一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法，屬于生物化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可穿戴式的三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳酸，作為葡萄糖無氧酵解的產(chǎn)物，在人體缺氧和過度疲勞的情況下會出現(xiàn)大量的堆積，其在體液和組織中的含量能夠有效地反映人體局部組織是否缺氧，運動是否過度。可見，對人體乳酸含量的實時監(jiān)測顯得尤為重要。但是，市場上通用的乳酸檢測儀屬于侵入式傳感器，通過針扎的形式采集受試者指尖毛細(xì)血管的血液，反復(fù)的采集不僅傷害大，而且不能做到實時監(jiān)測，尤其體現(xiàn)在對各類疾病導(dǎo)致缺氧的患者的監(jiān)護(hù)治療和對運動員體能測試的過程中。新近研究先后報道了用于人體唾液和汗液中乳酸含量監(jiān)測的可穿戴式電化學(xué)傳感器，但其制作過程復(fù)雜，工藝要求和成本高，精度低，生物相容性差，不能及時有效地反映乳酸含量的變化。因此，亟需研發(fā)新的乳酸檢測技術(shù)，來實現(xiàn)其在生理健康監(jiān)測和信號提取方面的應(yīng)用突破。
[0003]石墨烯，一種由單層碳原子組成的新型二維碳基納米材料，在生物電化學(xué)領(lǐng)域中的研究日益受到關(guān)注，其優(yōu)良的電催化性能使其成為制備酶電化學(xué)生物傳感器理想的電極材料之一，其特殊的分子結(jié)構(gòu)使其可以有效地促進(jìn)電子傳輸，提升生物傳感器的響應(yīng)信號和靈敏度。此外，其良好的生物相容性能夠保持傳感器所負(fù)載酶的生物活性，改善傳感器的穩(wěn)定性。近來，石墨稀納米墻，一種由石墨稀納米片垂直分布于基底材料上的石墨稀三維結(jié)構(gòu)，與二維石墨烯相比具有更為豐富的形態(tài)結(jié)構(gòu)和巨大的比表面積，同時賦予了更好的拉伸性，已開始逐漸應(yīng)用于傳感器的研發(fā)，如對氣體、溫度的監(jiān)測。
[0004]申請公布號為CN105116028A專利文件公開了一種石墨烯修飾的乳酸生物傳感器及其制備方法，該乳酸生物傳感器是一種微型化的乳酸傳感器，可測量人體血清中的乳酸含量，但是該材料依然屬于二維的碳顆粒/碳纖維為基材的穿戴式乳酸傳感器，其電傳導(dǎo)性、生物相容性依然有局限性，且材料本身拉伸性能不強。同時該專利采用的是氧化或羧基化的石墨烯，材料本身由于其結(jié)構(gòu)缺陷，導(dǎo)致其電子傳輸速度不高，影響傳感器的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對【背景技術(shù)】中的不足和改進(jìn)需求，本發(fā)明的目的在于提供一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法，基于一種特殊的石墨烯納米墻結(jié)構(gòu)材料作為乳酸氧化酶的負(fù)載骨架，三維石墨烯具有更強的電傳導(dǎo)性、更為豐富的導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)且材料生物兼容性好。通過對關(guān)鍵傳感器基材-三維石墨烯墻的生長條件研究和技術(shù)改進(jìn)，對傳感器的制備和乳酸酶功能化技術(shù)優(yōu)化，能夠制得新型的三維石墨烯乳酸傳感器，且該傳感器對于乳酸的電化學(xué)響應(yīng)靈敏，并體現(xiàn)出優(yōu)良的重現(xiàn)性，同時可拉伸性強，適宜穿戴，這種傳感器可用在非侵入性可穿戴式的電子皮膚，可對人體乳酸進(jìn)行實時、精確的檢測;這種三維石墨烯成本低廉、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝簡單，適于大規(guī)模的工業(yè)化批量生產(chǎn)，尤其適用于醫(yī)療監(jiān)護(hù)、健康管理等領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法，該方法步驟如下:
[0006](I)石墨烯墻的制備
[0007]采用PECVD法，將厚度為Ιμπι?ΙΟΟμπι的銅箔水平放置在生長爐的玻璃管中，先后經(jīng)過升溫、退火、生長三個步驟；其中，升溫過程為30?90min升溫至500?800°C，氫氣=5?30sccm;退火過程為30?90min，維持600?800°C，氣氣=5?15sccm;生長過程為60?120min，維持600?800°C，甲燒:氫氣=4: 8sccm，射頻=200?500mw ；生長結(jié)束后關(guān)閉射頻和甲烷，氫氣設(shè)置到2?20sCCm，打開風(fēng)扇快速降溫，最后輕柔地取出生長有石墨烯墻的銅箔；
[0008](2)石墨烯墻的轉(zhuǎn)移
[0009]a)配制濃度為0.1M?0.5M的Fe(NO3)3銅刻蝕液，b)將銅箔裁剪成尺寸為0.2cm*
0.2cm?3cm*3cm不等的小塊置入溶液表面，以生長有石墨烯墻的一面朝上，室溫條件下過夜以充分刻蝕銅箔，c)用經(jīng)等離子處理的尺寸為0.2cm*0.2cm?3cm*3cm不等的PET膜將漂浮的石墨稀墻撈起，將石墨稀墻轉(zhuǎn)移至超純水中30min*3?5次以充分清除殘余的銅、鐵等金屬離子，d)用PET撈起清洗過的石墨稀墻并放入烘箱中在80?150 °05?60min的條件下烘干，使石墨烯墻與PET牢固貼合；
[0010](3)電極的制備
[0011]采用絲網(wǎng)印刷法印制電極，a)將Ag/AgCI油墨印制在PET上作為參比電極，在60-100 °C范圍烘烤5-25分鐘，b)將碳油墨印制在PET上作為工作電極和對電極，在80-120 °C范圍烘烤15-30分鐘，c)在工作電極表面再印制一層絕緣漿料，在50-90 °C范圍內(nèi)烘烤5_20分鐘，d)將三電極分別接上導(dǎo)電銀絲引出電路；
[0012](4)傳感器電極的表面功能化
[0013]a)將乳酸氧化酶負(fù)載到三維石墨烯納米墻上，室溫晾干，b)配置2_20yL，濃度為100-80011]/1111的殼聚糖溶液，(3)將2-2(^1^，濃度為0.3-3.5%殼聚糖溶液滴覆到三維石墨烯/乳酸氧化酶表面，d)將濃度為0.25-2 %的戊二醛固定到三維石墨烯墻/酶/殼聚糖表面，室溫晾干一段時間，e)清洗電極上殘余的乳酸氧化酶并保存;在清洗和保存的過程中所用到的PBS溶液濃度均為0.1M，pH=7.0，處理的溫度均為2_8°C ；
[0014](5)傳感器電極的乳酸檢測
[0015]a)于PBS緩沖液中配制乳酸溶液，b)測試傳感器靈敏度并測試傳感器穩(wěn)定性，c)測試傳感器特異性;其中，PBS(0.1M，pH7.0)緩沖液配制的乳酸溶液濃度范圍在1-1OOmM;在氧化-還原曲線測試過程中，將電勢設(shè)定為-1.0V-+1.0V(VS.Ag/AgCl)，將傳感器先后浸泡在上述溶液中，2min后開始記錄電流，記錄時間為60s ；在時間-電流曲線測試過程中，將電勢設(shè)定為-0.35V(VS.Ag/AgCl)，將傳感器浸泡在上述溶液中記錄時間為60s;在靈敏度測試過程中，將電極依次浸泡在0.1-400mM的乳酸溶液中2min后，接上對應(yīng)的三個電極，打開電化學(xué)工作站(CHI760)，將電勢設(shè)定為-0.35V(VS.Ag/AgCl)，采用循環(huán)伏安法開始記錄電流，記錄時間為400s。
[0016]總體而言，按照本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具備以下的技術(shù)優(yōu)點:
[0017]1.以三維石墨烯納米墻為基材，采用絲網(wǎng)印刷法印制三電極，然后通過優(yōu)化的殼聚糖-戊二醛交聯(lián)吸附法將乳酸氧化酶固定至納米墻表面制得電極。電極測試顯示:運用該方法制備的電極，具有很好的靈敏性、穩(wěn)定性和實時性，同時有著較好的乳酸識別特異性；
[0018]2.與二維石墨烯相比，該發(fā)明使用的石墨烯納米墻具有更加豐富的三維結(jié)構(gòu)、更為巨大的比表面積以及更加優(yōu)越的電子轉(zhuǎn)移性能，不僅負(fù)載了更多的乳酸氧化酶，并且構(gòu)建一個更為精密的導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，從而有效地提升了對乳酸檢測的靈敏度；
[0019]3.該法制備乳酸傳感器，精確實時、性能穩(wěn)定、生物相容性強、經(jīng)濟環(huán)保，并且工藝簡單、成本低廉、無需精確控制工藝參數(shù)，適于大規(guī)模的工業(yè)化批量生產(chǎn)，尤其適用于醫(yī)療監(jiān)護(hù)、健康管理等領(lǐng)域的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明所涉及的一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備工藝流程圖；
[0021]圖2是實施例1所制得的三維石墨烯納米墻高分辨透射電鏡照片(A)和不同放大倍數(shù)掃描電鏡照片(B-E);
[0022]圖3是實施例1所制得的三維石墨烯納米墻的拉曼光譜特征峰；
[0023]圖4是實施例1所制得的三維石墨烯乳酸傳感器產(chǎn)品的氧化還原曲線，PBS為不含乳酸的磷酸鹽緩沖液；
[0024]圖5是實施例1所制得的三維石墨烯乳酸傳感器產(chǎn)品的時間-電流曲線，PBS為不含乳酸的磷酸鹽緩沖液；
[0025]圖6是實施例1所制得的三維石墨烯乳酸傳感器產(chǎn)品在不同濃度乳酸溶液中的電流變化曲線。起始乳酸濃度為0.5mM，然后將傳感器分別置入a溶液(0.6mM)，b溶液(0.7mM)，c溶液(0.8mM)，(1溶液(0.111^)^溶液(0.81111)和打容液(01111)，所記錄的電流值大小隨溶液中乳酸濃度大小呈正相關(guān)。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和實施列對本發(fā)明進(jìn)行說明。
[0027]實施列I
[0028]本實施例提供一種三維石墨烯乳酸傳感器的制備方法，該方法的工藝流程圖如圖1所示，具體步驟如下:
[0029]1.采用PECVD法，將20μπι厚的銅箔水平放置在生長爐的玻璃管中，先后經(jīng)過升溫、退火、生長三個步驟。條件分別為:升溫:30111丨11升溫至500°(:，氫氣=5，10，15，20，25，308(^111;退火:30111；[11，維持600°〇，氫氣= 5sccm;生長:60min，維持600°C，甲燒:氫氣=4:8sccm，射頻= 200mw;生長結(jié)束后關(guān)閉射頻和甲燒，氫氣設(shè)置到2sccm，打開風(fēng)扇快速降溫，最后輕柔地取出生長有石墨烯墻的銅箔，所制得的三維石墨烯納米墻高分辨透射電鏡照片(A)和不同放大倍數(shù)掃描電鏡照片(B-E)如圖2所示，所制得的三維石墨烯納米墻的拉曼光譜特征峰如圖3所示。
[0030]2.配制0.1M的Fe(NO3)3銅刻蝕液，然后將銅箔裁剪為0.5cm*0.5cm的小塊置入溶液表面，以生長有石墨烯墻的一面朝上，室溫條件下過夜以充分刻蝕銅箔。然后，用經(jīng)等離子處理(暴露PET表面的親水基團(tuán)，方便與石墨稀墻貼合)的lcm*lcm PET膜將漂浮的石墨稀墻撈起，將石墨稀墻轉(zhuǎn)移至超純水中30min*3次以充分清除殘余的銅、鐵等金屬離子。然后，PET撈起清洗過的石墨烯墻并放入烘箱中在80°C的條件下烘烤5min，使石墨烯墻與PET牢固貼合。
[0031]3.采用絲網(wǎng)印刷法印制電極，先將Ag/A