊。
[0003] 人類面臨病毒性傳染病的現(xiàn)實和潛在威脅日益嚴峻，人類應對突發(fā)傳染病的防控 壓力日感倍增，但愈來愈多的實際情況表明：當病毒發(fā)生突變或出現(xiàn)新型病毒而導致傳染 病疫情暴發(fā)時，原來的特異性防治藥物難以發(fā)揮應有防控效果，甚至毫無療效，而人類認知 水平和科研周期的限制，又使具有顯著療效的新一代特異性預防和治療藥物難以在短時間 內(nèi)推出，極易導致疫情的迅速擴散和局部地區(qū)的災難性暴發(fā)，不僅對當?shù)氐墓残l(wèi)生服務 造成極大的破壞，同時也對社會的政治和經(jīng)濟造成巨大的沖擊。因此，依據(jù)病毒的基本生物 學特性，針對病毒侵染宿主細胞的共性靶點，研發(fā)新型病毒感染抑制劑，對于應對病毒性傳 染病疫情的持續(xù)挑戰(zhàn)具有重要意義。
[0004]植物化合物被稱為"第七類營養(yǎng)素"，廣泛存在于日常食物，是一類對人體健康具 有特殊作用的非營養(yǎng)性化學物質(zhì)。相關研究發(fā)現(xiàn)部分植物化合物具有抑制病毒感染的生物 活性，并逐漸成為抗病毒研究的熱點之一。初步的研究結果顯示:植物化合物的生物學效應 主要表現(xiàn)在其對細胞膜生物學特性的影響和局部微環(huán)境平衡的改變等方面，部分植物化合 物通過直接嵌入細胞膜脂質(zhì)雙層結構，改變細胞膜正常的功能性流動和電勢電位差，進而 發(fā)揮一定的生物學效應。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制冠狀病毒感染的制劑及其應用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應用具體為一種制劑在如下（1)或(2)中的應用：
[0007] (1)制備用于抑制冠狀病毒感染的產(chǎn)品；
[0008] (2)用于抑制冠狀病毒感染；
[0009] 所述制劑主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述 表沒食子兒茶素沒食子酸酯、所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為(〇. 5-1.0): (0.5- 1.0):(0.5-1.5)〇
[0010] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述用于抑制病毒感染的制劑具體由表沒食子兒茶素 沒食子酸酯(EGCG)、單寧酸和黃芪多糖混合而成;所述表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、 所述單寧酸和所述黃芪多糖的質(zhì)量配比為1: 1:1.5。
[0011] 在本發(fā)明中，所述抑制冠狀病毒感染為如下(a)或(b):
[0012] (a)預防冠狀病毒感染；
[0013] (b)在與冠狀病毒同時作用于宿主或宿主細胞時，抑制所述冠狀病毒對所述宿主 或所述宿主細胞的感染。
[0014] 更加具體的，在本發(fā)明的實施例中，所述制劑對所述冠狀病毒感染的抑制作用具 體體現(xiàn)為：以哺乳動物細胞作為冠狀病毒感染對象，在冠狀病毒感染細胞的同時或者在冠 狀病毒感染細胞前施用所述制劑，所述制劑對冠狀病毒的半數(shù)抑制濃度與抑制病毒感染的 陽性對照藥物相比顯著降低。所述陽性對照藥物具體為利巴韋林(Ribavirin)。
[0015] 在本發(fā)明中，所述哺乳動物細胞(或(b)中所述的宿主細胞)具體為鼠成纖維細胞 (17C1-1 細胞）。
[0016] 在本發(fā)明中，所述冠狀病毒為鼠肝炎冠狀病毒。更加具體的，所述冠狀病毒為鼠肝 炎冠狀病毒A59株。
[0017] 本發(fā)明以冠狀病毒(mouse hepatitis virus，MHV)為實驗對象，采用觀察細胞病 變的方法，在不同的感染條件下，分別分析了表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、單寧酸和 黃芪多糖這三種植物化合物單體及其混合制劑抑制病毒感染的規(guī)律和特點。結果證實:本 發(fā)明所提供的三種植物化合物單體和復合配方混合物的細胞毒性均不高于已經(jīng)獲得安全 許可的對照樣品利巴韋林，較為安全。在安全的使用濃度下，預防性使用EGCG和單寧酸等植 物化合物單體以及植物提取物復合配方混合物，可以有效的抑制冠狀病毒的感染。本發(fā)明 所提供的制劑具有進一步研發(fā)為冠狀病毒感染抑制劑的商業(yè)價值。
【具體實施方式】
[0018] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]下述實施例中涉及的定量實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（土s)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng) 計軟件運用單因素水平方差分析的方法對組間比較數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。
[0021] 細胞株：鼠成纖維細胞（17C1-1細胞），由英國布里斯托大學Stuart Siddell教授 饋贈，記載于"Lin Lei1Sun Ying1Wu Xiaoyan1Sun Zounan1Yang Yi,Su Wenli1Hu Yi1Zhu Qingyu,Guo Deyin,Liu Jingmei,Chang Guohui·Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS ONE,2013 8(4) :e61166.，> 一文，公眾可從申請人處獲得，僅用于重復本發(fā)明實驗使用。細胞按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。 [0022] 病毒：冠狀病毒（鼠肝炎冠狀病毒A59株，簡稱MHV-A59)記載于"Lin Lei，Sun Ying1Wu Xiaoyan,Sun Zounan1Yang Yi,Su WenIi,Hu Yi,Zhu Qingyu,Guo Deyin1Liu Jingmei,Chang Guohui.Attenuation of Mouse Hepatitis Virus by Deletion of the LLRKxGxKG Region of Nspl.PLoS 0NE，2013 8(4) :e61166."一文，公眾可從申請人處獲 得，僅用于重復本發(fā)明實驗使用。
[0023] 培養(yǎng)液：1 )、細胞生長培養(yǎng)液：以DMEM培養(yǎng)基(G1 ibo公司產(chǎn)品）為母液，分別加入 10 % (體積分數(shù))胎牛血清(Sigma公司產(chǎn)品），0 · 2mg/ml谷氨酰胺(G1 ibo公司產(chǎn)品），100U/ml 青霉素，鏈霉素。2)、細胞維持培養(yǎng)液，胎牛血清含量為2% (體積分數(shù)），其余與1)均相同。 3)、病毒增殖培養(yǎng)液:與細胞生長培養(yǎng)液相同。
[0024] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) :Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>95%)，產(chǎn)品編號 為E4143，CAS#989-51-5。
[0025] 單寧酸（Tannin):Sigma公司產(chǎn)品（分析純度>99%)，產(chǎn)品編號為V900190;CAS# 1401-55-4。
[0026] 黃芪多糖（APS):上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品（2-(Chl〇r〇methyl )-4-(4-nitrophenyl)-l，3-thiazole)(分析純度 >70%)，產(chǎn)品編號為 JS11328;CAS#89250-26-0。
[0027] 陽性對照藥物:利巴韋林(Ribavirin)，美侖生物公司產(chǎn)品。因目前還未有通過改 變宿主細胞膜特性抑制病毒感染的標準陽性對照藥物。本研究以目前抗病毒最常用藥物利 巴韋林作為對照。實驗前以PBS緩沖液溶解，制成2560μg/ml過濾，除菌后，-20 °C保存。
[0028] 倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司產(chǎn)品。
[0029] 細胞培養(yǎng)箱:美國Thermo公司產(chǎn)品。
[0030] 多功能酶儀:美國Molecular Devices公司SpectraMax M5型多功能酶標儀。
[0031] 1、細胞復蘇與傳代
[0032] 液氮中取出17C1-1細胞，37°C水浴，融化后，以1000 rpm離心5min，棄上清，加入適 當?shù)募毎L培養(yǎng)液，反復吹打均勻，使細胞密度約為2 X IO5個/ml，以IOml/瓶，于T25細胞 培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24h后于鏡下觀察，細胞的貼壁情況，48-72h后，或待細 胞生長到密度大約為95%時，棄原培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液，漂洗兩次，0.5ml 0.25% (0.25g/100ml)EDTA，于37°C培養(yǎng)箱中溫育消化，當細胞收縮變圓時，迅速加入細胞生長培 養(yǎng)液，終止消化，反復吹打均勻后，以1000 rpm離心，5min，棄上清，使懸浮細胞濃度約為I X IO5個/ml，IOml/每瓶，移入T25細胞培養(yǎng)瓶，放置細胞培養(yǎng)箱，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
[0033] 2、病毒增殖
[0034] 取細胞生長密度約為80%的T25細胞培養(yǎng)瓶，棄原液，以roS，漂洗兩次，以去除血 清殘留，加入已稀釋病毒(稀釋液為PBS緩沖液），接種量MOI = O.01，以及Iml培養(yǎng)基，晃勻， 置于細胞培養(yǎng)箱中吸附lh，棄上清，每瓶加入IOml相應病毒增殖培養(yǎng)液。觀察細胞病變，48-72h后，或待細胞病變達75 %以上時，收毒，取上清，反復凍融3次，以3000rpm，4°C，離心 5min，分裝上清，并測定病毒滴度TCID50。
[0035] 3、病毒滴度TCID5q測定
[0036]采用致細胞病變法(CPE)測定，以單細胞懸液，加入96孔微量培養(yǎng)板中，每孔200μ 1，使細胞量達到2 X IO5個/ml，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，直至細胞單層密度約為80 %時， 取出，棄培養(yǎng)基，以PBS漂洗兩遍，利用病毒增殖培養(yǎng)液將病毒原液10倍梯度稀釋為10 3~ 1〇_13,每濃度梯度8孔一列，每