沙門氏菌綴合物疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于片段化的Vi多糖和載體蛋白的綴合物，包含所述綴合物的組合物和用于制備所述綴合物和組合物的方法。
【專利說明】沙門氏菌綴合物疫苗
[0001]發(fā)明背景 疫苗中已經(jīng)多年使用來自細(xì)菌的糖類。雖然糖類是T非依賴性抗原，然而，它們是弱免 疫原性的。此外，它們在2歲以下的嬰兒或幼兒中無效。綴合至載體可以有效地將T非依賴性 抗原轉(zhuǎn)化為T依賴性抗原，從而增強(qiáng)記憶應(yīng)答并允許發(fā)展保護(hù)性免疫。迄今為止，最有效的 糖疫苗因此基于糖綴合物。均屬于Yeda Research and Development Co. Ltd.的W095/ 31994和W094/03208、US 5,204,098和恥2008/081022涉及弱免疫原性抗原的綴合物。
[0002] 許多綴合方法利用短寡糖，并且這主要用于改善制造工藝（更好地控制制造一致 性，更好地表征最終產(chǎn)品）。眾所周知的是，糖鏈長可以對綴合物疫苗的免疫原性具有影響 (P. Costantino 等人· Expert Op in. Drug Discov. , 6 (2011) 1045)〇Serum Institute of India Ltd的IN1330MUM2010涉及制造適合于綴合的多糖片段的方法。US 6,045,805還 描述用于制備寡糖的方法。
[0003] 傷寒仍然是發(fā)展中國家中的嚴(yán)重疾病，其每年影響數(shù)百萬人（Crump JA等人， Bull. Wld. Hlth. Org. 82，346-353 (2004); Ochai RL等人 and the Domi Typhoid Study Group, Bull. Wld. Hlth. Org. 86，260-268 (2008))。在過去十年中，針對該疾 病已經(jīng)開發(fā)了綴合物疫苗。例如，NICHD/NIH開發(fā)了基于Vi(來自傷寒沙門氏菌腸血清變型 (Salmonella enterica serovar Typhi)的多糖)和rEPA蛋白載體的安全和高免疫原性綴 合物疫苗（Lanh等人，N. Eng. J. Med. 2003; Thiem等人，Clin Vac. Immunol. 2011; Szu, Expert Rev. Vaccines 12(11)，1273-1286 (2013))。許多論文討論Vi的免疫原性、 其綴合疫苗和被認(rèn)為迄今最佳的Vi鏈長（Szu等人，Infection and Immunity, 1989， 3823; Szu 等人，Infection and Immunity, 1991, 4555; Szu 等人 Infection and Immunity, 1994, 5545; Kossaczka等人，Infection and Immunity, 1999, 5806;Cui等 人，Clin. Vaccine Immunol·, 17 (2010)，73-79; Micoli等人，Vaccine, 29 (2011)， 712-720; An等人，Vaccine, 29 (2011)，7618-23; Rondini等人，Clin.Vaccine Immunol·, 18 (2011)，460-68; An等人，Vaccine,30 (2012)，1023-1028)。
[0004] 最近，Micoli等人 Vaccine 2012和Rondini等人，J. Infect. Dev Ctries， 2012已經(jīng)描述基于來自廣義地純化的弗氏梓檬酸桿菌(Citrobacter freundii )的Vi和 CRM197蛋白載體的傷寒沙門氏菌疫苗綴合物。當(dāng)在人中測試時(shí)，Vi-CRM197綴合物疫苗與未綴 合的Vi相比在單次免疫之后且以較低的劑量提供更高的抗Vi抗體應(yīng)答(van Damme等人， PlosOne 2011;在the 8th International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmonelloses, Bangladesh, March 2013呈現(xiàn)的進(jìn)一步結(jié)果）。然而，再次接種 之后的抗Vi應(yīng)答比初始應(yīng)答更低，且抗Vi持續(xù)性比期望更短(Bhutta等人Lancet Infect Dis, 14 (2014) 119)。
[0005] 因此仍然需要提供改進(jìn)的綴合物疫苗。
[0006] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及基于片段化的Vi多糖和載體蛋白的綴合物。具體而言，片段化的Vi多糖具 有40至55 kDa的平均分子量。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的綴合物的藥物組合物，包括 將本發(fā)明的綴合物或藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物的用于在所述哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答 的方法，包括將本發(fā)明的綴合物或藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物的用于在所述哺乳動(dòng)物中產(chǎn) 生基本上無 T非依賴性免疫應(yīng)答的T依賴性免疫應(yīng)答的方法，包括向有需要的受試者施用有 效量的本發(fā)明的綴合物或藥物組合物的用于在受試者中預(yù)防傷寒的方法，和用于制備所述 綴合物的方法。
[0007] 本發(fā)明的優(yōu)選綴合物應(yīng)當(dāng)能夠誘導(dǎo)記憶應(yīng)答，提供再次接種后的加強(qiáng)效應(yīng)和持續(xù) 的抗體水平。理想地，所述綴合物應(yīng)當(dāng)在所有年齡的群體、特別是2歲以下的兒童中是有效 的。
[0008] 附圖簡述 圖1顯示用于制備本發(fā)明的綴合物的合成步驟(PS =片段化的多糖;prot.=載體蛋 白；RC=N=CR'可以是任何碳二亞胺，例如，通常為1-乙基_3_(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺）。
[0009] 圖2顯示組1至10的小鼠中的免疫應(yīng)答。組1至4用包含片段化的Vi和作為載體蛋白 的CRM197的綴合物免疫，其中組1中的片段化的Vi具有9.5 kDa的平均分子量(avMW);組2中 的片段化的Vi具有22.8 kDa的avMff;組3中的片段化的Vi具有42.7 kDa的avMff;且組4中的 片段化的Vi具有82 kDa的avMW。組5用綴合至CRM197的天然Vi注射，組6至9分別用具有組1至 4的avMW的未綴合的片段化的Vi注射。組10接受天然Vi。
[0010] 圖3顯示傷寒沙門氏菌Vi多糖的重復(fù)單元，其中Ac是乙?；?br>[0011] 圖4顯示表明天然Vi和片段化的Vi(合并物1-4)中的0-乙?；牧康? NMR譜(在 NaOD 200 mM，在室溫，500 MHz)。
[0012] 圖5顯示天然Vi與片段化的Vi混合物相比的HPLC-SEC概況(214 nm)，且圖6顯示不 同avMW的四種片段化的Vi合并物（合并物1-4)。樣品在TSK凝膠3000 PW)(L柱上運(yùn)行，用 恥出卩04 100 1111 恥(：110011115%〇13〇~(口!17.2)以0.5 1111711^11洗脫；￥〇 10.663 11^11;￥仂七 23.326 min〇
[0013]圖7顯示片段化的Vi avMW 42.7 kDa的HPLC-SEC概況（214 nm) (TSK凝膠3000 PWXL柱，NaH2P〇4 100 mM NaCl lOOmM 5% CH3CN pH 7.2，0.5 mL/min; V。10.663 min; Vtot 23.326 min;使用葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品）。峰面積的80%在70和25kDa之間。
[0014]圖8顯示當(dāng)用全長未綴合的Vi、全長Vi綴合物和片段化的Vi綴合物免疫時(shí)，在野生 型小鼠相比于T細(xì)胞敲除(TCR )小鼠中觀察到的應(yīng)答。
[0015] 圖9顯示在綴合至CRM197、DT和ΤΤ的全長Vi綴合物和片段化的Vi綴合物中觀察到的 應(yīng)答。
[0016] 發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及包含綴合至載體蛋白的片段化的Vi的綴合物。
[0017] 為了解釋本說明書的目的，以下定義將適用，且在任何適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，以單數(shù)使用的 術(shù)語也包括復(fù)數(shù)，反之亦然。
[0018] 如本文所用，在本發(fā)明的上下文中（特別是權(quán)利要求的上下文中）使用的術(shù)語"一 (a)"和"一(an)"和"該(the)" "該"和類似術(shù)語應(yīng)被解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非本文 另有指明或與上下文明顯矛盾。
[0019] 關(guān)于數(shù)值X的術(shù)語"約"是任選的，且意指例如x± 1〇%。
[0020] 如本文所用，術(shù)語"Vi"或"Vi多糖"是指純化自檸檬酸桿菌的傷寒沙門氏菌腸血清 變型（Salmonella enterica serovar Typhi)的莢膜多糖（Rondini等人，J. Infect. Dev. Ctries, 2012)。
[0021] 如本文所用，術(shù)語"天然的多糖"是指還沒有經(jīng)過處理的多糖，所述處理的目的在 于降低所述多糖的大小。
[0022] 如本文所用，關(guān)于Vi多糖的術(shù)語"片段化的"是指已經(jīng)經(jīng)歷大小減小、因此降低多 糖的重復(fù)單元的數(shù)目的Vi多糖。因此，與天然的Vi相比，片段化的Vi具有較低的avMW。例如， 片段化的Vi可以包含30至300個(gè)重復(fù)單元，相比之下，天然的Vi包含超過600個(gè)重復(fù)單元。Vi 單體重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)顯示于圖3。在本發(fā)明的片段化的Vi中，優(yōu)選沒有觀察到與天然Vi相比 重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)的變化。這可以通過咕匪R分析來證實(shí)（參見圖4)。此外，片段化的Vi中的 0-乙?；陌俜?jǐn)?shù)優(yōu)選與天然Vi相同（即，約95%0_乙?；?，但可以變化，并降低至約65% 0-乙酰化。0-乙酰化可以通過標(biāo)準(zhǔn)測量諸如1H NMR、Hestriη比色法來測定。
[0023] 如本文所用，術(shù)語"合并物(pool)"是指具有定義的平均分子量范圍且可以通過標(biāo) 準(zhǔn)方法與彼此分離的片段化的Vi的組群。合并物由如本文所定義的片段化的Vi組成。
[0024] 在其天然大小中，Vi多糖具有約165kDa的通過HPLC大小排阻色譜法(HPLC-SEC)測 量的平均分子量。本發(fā)明中使用的片段化的Vi具有40至55 kDa之間的avMW。該值通過HPLC- SEC測量。通常，通過具有TSK凝膠PW)(L保護(hù)柱（4.0 cm X 6.0 mm;粒徑12 μπι;編號 808033)的 TSK 凝膠 3000 PWXL 柱（30 cm X 7.8 mm;粒徑 7 μπι;編號 808021)(Tosoh Bioscience)上使用葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品（5、25、50、80、150 kDa)運(yùn)行樣品而計(jì)算平均分子 量。流動(dòng)相是0.1 M NaCl, 0.1 M NaH2P〇4, 5% CH3CN, pH 7.2,流速為0.5 mL/min(等度方 法，持續(xù)30分鐘）。分別用λ-DNA (λ-DNA分子量標(biāo)記III 0.12-21.2 kb; Roche)和疊氮化鈉 (NaN3; Merck)進(jìn)行空隙和床體積校準(zhǔn)。
[0025]本發(fā)明的片段化的Vi可以進(jìn)一步分離成不同的平均分子量范圍的合并物。這可以 通過本領(lǐng)域中已知的方法諸如陰離子交換色譜、大小排阻色譜、切向流過濾來實(shí)現(xiàn)。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，片段化的Vi具有約40至55 kDa、更優(yōu)選42至53 kDa、 甚至更優(yōu)選45至50 kDa的avMW。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段化的Vi具有約41至49 kDa、優(yōu)選 41至48 kDa、更優(yōu)選42至46 kDa的avMW。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，片段化的Vi具有約43 kDa的 avMW。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，片段化的Vi具有51至55 kDa、優(yōu)選52至54 kDa的avMW。在進(jìn)一 步實(shí)施方案中，片段化的Vi具有約53 kDa的avMW。
[0027] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是，Vi或其片段的平均分子量可以根據(jù)測量的方法 而變化。如本文所述，對于平均分子量給出的值通過HPLC大小排阻色譜、通常使用本文所述 的柱、緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品來測量。然而，技術(shù)人員將理解，所使用的柱、緩沖液和/或標(biāo)準(zhǔn)品的 變化將影響計(jì)算的平均分子量。例如，當(dāng)使用具有AcquityUPLCBEH200 1.7 mm柱(4.6x 150 mm)的UPLC-SEC系統(tǒng)以0.45 mL/min測量時(shí)，天然Vi具有148 kDa的計(jì)算的avMff，相比之 下，當(dāng)使用本文描述的方法測量時(shí)，具有165 kDa的計(jì)算的avMW。因此，約+/- 10%的測量的 avMW的變化可以發(fā)生，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，本發(fā)明不受絕對值限制，但可以在 測量變化的范圍內(nèi)變化。
[0028] 本發(fā)明中使用的片段化的Vi的合并物具有特定平均分子量范圍分布，其可以在多 分散指數(shù)(PDI)方面進(jìn)一步表征。如下面方程中所示計(jì)算多分散指數(shù)： PDI = Mw / Μη 其中Mw是重均分子量且Μη是數(shù)均分子量。
[0029] 分子量分布越窄，PDI值越接近于1。
[0030]片段化的Vi的合并物可以具有特征在于合并物中的至少80%具有25 kDa和70 1^3之間的3￥]\^的3￥]\^分布。其可以具有特征在于合并物中的至少50%具有35 1^3和60 kDa之間的a vMW的a vMW分布。
[0031] 其可以具有特征在于合并物中的至少30 %具有41 kDa和55 kDa之間的avMW的 avMW分布。
[0032]片段化可以通過本領(lǐng)域中已知的許多方法實(shí)施，所述方法諸如天然多糖的化學(xué)水 解、天然多糖的酶促片段化、天然多糖的γ照射，或機(jī)械方法諸如天然多糖的超聲處理、高 壓均化器/微流化器/HP⑶s(高壓細(xì)胞破碎系統(tǒng)）。
[0033]選擇本發(fā)明中使用的片段化方法，使得其可以得到片段化的Vi，其具有小于80 kDa、優(yōu)選小于60 kDa、更優(yōu)選40和55 kDa之間的avMff。
[0034] 還優(yōu)選選擇方法，使得重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)沒有變化。
[0035] 優(yōu)選地，片段化不通過機(jī)械方法。優(yōu)選地，片段化不通過堿水解。
[0036] 本發(fā)明的片段化的Vi優(yōu)選通過用過氧化氫化學(xué)水解來獲得。使用該方法，據(jù)發(fā)現(xiàn)， Vi多糖大小可以減小，而不改變重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)。此外，用過氧化氫水解可以使得形成片段 化的Vi，其具有比使用機(jī)械方法時(shí)更低的平均分子量。
[0037] 如果本發(fā)明的片段化的Vi通過用過氧化氫的化學(xué)水解而獲得，則發(fā)現(xiàn)添加催化量 的氯化鐵(FeCl3)使得反應(yīng)能夠在較溫和條件(較低的溫度和較短的反應(yīng)時(shí)間）下工作。因 此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于將多糖片段化的方法，其包括在氯化鐵存在的情況下使 天然多糖與過氧化氫反應(yīng)的步驟。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于將Vi片段化的方 法，其包括在氯化鐵存在的情況下使天然Vi與過氧化氫反應(yīng)的步驟。甚至更具體地，該方法 包括使Vi與約3 %過氧化氫在水和0.1 mM氯化鐵中反應(yīng)。優(yōu)選地，反應(yīng)的溫度為約20-40 °C。
[0038] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于將多糖片段化的方法，其包括在硫酸亞鐵存在 的情況下使天然多糖與過氧化氫反應(yīng)的步驟。使用比FeCl3更可溶的硫酸亞鐵導(dǎo)致更可重 復(fù)的過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于將Vi片段化的方法，其包括在作為催化劑的 硫酸亞鐵存在的情況下使天然Vi與過氧化氫反應(yīng)的步驟。具體而言，該方法包括在0.1 mM 硫酸亞鐵存在的情況下使天然Vi與約0.5%過氧化氫在水中反應(yīng)。優(yōu)選地，反應(yīng)的溫度為約 20-40°C。通過該方法獲得的片段化的Vi優(yōu)選在用于本發(fā)明的綴合方法中前經(jīng)受加熱步驟 (約 80°C)。
[0039] 片段化通常隨后為純化。
[0040] 純化可以通過本領(lǐng)域中已知的方法來實(shí)施。通常，純化通過陰離子交換色譜進(jìn)行。
[0041] 純化通常得到不同的長度和不同的平均分子量范圍的片段化的Vi的"合并物"。
[0042] 本綴合物的載體蛋白可以選自CRM197或白喉類毒素。最優(yōu)選地，載體蛋白是CRM197。 圖9顯示綴合至CRM197、白喉類毒素(DT)和破傷風(fēng)類毒素(TT)的片段化的Vi的免疫應(yīng)答的差 異。對于片段化的Vi與CRM197和白喉類毒素(DT)的綴合物看到的應(yīng)答是T依賴性免疫應(yīng)答典 型的（第一次注射之后（第14和35天）的較低的免疫應(yīng)答，隨后為第二次注射之后（第49天） 的加強(qiáng)應(yīng)答）。相比之下，片段化的Vi與破傷風(fēng)類毒素(TT)的綴合物顯示對一個(gè)劑量的疫苗 的高抗體應(yīng)答，而無對第二劑量的明顯回憶應(yīng)答，這是當(dāng)顯著的T非依賴性應(yīng)答存在時(shí)觀察 到的發(fā)現(xiàn)。
[0043] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備包含片段化的Vi和選自CRM197或白喉類毒素的載體蛋 白的綴合物的方法，其包括以下步驟： a) 將Vi多糖片段化，以獲得具有40至55 kDa的avMW的片段化的Vi多糖； b) 使步驟a)中獲得的片段化的Vi多糖與碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺在5至6的pH反 應(yīng)，以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯 c) 使步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯與載體蛋白，以產(chǎn)生所述綴合物。
[0044] 本方法的一個(gè)實(shí)施方案描繪于圖1中。
[0045] 在本方法中，步驟a)任選隨后為純化步驟。純化步驟得到不同平均分子量范圍的 片段化的Vi合并物。具有40和55 kDa之間的平均分子量范圍的片段化的Vi合并物用于本方 法的步驟b)和c)中。
[0046]本方法的步驟b)中使用的碳二亞胺可以是任何合適的碳二亞胺，其能夠在水性介 質(zhì)中綴合糖和蛋白。通常，所使用的碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺） (EDAC)?；蛘撸梢允褂?-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺甲基-對-甲苯磺酸酯(CMC)。
[0047]在該方法的步驟b)中，片段化的Vi多糖優(yōu)選在C00H基團(tuán)方面以50 ymol/mL至200 ymol/mL的濃度存在。
[0048] 在該方法的步驟b)中，片段化的Vi的濃度可以是約15 mg/mL至約50mg/mL。片段化 的Vi的avMW越低，本方法的步驟b)中的Vi的濃度可以越高。
[0049] 反應(yīng)介質(zhì)中的碳二亞胺與片段化的Vi的⑶0H基團(tuán)的摩爾比可以在1:1至10:1之間 變化。其可以為5:1。片段化的Vi的C00H基團(tuán)的數(shù)目通常對應(yīng)于Vi重復(fù)單元的數(shù)目。
[0050] 在步驟b)中，片段化的Vi的羧酸基團(tuán)與碳二亞胺的反應(yīng)得到0-?；逯虚g體，其 進(jìn)而與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯。
[0051 ] 步驟b)中使用的NHS的濃度優(yōu)選為約0.1M至0.4M。
[0052]用于本發(fā)明的方法的反應(yīng)介質(zhì)通常是2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液。
[0053]用于步驟b)的反應(yīng)時(shí)間通常為約1小時(shí)。反應(yīng)溫度通常為約20_30°C。
[0054] 步驟b)中獲得的所得中間體（用酯基團(tuán)衍生的片段化的Vi)可以通過針對總糖含 量的HPAEC-PAD(具有脈沖安培檢測法的高效陰離子交換色譜）和針對NHS定量的離子對 HPLC-RP(反相HPLC)進(jìn)行分析。這允許測定活化的片段化的Vi重復(fù)單元（即，已經(jīng)與NHS反應(yīng) 的片段化的Vi)的％。優(yōu)選地，活化的片段化的Vi的％為10-50%，更優(yōu)選約20-30%。
[0055] 本方法的步驟b)中獲得的中間體可以任選通過在低pH脫鹽或乙醇沉淀進(jìn)行純化。
[0056] 在本方法的步驟c)中，本方法的步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯然后與載體 蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生包含片段化的Vi和所述載體蛋白的綴合物。
[0057] 載體蛋白是在制備用于疫苗中的綴合物中通常使用的蛋白。例如，載體蛋白可以 是CRM197或白喉類毒素。最優(yōu)選地，載體蛋白是CRM197。
[0058] 載體蛋白可以在與本方法的步驟b)中獲得的NHS酯反應(yīng)前進(jìn)行衍生化。蛋白載體 可以通常用酰肼衍生化。通常，載體蛋白用己二酸二酰肼(ADH)衍生化(如顯示于圖1)。
[0059] 如果CRM197用作本方法的步驟c)中的載體蛋白，Vi與CRM197的w/w比優(yōu)選為2:1至1: 2。例如，其可以是2:1、1:1或1:2。
[0060] 在本發(fā)明的方法的步驟c)中，反應(yīng)介質(zhì)中的衍生化的片段化的Vi(即，N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS)酯）的濃度可以是約5 mg/mL至約10 mg/mL。片段化的Vi的平均分子量越低，本 方法的步驟c)中的NHS-酯的濃度可以越高。
[0061] 用于本發(fā)明的方法的步驟c)的反應(yīng)時(shí)間通常為約2小時(shí)。用于本發(fā)明的方法的步 驟c)的反應(yīng)溫度通常為約20-30°C。已知方法可以用于評價(jià)反應(yīng)的完成。
[0062] 綴合步驟c)優(yōu)選在MES緩沖液(pH 6)中、通常以約20mM的濃度進(jìn)行。
[0063]在本方法的步驟c)中，pH優(yōu)選為約6。該pH值低于當(dāng)在綴合化學(xué)法中使用NHS時(shí)報(bào) 道的pH值。不希望受理論束縛，據(jù)信，在該pH范圍中，NHS水解比在較高pH時(shí)更慢，導(dǎo)致更有 效的綴合過程。
[0064] 通過本方法獲得的綴合物可以經(jīng)受進(jìn)一步純化過程。例如，所述綴合物可以通過 大小排阻色譜或切向流過濾、疏水色譜或離子交換色譜進(jìn)行純化。
[0065] 在本方法中，步驟b)中使用的碳二亞胺和NHS的存在允許具有高綴合效率，而不改 變片段化的Vi重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)。如果僅使用碳二亞胺諸如EDAC(即，不存在NHS)，則需要高 濃度的所述碳二亞胺以使得該方法有效。此外，產(chǎn)生片段化的Vi的C00H基團(tuán)上的N-?；?基團(tuán)，修飾多糖結(jié)構(gòu)且改變其表位。NHS的使用避免這些衍生物的形成。用本方法，片段化的 Vi綴合物中的這些衍生物的百分?jǐn)?shù)以摩爾計(jì)小于2% (Vi的碳二亞胺/C00H)，并且殘留的酯 基以摩爾計(jì)也小于1 %。
[0066] 由本方法獲得的綴合物的特征還在于游離的、即未綴合的片段化的Vi的量，其為 小于20%，優(yōu)選小于15%，更優(yōu)選小于5%。優(yōu)選地，沒有檢測到游離的片段化的Vi。此外，優(yōu) 選沒有檢測到游離的蛋白。本發(fā)明的綴合物可以進(jìn)一步特征在于它們片段化的Vi與載體蛋 白比。例如，片段化的Vi:蛋白載體的w/w比可以是約1.5:1至約1:3。這些比率可以根據(jù)所使 用的片段化的Vi的平均分子量范圍而變化。它們也可以根據(jù)所使用的載體蛋白而變化。當(dāng) CRM197用作蛋白載體時(shí)，Vi與CRM197的w/w比可為約0.33至約1.33。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案 中，其為約0.33。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其為約0.52。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其 為約0.64。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其為約1.33。
[0067]當(dāng)白喉類毒素(DT)用作蛋白載體時(shí)，Vi與DT的w/w比可為約0.85。
[0068] 本發(fā)明的綴合物優(yōu)選具有至少60%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%0_乙 ?；?。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物具有約95% 0-乙?；?。這與天然Vi的 0-乙?；喈?dāng)，并且證實(shí)片段化不改變片段化的Vi單體重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)。
[0069] 0-乙酰化的百分?jǐn)?shù)可以通過本領(lǐng)域中已知的方法諸如1Η匪R、Hestriη比色法來 測量。
[0070]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含5至25 yg片段化的Vi。在本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含8 yg片段化的Vi。
[0071 ]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物中的載體蛋白是CRM197。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，所述綴合物包含5至25 yg CRM197。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物包含10至15 yg CRMi97〇
[0072] 在本發(fā)明的一種綴合物中，片段化的Vi的量為8 yg，且CRM197的量為12.5 yg。
[0073] 本發(fā)明的綴合物可以通過本文所述的方法進(jìn)一步獲得。因此，可通過本發(fā)明的方 法獲得的綴合物也是本發(fā)明的一部分。
[0074] 本發(fā)明的綴合物可以進(jìn)一步加工成藥物組合物。因此，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明 的綴合物組合藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載 體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細(xì)菌 劑、抗真菌劑）、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑 劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等及其組合，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知（參見，例如，G e η n a r 〇 (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy.第20版，ISBN: 0683306472)。除了任何常規(guī)載體與活性成分不相容的范圍以外，考慮其在治療或藥物組合 物中的用途。
[0075] 術(shù)語"治療有效量"的本發(fā)明的化合物是指本發(fā)明的綴合物將引起受試者的生物 學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答或預(yù)防疾病等的量。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，術(shù)語"治療有效量"是指本 發(fā)明的化合物當(dāng)施用于受試者時(shí)有效預(yù)防由傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的病況或病癥或疾病的量。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"受試者"是指動(dòng)物。通常，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。受試者還是指 例如靈長類(例如，人，男性或女性）、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、魚、禽類等。 在某些實(shí)施方案中，所述受試者是靈長類。在還有其它實(shí)施方案中，所述受試者是人。
[0077] 微生物感染影響身體的各個(gè)區(qū)域，所以可將本發(fā)明的組合物以各種形式制備。例 如，可將所述組合物制備為可注射劑，作為液體溶液或懸浮液。也可制備適合在注射前溶解 或懸浮于液體媒介物中的固體形式。所述組合物可以制備用于局部施用，例如作為軟膏劑、 乳膏劑或粉末劑。所述組合物可制備用于口服施用，例如作為片劑或膠囊，或作為糖漿劑 (任選地調(diào)味）?？蓪⑺鼋M合物制備為使用細(xì)粉或噴霧進(jìn)行肺部施用，例如作為吸入劑?？?將所述組合物制備為栓劑或陰道栓。可將所述組合物制備用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如 作為滴劑，作為噴霧劑，或作為粉劑?？蓪⑺鼋M合物包括于漱口水中?？蓪⑺鼋M合物凍 干。
[0078]所述藥物組合物優(yōu)選是無菌的。其優(yōu)選無熱原。優(yōu)選將其緩沖在例如pH6至pH8、通 常約PH7。
[0079] 本發(fā)明的組合物可以包含本發(fā)明的綴合物和鹽水。
[0080] 本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的藥物組合物的遞送裝置。所述裝置可以是例如，注射 器或吸入器。
[0081] 本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為免疫原性組合物，因?yàn)樗鼈儼庖哂行Я康亩嗵敲?疫原。"免疫有效量"意指以單一劑量或作為一系列劑量的部分向個(gè)體施用該量對于預(yù)防是 有效的。該量取決于待治療個(gè)體的健康和身體狀況、待治療個(gè)體的年齡、分類組(例如非人 靈長類動(dòng)物、靈長類動(dòng)物等）、個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、期望的保護(hù)程度、疫苗制 劑、治療醫(yī)生對醫(yī)學(xué)情況的評估和其他相關(guān)因素而不同。預(yù)期所述量將落入可通過常規(guī)試 驗(yàn)確定的相對寬范圍內(nèi)。預(yù)期1 μ g至2 0μ g的劑量的糖，例如約5μ g /劑量。劑量處理可以是單 劑量時(shí)間表或多劑量時(shí)間表(例如包括加強(qiáng)劑量）。所述組合物可以與其它免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合 施用。
[0082] -旦配制，可以將本發(fā)明的組合物直接施用于受試者。待治療的受試者可以是動(dòng) 物;具體而言，可以治療人受試者。
[0083] 通常預(yù)防性使用本發(fā)明的免疫原性組合物(即預(yù)防未來的感染）。
[0084] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可以未佐劑化。
[0085] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物可以包括佐劑。所述佐劑可以用于增強(qiáng)在 接受所述組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞）。可以與本發(fā)明使用的佐劑包 括，但不限于： ?含有礦物質(zhì)（包括鈣鹽和鋁鹽（或其混合物））的組合物。鈣鹽包括磷酸鈣（例如US 6355271中公開的"CAP"顆粒）。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等，其中所述鹽采用任何 合適形式(例如凝膠、結(jié)晶、無定形等）。優(yōu)選吸附至這些鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物配 制為金屬鹽的顆粒W02000/0023105。可使用已知為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是 常規(guī)的，但僅出于方便使用，因?yàn)槠渚皇谴嬖诘膶?shí)際化合物的準(zhǔn)確描述（例如參見 Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995,第9章）。本發(fā)明可使用通常用作佐劑的任何〃氫氧化物〃或〃磷酸鹽〃 佐劑。稱為〃氫氧化錯(cuò)〃的佐劑通常是羥基氧化錯(cuò)鹽(aluminum oxyhydroxide salts)(通常 至少部分為晶體）。已知為"磷酸鋁"的佐劑通常是羥基磷酸鋁，經(jīng)常還含有少量硫酸（即硫 酸羥基磷酸鋁）。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽 中的羥基的程度。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁兩者的混合物。在這種情況下，可以存在 比氫氧化鋁更多的磷酸鋁，例如重量比為至少2:1，例如，2 5:1、26:1、27:1、28:1、>9: 1等。施用于患者的組合物中A1+3的濃度優(yōu)選小于10mg/ml，例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、< 3mg/ ml、< 2mg/ml、< lmg/ml等。優(yōu)選的范圍是0.3-lmg/ml。優(yōu)選0.85mg/劑量的最大值。
[0086] .阜苷（Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995，第22章），其為在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根和甚 至花中發(fā)現(xiàn)的留醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹 (Quillaia saponaria Molina)樹皮的阜苷。阜苷也可商業(yè)獲得自麗花菝葜（Smilax ornata)(墨西哥菝葜）、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花）和肥阜草（Saponaria officianalis)(皂根）。皂苷佐劑制劑包括純化制劑諸如QS21，以及脂質(zhì)制劑諸如ISC0M。 QS21作為Stimulon TM銷售。已使用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)的 特定純化級分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。優(yōu)選地，所述皂苷為QS21。產(chǎn) 生QS21的方法公開于US 5,057,540。皂苷制劑也可包含甾醇，諸如膽固醇(W096/33739)。皂 苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物（ISC0M)的獨(dú)特顆粒(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995,第 23章 hISCOM通常還包括磷脂，諸如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于 ISC0M中。優(yōu)選地，ISC0M包括QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。TO96/33739和EP 0109942中 進(jìn)一步描述了 ISC0M。任選地，ISC0M可不含額外去污劑W000/07621。開發(fā)基于皂苷的佐劑的 綜述可參見參考文獻(xiàn)Barr等人·（1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271 & Sjolanderet等人·（1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338。
[0087] ?細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(例如大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素"CT"或百 日咳毒素"PT"）及其脫毒的衍生物，諸如稱為LT-K63和LT-R72的突變體毒素(Pizza等人 (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461)。脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的 用途描述于W095/17211，且作為胃腸外佐劑的用途描述于W098/42375。
[0088] ?生物粘附劑和粘膜粘附劑，諸如酯化的透明質(zhì)酸微球(Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276)或殼聚糖及其衍生物(W099/27960)。
[0089] ?優(yōu)選由生物可降解且無毒的材料(例如，聚(α-羥酸）、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚 酐、聚己內(nèi)酯等）與丙交酯乙交酯共聚物形成的微粒（即直徑為~lOOnm至~150μπι，更優(yōu)選 直徑~200nm至~30μηι，直徑~500nm至~ΙΟμπι的顆粒），其任選經(jīng)處理以具有帶負(fù)電表面 (例如用SDS處理)或帶正電表面（例如用陽離子去污劑諸如CTAB處理）。
[0090].脂質(zhì)體（Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯 Powell & Newman) Plenum Press 1995，第13 & 14章）。適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的實(shí) 例描述于US 6,090,406和US 5,916,588。
[0091] ?胞壁酰肽，諸如N-乙?；邗?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺（"thr-MDP"）、N-乙酰 基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙?；咸前坊?N-乙酰基胞壁酰- L-A1-D-異谷氨酸-L-Ala-二棕櫚酰氧基丙基酰胺（"DTP-DPP"或"Theramide TM "）、N-乙酰基 胞壁酰-L-丙酰胺-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(^ -2'二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷?；?氧基)-乙胺（"MTP-PE"）。
[0092] . Polyoxidonium聚合物（Dyakonova等人（2004) Int Immunopharmacol 4(13): 1615-23)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
[0093] . CD 1 d配體，諸如α-糖基神經(jīng)酰胺（De Li ber〇 等人，Natur e Re v i ews Immunology, 2005，5: 485-496和US 5,936,076)(例如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺）、含有植物 鞘氨醇的a-糖基神經(jīng)酰胺、0CH、KRN7000 [(25,35,410-1-0-(€[-0-半乳吡喃糖基)-2-0-二 十六烷基(hexacosanoyl)氨基)-1，3,4_十八烷三醇]、CR0NY-101、3''_0-硫代-半乳糖基神 經(jīng)酰胺等。
[0094] . γ 菊粉（Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6 : 559-80)或其衍生物，諸如 algammulin〇
[0095] ?水包油乳液。各種此類乳液是已知的，并且它們通常包括至少一種油和至少一 種表面活性劑，其中所述油和表面活性劑是可生物降解的（可代謝的）和生物相容的。乳液 中的油滴直徑通常小于5μπι，并且可以甚至具有亞微米直徑，用微流化床實(shí)現(xiàn)這些小尺寸以 提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)檫@些液滴可以進(jìn)行過濾除菌。
[0096] ?免疫刺激寡核苷酸，諸如含有CpG基序的(含有通過磷酸鍵連接至鳥苷殘基的未 甲基化的胞嘧啶殘基的二核苷酸序列)或含有CpI基序的(含有連接至肌苷的胞嘧啶的二核 苷酸序列）的免疫刺激寡核苷酸、或雙鏈RNA或含有回文序列的寡核苷酸或含有聚(dG)序列 的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修飾/類似物諸如硫代磷酸酯修飾，且可 以是雙鏈或（除了RNA)單鏈的。參考文獻(xiàn)Kandimalla等人·（2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400和W099/62923公開了可能的類似物取代，例如用2 脫氧-7-脫氮 鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)諸如Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835、McCluskie等人 (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185、W098/40100、US 6， 207，646、US 6,239,116,、US 6,429,199中進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列 可針對TLR9,諸如基序GTCGTT或TTCGTT (Kandimalla等人（2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3) :654-658) <XpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，諸如CpG_A 〇DN(寡脫氧核苷酸），或其可更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，諸如CpG-B 0DN。參考文獻(xiàn)Blackwell 等人（2003) J Immunol 170:4061-4068、Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65、 TOO 1 /95935中討論了 CpG-Α和CpG-B 0DN。優(yōu)選地，CpG為CpG-Α 0DN。優(yōu)選地，構(gòu)建CpG寡核苷 酸，使得5 '末端可被受體識別。任選地，將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列在其3 '末端連接以形成"免 疫聚體（immunomers)"。參見例如參考文獻(xiàn)Kandimalla等人（2003) BBRC 306:948-953、 Bhagat等人（2003) BBRC 300:853-861 和W003/035836。一種有用的 CpG佐劑是CPG7909,也 稱為ProMune ? (Coley Pharmaceutical Group，Inc ·)。另一種是CpG1826。作為使用CpG 序列的替代方案，或除了使用CpG序列以外，可以使用TpG序列(W001/22972)，且這些寡核苷 酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可富含嘧啶。例如，其可包含多于一 個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶核苷酸(例如TTTT，如參考文獻(xiàn)W001/22972中所公開），和/或其可具有含 有>25% (例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)胸苷的核苷酸組成。例如，其可 包含多于一個(gè)連續(xù)的胞嘧啶核苷酸(例如CCCC，如參考文獻(xiàn)W001/22972中所公開），和/或其 可具有含有>25% (例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等）胞嘧啶的核苷酸組 成。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸將通常包含至少20個(gè) 核苷酸。它們可包含少于100個(gè)核苷酸。
[0097]基于免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑已知為IC-31 TM (Schellack等人 (2006) Vaccine 24:5461-72)。因此，與本發(fā)明使用的佐劑可包含以下的混合物：（i)包括 至少一個(gè)(且優(yōu)選多個(gè))CpI基序的寡核苷酸（例如15-40個(gè)核苷酸），和（ii)聚陽離子聚合 物，諸如包括至少一個(gè)(且優(yōu)選多個(gè))Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20個(gè)氨基酸）。所 述寡核苷酸可以是包含26聚體序列5'-(IC)13-3'的脫氧核苷酸。所述聚陽離子聚合物可以 是包含11聚體氨基酸序列Lys-Leu-Lys-Leu5_Lys-Leu-Lys的肽。
[0098] . 3-0-脫酰基化的單磷酰脂質(zhì)A('3dMPL'，也稱為'MPL? '）（Myers等人（1990) Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions的第145-156頁，Ulrich (2000) Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine系列的第42卷）的第16章（第273-282頁），Johnson等人（1999) J Med Chem 42:4640-9和Baldrick等人（2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398- 413)。在水性條件下，3dMPL可以形成具有不同大小的膠束聚集體或顆粒，例如具有<150nm 或>500nm的直徑。這些中的任一者或兩者均可以用于本發(fā)明，且可以通過常規(guī)測定選擇更 好的顆粒。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用較小的顆粒（例如足夠小以提供澄清的3dMPL的水性懸浮 液），這是因?yàn)樗鼈儍?yōu)異的活性(W0 94/21292)。優(yōu)選的顆粒具有小于220nm、更優(yōu)選小于 200nm或小于150nm或小于120nm的平均直徑，且甚至可以具有小于100nm的平均直徑。然而， 在大多數(shù)情況下，平均直徑將不小于50nm。
[0099] .甲基肌苷 5'-單磷酸酯（"MIMP"）（Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmaco1 3(8):1177-86)〇
[0100] ?多聚羥化吡咯雙烷化合物(W02004/064715)，諸如具有下式的化合物： ，戶、η .… 較 ^ 0Η V抵w 0：HgOH! 其中R選自氫、直鏈或支鏈的、未取代的或取代的、飽和的或不飽和的酰基、烷基(例如 環(huán)烷基）、烯基、炔基和芳基或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。實(shí)例包括，但不限于:木麻黃 素(casuarine)、木麻黃素-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃素、7-表-木麻黃素、3，7-二表- 木麻黃素等。
[0101] .咪唑并喹啉化合物，諸如咪喹莫特（"R-837"）（US 4,680,338、US 4,988,815)、 瑞喹莫德（"R-848"）(W092/15582)和它們的類似物;及其鹽(例如鹽酸鹽）。關(guān)于免疫刺激性 咪唑并喹啉類的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可見參考文獻(xiàn)Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571- 577、Wu等人（2004) Antiviral Res· 64(2):79_83、Vasilakos等人（2000) Cell Immunol. 204(1):64-74、美國專利4689338、4929624、5238944、5266575、5268376、5346905、5352784、 5389640、5395937、5482936、5494916、5525612、6083505、6440992、6627640、6656938、 6660735、6660747、6664260、6664264、6664265、6667312、6670372、6677347、6677348、 6677349、6683088、6703402、6743920、6800624、6809203、688800(^P6924293W&Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218。
[0102] ?縮氨基硫脲化合物，諸如參考文獻(xiàn)W02004/060308中公開的那些。活性化合物的 配制、制備和篩選的方法也描述于其中。縮氨基硫脲類在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞 因子諸如TNF-α中特別有效。
[0103] ?色胺酮化合物，諸如參考文獻(xiàn)W02004/064759中公開的那些?；钚曰衔锏呐?制、制備和篩選的方法也描述于其中?？s氨基硫脲類在刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因 子諸如TNF-a中特別有效 ?核苷類似物，諸如：（a)艾沙托立賓（Isatorabine) (ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷）：
[0104] .及其前藥；（b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻(xiàn)US 6,924,271、 US2005/0070556、US 5,658,731中公開的化合物。洛索立賓(7-烯丙基-8-氧代鳥苷）（美國 專利5,011,828)。
[0105] ?參考文獻(xiàn)W02004/87153中公開的化合物，包括:?；哙夯衔铩⑦胚岫?物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑 喹啉酮(ABIQ)化合物（US 6,605,617、1002/18383)、水合酞酰胺(取(1抑？丨1^13111丨(16)化合 物、二苯甲酮化合物、異噁唑化合物、留醇化合物、喹唑啉酮(Quinazi 1 inone)化合物、P比略 化合物(W02004/018455)、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物和吲 哚(Benzazole)化合物(W003/082272)。
[0106].氨基烷基葡糖苷磷酸酯衍生物，諸如RC-529[Johnson等人（1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278，Evans等人（2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229)。
[0107] ?磷腈，諸如聚[二（羧基合苯氧基）磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy) phosphazene])( "PCPP"），如例如描述于參考文獻(xiàn)Andrianov等人（1998) Biomaterials 19:109-115 and Payne等人（1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
如定義于W003/011223,諸如'ER 803058'、'ER 803732'、'ER 804053'、ER 804058'、 'ER 804059，、'ER 804442，、'ER 804680，、'ER
804764'、ER 803022或'ER 804057'，例如：
來自大腸桿菌的脂質(zhì)A的衍生物，諸如OM-174 (描述于參考文獻(xiàn)Meraldi等人（2003) Vaccine 21:2485-2491 & Pajak等人（2003) Vaccine 21:836-842)。
[0108] ?含有連接至含有磷酸酯的非環(huán)骨架的脂質(zhì)的化合物，諸如TLR4拮抗劑E5564 (Wong等人（2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42, US2005/0215517):
這些和其它佐劑-活性物質(zhì)在參考文獻(xiàn)Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995 & Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols中更詳細(xì)討論。
[0109] 組合物中的抗原和佐劑通常處于混合物中。
[0110] 組合物可包括所述佐劑中的兩種或更多種。例如，它們可有利地包括水包油乳液 和3dMPL兩者，等。
[0111] 可與本發(fā)明使用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于： ?角藍(lán)稀、Tween80和Span 85的亞微米(submicron)乳液。所述乳液的體積組成可以是 約5 %角鯊烯、約0.5 %聚山梨醇酯80和約0.5 % Span 85。在重量方面，這些比率變?yōu)?.3 % 角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80和0.48%Span 85。這種佐劑已知為'MF59'（W090/14837, Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203, Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680)，如Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (編輯Powell & Newman) Plenum Press 1995的第10章和Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)的第12章中更詳細(xì)描述。MF59乳液有利地包括梓檬酸根離子，例如lOmM 檸檬酸鈉緩沖液。
[0112] ?角鯊烯、生育酚和TweenSO的乳液。所述乳液可包括磷酸鹽緩沖鹽水。它也可包 括Span 85 (例如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可具有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0.3- 3%TWeen80,且角鯊烯：生育酚的重量比優(yōu)選< 1，因?yàn)檫@提供更穩(wěn)定的乳液。角鯊烯和 TWeen80可以約5:2的體積比存在。可通過以下制備一種此類乳液:將1'冊的80溶解于?85以 產(chǎn)生2 %溶液，然后混合90ml該溶液與（5g DL-α-生育酚和5ml鯊烯）的混合物，然后微流化 該混合物。所得乳液可具有亞微米油滴，例如平均直徑為100_250nm，優(yōu)選約180nm〇
[0113] .角鯊烯、生育酚和Triton去污劑(例如Triton X-100)的乳液。所述乳液也可包 括3d-MPL(參見下文）。所述乳液可含有磷酸鹽緩沖液。
[0114] .包含聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯80)、1^如11去污劑(例如1^如11乂-100)和 生育酚(例如生育酚琥珀酸酯）的乳液。所述乳液可包括質(zhì)量比約75:11:10的這三種組分 (例如75(^8/!111聚山梨醇酯80、11(^8/11111^切11乂-100和10(^8/1111€[-生育酚琥珀酸酯），并 且這些濃度應(yīng)當(dāng)包括來自抗原的這些組分的任何貢獻(xiàn)。所述乳液也可包括角鯊烯。所述乳 液還可包括3d-MPL(參見下文）。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。
[0115] ?角鯊烯、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401("普朗尼克? L121"）的乳液。所述乳液 可在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水中配制。該乳液是胞壁酰二肽的有用遞送媒介物，且已在 "SAF-Γ佐劑(Allison & Byars (1992) Res Immunol 143:519-25)中與蘇氨酰-MDP-起 使用（0.05-1 % Thr-MDP，5%角鯊烯，2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)。它也可 以不與Thr-MDP使用，如"AF"佐劑(Hariharan等人（1995) Cancer Res 55:3486-9)(5%角 鯊烯，1.25%普朗尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)中。優(yōu)選微流化。
[0116] .具有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳液。如 TO95/11700中所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰 肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心、磷脂。亞微米液滴尺寸是有利的。
[0117] ?不可代謝油（諸如輕礦物油）和至少一種表面活性劑（諸如卵磷脂，TweenSO或 Span 80)的亞微米水包油乳液。可包括添加劑，諸如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂綴合物 (諸如US 6,080,725中所述通過經(jīng)由葡萄糖醛酸的羧基將脂族胺添加至脫?；碥斩a(chǎn)生 的GPI-0100)、二甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。
[0118] ?其中皂苷（例如Qu i 1A或QS21)和甾醇（例如膽固醇）結(jié)合為螺旋膠束的乳液 (W02005/097181)。
[0119] 本發(fā)明還提供本發(fā)明的綴合物，其用于醫(yī)藥中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 的綴合物用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗體應(yīng)答。
[0120] 本發(fā)明還提供用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括將本發(fā)明的綴合物 或藥物組合物施用于所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明還提供用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生基本上無 T非依 賴性免疫應(yīng)答的T依賴性免疫應(yīng)答的方法，其包括將本發(fā)明的綴合物或藥物組合物施用于 所述哺乳動(dòng)物。
[0121] 本發(fā)明還提供本發(fā)明的綴合物或藥物組合物在制備用于預(yù)防疾病的疫苗中的用 途。
[0122] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的綴合物在制備用于預(yù)防哺乳動(dòng)物中的 傷寒的藥物中的用途。
[0123] 通過這些方法和用途產(chǎn)生的免疫應(yīng)答將通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng) 答。用于評價(jià)糖免疫之后的抗體應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，ELISA測定(酶聯(lián) 免疫吸附測定)通常用于測量抗Vi IgG應(yīng)答?？贵w應(yīng)答優(yōu)選是IgG應(yīng)答，具有糖綴合物疫苗 特有的從IgM轉(zhuǎn)換至IgG的典型同種型。免疫應(yīng)答通常是預(yù)防性的。哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人。
[0124] 本發(fā)明的綴合物被認(rèn)為與其中Vi多糖還沒有片段化的綴合物相比在生成T依賴性 應(yīng)答中是更有效的。"T依賴性"應(yīng)答意指能夠誘導(dǎo)再次注射之后的抗Vi應(yīng)答(典型的回憶應(yīng) 答)的增加的綴合物。"基本上無 T非依賴性應(yīng)答的T依賴性應(yīng)答"意指綴合物不能在T細(xì)胞敲 除小鼠中誘導(dǎo)抗V i應(yīng)答。
[0125] 生成T依賴性應(yīng)答的綴合物被認(rèn)為相比于生成T非依賴性應(yīng)答的綴合物是有利的， 因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)T非依賴性應(yīng)答不誘導(dǎo)記憶，被認(rèn)為在2歲以下的兒童中是次優(yōu)的，不會導(dǎo)致 二級淋巴組織的生發(fā)中心中的體細(xì)胞高變和因此抗體應(yīng)答的親和力成熟（參見例如 Pollard A.J.等人，Nat. Rev. Immunol·, 2009; 9: 213)。此外，T非依賴性應(yīng)答可以誘 導(dǎo)對后續(xù)接種的低應(yīng)答的狀態(tài)（參見例如Poolman J.等人，Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 307)。
[0126] 本發(fā)明的綴合物似乎生成T依賴性應(yīng)答，如圖2和圖8中所示。圖2顯示本發(fā)明的片 段化的Vi綴合物與天然Vi綴合物相比和與未綴合的天然和片段化的Vi相比在小鼠中的抗 Vi抗體應(yīng)答。所使用的材料的描述在實(shí)施例5的表中給出。可以看到，對于組1至4(對應(yīng)于綴 合至CRM197的片段化的Vi合并物1至4)，盡管在第14天(T14)與天然Vi綴合物(組5)相比抗Vi IgG應(yīng)答更低(與天然Vi相比對于合并物1-3顯著，分別p = 0.0418，〈0.0001，0.0297)，但在 第35天(T49)在第二次注射后兩周觀察到可注意到的加強(qiáng)作用(p = 0.004-0.008)。如圖2 中所示，增加的抗Vi在第一次注射之后被天然Vi-CRM197 (組5)誘導(dǎo)，且在第二次注射之后 沒有增加。當(dāng)使用較低劑量的天然Vi_CRM197綴合物(0.044狀、0.35 yg和2.8 yg -數(shù)據(jù)未 顯示)時(shí)，還觀察到這種第二次注射之后的增加的缺乏，表明抗體水平的增加的缺乏不是由 于一個(gè)劑量之后誘導(dǎo)最大應(yīng)答。可以推測，對天然Vi綴合物的應(yīng)答是由于長天然Vi鏈充當(dāng)T 非依賴性抗原的能力。這得到以下事實(shí)支持:未綴合的天然Vi (組10)能夠誘導(dǎo)比較短Vi鏈 (組6至9)更高的應(yīng)答，即使比天然Vi綴合物(組5)更低。相反，片段化的Vi綴合物(組1至4) 在第14天誘導(dǎo)較低響應(yīng)，其通過第二次注射進(jìn)一步增加，在兩個(gè)劑量之后達(dá)到與天然Vi綴 合物相當(dāng)?shù)目筕i IgG抗體滴度。當(dāng)與具有較低平均分子量的片段化的Vi綴合物(組1至3)和 天然Vi綴合物(組5)相比時(shí)，特征在于82 kDa的Vi鏈長的組4綴合物顯示中間行為。事實(shí)上， 在第14天的應(yīng)答比用更短的片段化的Vi綴合物更高，且比用天然Vi綴合物沒有顯著不同。
[0127] 如圖2中所示，與天然Vi(組10)相比，未綴合的片段化的Vi誘導(dǎo)減弱的Vi IgG抗體 應(yīng)答(組6至9)。對天然Vi(165kDa)的應(yīng)答高于對片段化的Vi(82kDa -組9)的應(yīng)答，其進(jìn)而 高于對片段化的￥丨（分別9.5 1^)&，22.8 1^)&，42.7 1^^-組6至8)的應(yīng)答(在第14天，未綴 合的片段化的Vi合并物1至3誘導(dǎo)的應(yīng)答相對于天然Vi顯著更低，其中分別p = 0.0004， 0.0056,0.0403)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了臨界鏈長（約82 kDa)，低于該鏈長，Vi多糖不 再能夠充當(dāng)T非依賴性抗原。優(yōu)選從不能誘導(dǎo)T非依賴性抗原特征的應(yīng)答的多糖制備的Vi- 綴合物。
[0128] 為了驗(yàn)證對于未綴合的片段化的Vi引發(fā)T非依賴性抗體應(yīng)答的能力受損害且片段 化的Vi綴合物能夠誘導(dǎo)基本上無 T非依賴性應(yīng)答的T依賴性應(yīng)答的假設(shè)，在T細(xì)胞敲除小鼠 (TCR βδ-小鼠）中測試片段化的Vi-CRM197和天然Vi-CRM197綴合物。如圖8中可見，T細(xì)胞敲 除小鼠僅對未綴合和綴合的全長Vi應(yīng)答，但沒有對片段化的Vi綴合物應(yīng)答。此外，與T細(xì)胞 敲除小鼠中相比，綴合、但非未綴合的天然Vi能夠在野生型中誘導(dǎo)更高的應(yīng)答(p=0.028,第 14天;p=0.002，第42天），表明野生型小鼠中的高應(yīng)答源自混合的T依賴性/T非依賴性活性。
[0129] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生基本上無 T非依賴性免疫應(yīng) 答的T依賴性免疫應(yīng)答的方法，其包括將本發(fā)明的綴合物或藥物組合物施用于所述哺乳動(dòng) 物。
[0130] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)多糖綴合物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的 方法。所述方法包括： a) 鑒定未綴合的多糖停止誘導(dǎo)顯著的抗Vi IgG抗體應(yīng)答的平均分子量值； b) 產(chǎn)生平均分子量低于步驟a)中確定的值的多糖的綴合物，和 c) 將步驟b)中獲得的綴合物施用于哺乳動(dòng)物。
[0131] 本發(fā)明的綴合物（即含有綴合至如本文所定義的載體蛋白的片段化的Vi)，在誘導(dǎo) 適當(dāng)?shù)目贵w應(yīng)答中，比未綴合的片段化的Vi更有效(參見圖2)。
[0132] 本發(fā)明的組合物將通常直接施用于受試者。直接遞送可通過腸胃外注射(例如皮 下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或至組織間隙），或通過直腸、經(jīng)口、陰道、局部、透真皮、真皮內(nèi)、經(jīng) 目艮、經(jīng)鼻、經(jīng)耳或經(jīng)肺施用完成。優(yōu)選注射或鼻內(nèi)施用。
[0133] 本發(fā)明可用于引發(fā)全身和/或粘膜免疫。
[0134] 根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童(包括嬰兒）和成人兩者。因此，受試者可 以為小于1歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的優(yōu)選受試者為年輕人(例如 <5歲）。然而，所述疫苗不僅適用于這些組，還可更廣泛地用于人群中。
[0135] 治療可通過單劑量時(shí)間表或多劑量時(shí)間表。多劑量可用于初次免疫時(shí)間表和/或 加強(qiáng)免疫時(shí)間表。在多劑量時(shí)間表中，各個(gè)劑量可通過相同或不同的途徑(例如腸胃外引發(fā) 和粘膜加強(qiáng)，粘膜引發(fā)和腸胃外加強(qiáng)等)給予。多于一個(gè)劑量(通常兩個(gè)劑量或三個(gè)劑量)的 施用尤其可用于免疫幼稚的患者。多個(gè)劑量將通常間隔至少1周（例如約2周、約3周、約4 周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)進(jìn)行施用。一個(gè)實(shí)例時(shí)間表在6周齡時(shí)提供第 一劑量，且在10周齡時(shí)提供第二次劑量，以便與現(xiàn)有嬰兒免疫一致(與EPI疫苗共施用）。該 初始時(shí)間表可以隨后為兒童的第一個(gè)生日之后的加強(qiáng)劑量。
[0136] 可將本發(fā)明的綴合物與其它抗原組合成用于針對多種病原體同時(shí)免疫的單一組 合物。作為制備組合疫苗的替代方案，可將綴合物與其他疫苗基本上同時(shí)(例如在到醫(yī)療保 健專業(yè)或接種中心的同一醫(yī)學(xué)會診或診視期間）施用于受試者。用于這些組合疫苗中或用 于伴隨施用的抗原包括，例如，來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、金黃色葡萄 糖球菌（Staphylococcus aureus)和/或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeuruginosa)、甲型 肝炎病毒、乙型肝炎病毒、腦膜炎奈瑟氏菌(諸如糖類或綴合的糖類，對于血清群A、C、W135 和/或Y)、肺炎鏈球菌(諸如糖類或綴合的糖類)等的免疫原。
[0137] 在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可包含本發(fā)明的綴合物組合綴合至載體蛋白的甲型副 傷寒沙門氏菌抗原，諸如Η或0抗原(例如，0:2糖抗原），以提供二價(jià)傷寒疫苗。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，組合物可包含本發(fā)明的綴合物組合綴合至載體蛋白的鼠傷寒沙門氏菌抗原，諸如Η 或〇抗原(例如，0:9糖抗原）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可包含本發(fā)明的綴合物組合綴合 至載體蛋白的腸炎沙門氏菌抗原，諸如Η或0抗原（例如，0:4,5糖抗原）。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明的綴合物可以與抗原組合，所述抗原以被稱為膜抗原的廣義模塊(GMMA)或天然 外膜囊泡(N0MV)的外膜顆粒的形式呈現(xiàn)。此類膜顆粒的實(shí)例公開于例如W02012/049662和 W02011/036564 中。
[0138] 以下實(shí)施例意欲說明本發(fā)明，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對其進(jìn)行限制。溫度以攝氏度 給出。最終產(chǎn)物、中間體和原料的結(jié)構(gòu)通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法(例如微量分析和光譜特征)進(jìn)行 證實(shí)。所使用的縮寫是本領(lǐng)域中常規(guī)的那些。
[0139] ADH 己二酸二酰肼 avMff 平均分子量 BCA 二喹啉甲酸測定法 EDAC 1_乙基_3_(3_二甲基氛基丙基)碳二亞胺 h 小時(shí) HPAEC-PAD 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測 HPLC 高壓液相色譜 HR 高分辨率 IR 紅外光譜儀 kDa 千道爾頓 LCMS 液相色譜和質(zhì)譜 Μ 摩爾濃度 MS 質(zhì)譜 min 分鐘 mL 毫升 mM 毫摩爾濃度 NHS N-羥基琥珀酰亞胺 NMR 核磁共振 PS 多糖 rpm 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) RT 室溫 SEC 大小排阻色譜 TFF 切向流過濾。
[0140] 實(shí)施例1 制備片段化的Vi合并物和分離的方法。
[0141] 將Vi溶解于水中，并添加 H2〇2 30% wt，用于具有2.5 mg/mL Vi和5% (wt/v) H2〇2 的最終濃度。將混合物在80±0.5°C加熱2小時(shí)。此時(shí)之后，將混合物注射于Hiscreen Capto Q柱(4.7 mL/直至100 mg片段化的Vi混合物的樹脂負(fù)載率），且使用梯度步驟方法分離不同 平均分子量(avMW)的四種群體。NaH2P〇4 20 mM pH 7.2和NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2 分別用作緩沖液A和B。將片段化的Vi混合物負(fù)載于水中，且漸增avMW的合并物分別在25、 30、37和45%緩沖液B洗脫。將各收集的合并物在SEC S印hadex G-15柱上針對水脫鹽。
[0142] 獲得片段化的Vi合并物通過用于avMW計(jì)算的HPLC-SEC(參見圖6)、用于Vi含量的 HPAEC-PAD(Micoli等人，Vaccine 2011)、用于CH0基團(tuán)測定的微BCA(使用NAcGlcN作為標(biāo) 準(zhǔn)品）（Meeuwsen等人.Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000 89(1):107- 109)進(jìn)行表征。1H NMR用于驗(yàn)證Vi身份并計(jì)算0-乙?；剑▍⒁妶D4)(Micoli等人 .Vaccine 2011)。圖7顯示片段化的Vi合并物3的HPLC-SEC概況，其具有42.7 kDa的avMW和 25和70 kDa之間的面積（214 nm)的80%。
[0143] 實(shí)施例2 通過使用H2〇2和FeCl3制備片段化的Vi和分離的方法。
[0144] 將1〇〇呢￥丨？5溶解于水中；并添加？6(：13 1〇111]\1和!12〇2 30%￥扒用于具有2.5 mg/mL Vi、0.1禮FeCl3和3% (wt/v) H2〇2的最終濃度。將混合物在30±0·1Γ加熱1小時(shí)。此時(shí)之后，將混合物以5 mg片段化的Vi混合物/mL樹脂的負(fù)載率注射至Capto Q柱上。 NaH2P〇4 20 mM pH 7.2和NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分別用作緩沖液八和8。將片段化 的Vi混合物負(fù)載于350 mM NaCl中，且目的群體在40%的緩沖液B洗脫。將片段化的Vi合并物 通過TFF 30-kDa針對10個(gè)體積的水進(jìn)行滲濾。將片段化的Vi合并物通過針對avMW計(jì)算的 HPLC-SEC、針對Vi含量的HPAEC-PAD、針對驗(yàn)證Vi身份和計(jì)算0-乙?；降墓綨MR進(jìn)行表 征。具體而言，對于一種制備物，獲得avMW 53.8 kDa的片段化的Vi(少于17%面積〈30 kDa且 少于16%面積> 80 kDa)。。-乙?；饺愿?88%)。
[0145] 實(shí)施例3 通過使用H2〇2和FeS〇4制備片段化的Vi和分離的方法。
[0146] 將1〇〇呢￥丨？5溶解于水中；并添加？65〇4 1〇111]\1和!12〇2 30%￥扒用于具有2.5 mg/mL Vi、0.1 mM FeS〇4和0.5% (wt/v) H2〇2的最終濃度。將混合物在30±0.1°C加熱2小 時(shí)。此時(shí)之后，將EDTA添加至10 mM的最終濃度以猝滅催化劑。通過切向流過濾(30-kDa膜） 除去過氧化氫，并用NaH2P〇4 10 mM pH 7緩沖液交換。將混合物在80°C加熱2小時(shí)，然后以5 11^片段化的￥丨混合物/11^樹脂的負(fù)載率注射至0&?如〇柱上。似!^〇4 2〇1^?!17.2和 NaH2P〇4 20 mM NaCl 1M pH 7.2分別用作緩沖液4和8。將片段化的￥丨混合物負(fù)載于緩沖液八 中，且期望麗的群體在線性梯度中（50個(gè)柱體積中從100%緩沖液A至100%緩沖液B)分離。 將選擇的片段化的Vi合并物通過TFF 30-kDa針對10個(gè)體積的水進(jìn)行滲濾。將片段化的Vi合 并物通過針對avMW計(jì)算的HPLC-SEC、針對Vi含量的HPAEC-PAD、針對驗(yàn)證Vi身份和計(jì)算0-乙 ?；降?H NMR進(jìn)行表征。具體而言，對于一種制備物，獲得avMW 43.4 kDa的片段化的 Vi(少于20%面積〈25 kDa且少于20%面積> 70 kDa)。。-乙?；饺愿?85%)。
[0147] 實(shí)施例4 制備片段化的V i綴合物的方法 對于片段化的Vi合并物1_3(實(shí)施例1中獲得）的綴合，以下程序用于綴合物制備。將片 段化的Vi以50 mg/mL的濃度溶解于MES 100 mM (pH 6)中。添加 NHS，然后添加 EDAC，以具有 5的EDAC/Vi重復(fù)單元摩爾比和NHS濃度0.33 M。將反應(yīng)在室溫混合1小時(shí)。此時(shí)之后，添加如 Micoli等人.Vaccine 2011中先前描述制備的CRM197-ADH，以具有MES 20 mM (pH 6)中的 7.8 mg/mL的Vi和蛋白濃度（1的Vi與蛋白w/w比）。將混合物在室溫混合2小時(shí)。通過HPLC- SEC (TSK凝膠3000 PWXL柱)驗(yàn)證綴合物形成，且在反應(yīng)混合物中沒有觀察到殘余蛋白。在 1.6 cmx60 cm Sephacryl 100 HR柱上通過大小排阻色譜通過未反應(yīng)的PS分離綴合物。將 不含未綴合的片段化的Vi的級分合并在一起并表征。
[0148] 將純化的綴合物通過用于總Vi含量的HPAEC-PAD(Micoli等人.Vaccine 2011)、用 于總蛋白含量的微BCA、用于測定綴合物的avMW分布和評價(jià)游離蛋白和游離糖的量的HPLC- SEC進(jìn)行表征。對于合并物3和合并物4綴合物，通過Capto Adhere/HPAEC-PAD方法估計(jì)游離 糖。下表報(bào)道實(shí)施例5中測試的綴合物的主要特征。
[0149] 對于實(shí)施例1中獲得的片段化的Vi合并物4,上述反應(yīng)條件導(dǎo)致凝膠形成，這可能 是因?yàn)樵撊后w的較高avMW。對于該特定合并物，用15 mg/mL的Vi濃度、0.1 Μ的NHS濃度和5 的EDAC/Vi重復(fù)單元摩爾比進(jìn)行用EDAC/NHS的活化步驟。相同條件用于與CRM197-ADH的綴合 步驟。
[0150] 通過Capto Adhere/HPAEC-PAD方法測定綴合物中的游離Vi的量 源自500 yL Capto Adhere樹脂懸浮液且用20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗滌的沉 淀用于樣品的處理。向1.3!1^2〇11^似!12?〇4化117.2)中的綴合物（范圍6〇-150此/1^中 的總Vi濃度）中添加390 uL CH3CN(所得溶液在此處表示為負(fù)載樣品）。將一毫升負(fù)載樣品 添加至樹脂上，并在旋轉(zhuǎn)輪上在室溫孵育30分鐘。此時(shí)之后，將樣品離心（5分鐘，在4°C， 14000 rpm)，并洗出上清液(表示為流通物）。用1 mL 20 mM AcONa 30% CH3CN (pH 5)洗滌 沉淀（溶劑添加至樹脂，通過手工混合）（兩次）。通過離心回收沉淀（5分鐘，在4°C，14000 rpm)。收集的上清液（2 mL總體積）表示為洗滌溶液。向沉淀添加500 uL 1 M AcONa 30% CH3CN (pH 5)，通過手工混合，并通過離心分離（5分鐘，在4°C，14000 rpm)。將該操作重復(fù) 六次，合并上清液，表示為剝離溶液(3 mL總體積）。將剝離溶液、洗滌溶液、流通物和0.5 mL 負(fù)載樣品在SpeedVac中干燥，并重構(gòu)于相同體積的水中。所有樣品都通過HPLC-SEC(熒光發(fā) 射)分析以驗(yàn)證流通物、洗滌和剝離溶液中不存在綴合物。通過HPAEC-PAD測定負(fù)載樣品和 剝離溶液的Vi含量。
[0151 ]剝離溶液(未綴合的Vi)和負(fù)載溶液(總Vi)中的針對稀釋度校正的Vi含量的比率 代表樣品中的游離乂1的％。
[0152] 通過HPLC-SEC表征綴合物 HPLC-SEC用于在游離蛋白和游離糖方面表征綴合物。在具有TSK凝膠PWXL保護(hù)柱(4.0 cmx6.0 mm;粒徑 12 μπι;編號808033) (Tosoh Bioscience)的TSK凝膠G3000 PWxl柱（30 cmx7.8 mm;粒徑7 編號808021)上洗脫所有樣品。流動(dòng)相是0.1 M NaCl，0.1 Μ NaH2P04，5%CH3CN，pH7·2，流速為0·5mL/min(等度方法，持續(xù)30分鐘）。HPLC-SEC還用于 估計(jì)綴合物樣品中的未綴合蛋白（熒光發(fā)射檢測)和片段化的Vi(對于合并物1和2)(折射率 檢測）的量。關(guān)于用范圍5-50 yg/mL中的蛋白樣品構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線定量未反應(yīng)的蛋白的面 積。通過將通過HPLC-SEC檢測的游離蛋白的量除以通過微BCA在樣品中定量的蛋白的總量 而計(jì)算未綴合的蛋白的百分?jǐn)?shù)。類似地，關(guān)于范圍20-50 μg/mL中的（相同avMW的）片段化的 Vi的校準(zhǔn)曲線定量未綴合的片段化的Vi的量。通過將通過HPLC-SEC檢測的游離Vi的量除以 通過HPAEC-PAD在樣品中定量的糖的總量而計(jì)算未綴合的糖的百分?jǐn)?shù)。
[0153] 實(shí)施例5 片段化的Vi綴合物(DT和TT作為載體） 使用DT(白喉類毒素)和TT(破傷風(fēng)類毒素)作為載體蛋白進(jìn)行Vi合并物3(實(shí)施例1中獲 得)的綴合。如實(shí)施例3中所述活化片段化的Vi，并使用實(shí)施例3中描述的相同反應(yīng)條件（1的 Vi與蛋白w/w比），在綴合的步驟中添加 DT-ADH或TT-ADH(如CRM197_ADH制備）。通過每蛋白引 入的較高數(shù)目的ADH接頭(針對6個(gè)CRM197，分別為12和23.5)表征DT-ADH和TT-ADH。所得綴合 物的主要特征報(bào)道于下表中。_^^_____
[0154] 實(shí)施例6 小鼠中的體內(nèi)測試 用具有不同鏈長的Vi的Vi-CRM197綴合物(如實(shí)施例3中獲得，下表中的組1至4)，用天然 的Vi-CRM197綴合物(下表中的組5)，和用相應(yīng)的未綴合的Vi多糖(組6至10)免疫十組10周齡 的CD1雌性小鼠。下表概述研究設(shè)計(jì)。在第0和35天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有8 yg Vi抗原），在第14、35和49天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELISA評估抗- Vi和抗-CRM197應(yīng)答(如圖2中顯示）。
[0155] 如圖2中可見，在未綴合的Vi (組6-10)間，全長Vi (組10)是唯一能夠在第一次注射 之后誘導(dǎo)明確的應(yīng)答的。相應(yīng)的綴合物(組5)同樣如此。天然Vi-CRM197是唯一能夠在第一次 注射之后已經(jīng)引起高應(yīng)答的，第二次注射之后無加強(qiáng)。不同地，對于所有片段化的Vi綴合物 (組1-4)，該應(yīng)答在第一次注射之后低，且在再次注射之后顯著更高。
[0156] 進(jìn)行隨后研究以比較野生型和TCR 小鼠中的天然和片段化的Vi-CRM197綴合 物（圖8)。用具有不同鏈長的Vi的Vi -CRM197綴合物，用天然的Vi -CRM197綴合物，和用天然的 未綴合的Vi多糖免疫十組10周齡的雌性CD1野生型（下表中的組1-5)和T細(xì)胞敲除小鼠（下 表中的組6-10)。在第0和28天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有8 yg Vi抗原），在第 14、28和42天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELI SA評估抗-Vi和抗-CRM197應(yīng)答 (如圖8中顯示）。
[0157] 獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)，在小鼠中，片段化的Vi不能誘導(dǎo)T非依賴性應(yīng)答，且相應(yīng)的Vi- CRM197綴合物能夠誘導(dǎo)基本上無 T非依賴性應(yīng)答的T依賴性應(yīng)答。
[0158] 實(shí)施例7 -綴合至不同的載體蛋白的全長和片段化的Vi (fVi)(實(shí)施例1中描述的 合并物3)在小鼠中的體內(nèi)測試 用下表中報(bào)道的綴合物免疫六組8個(gè)10周齡的CD1雌性小鼠。
nd:未檢測到。
[0159] 在第0和35天給予兩次200 uL的皮下注射(各自含有1 yg Vi抗原），在第14、35和 49天采血。注射鹽水溶液中的無佐劑的抗原。通過ELISA評估抗-Vi應(yīng)答(如圖9中顯示）。
[0160]如圖9中可見，對于所天然的Vi綴合物，在第14天觀察到高應(yīng)答，在第二次注射之 后無加強(qiáng)。獨(dú)立于所使用的載體，抗Vi IgG應(yīng)答在所有全長天然Vi綴合物中是類似的。對于 片段化的Vi綴合物，對于CRM197和DT觀察到在第二次注射之后抗Vi IgG應(yīng)答的增加(加強(qiáng)效 應(yīng)），但對于TT沒有觀察到，表明綴合至CRM197或DT的片段化的Vi能夠誘導(dǎo)基本上無 T非依 賴性應(yīng)答的T依賴性免疫應(yīng)答。在第二次注射之后，不依賴于所使用的載體，抗Vi IgG應(yīng)答 是類似的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 適合于疫苗中使用的綴合物，其包含片段化的Vi多糖和選自CRM197或白喉類毒素的 載體蛋白，其中所述片段化的多糖具有40和55 kDa之間的平均分子量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中所述片段化的多糖具有41和49 kDa之間的平均分子 量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中所述片段化的多糖具有51至55 kDa的平均分子量。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的綴合物，其中所述載體蛋白是CRMm。5. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體的組 合。6. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述組合物是未佐劑化的。7. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述組合物包含佐劑。8. 用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括將權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的綴合物 或藥物組合物施用于所述哺乳動(dòng)物。9. 用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生基本上無 T非依賴性應(yīng)答的T依賴性免疫應(yīng)答的方法，其包括 將權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的綴合物或藥物組合物施用于所述哺乳動(dòng)物。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的綴合物或藥物組合物在制備用于預(yù)防疾病的疫苗中 的用途。11. 用于在受試者中預(yù)防傷寒的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的綴合物 或藥物組合物施用于有需要的受試者。12. 用于制備包含片段化的V i多糖和選自C RM i 9 7或白喉毒素的載體蛋白的綴合物的方 法，其包括以下步驟： a. 將Vi多糖片段化，以獲得具有40至55 kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖； b. 使步驟a)中獲得的片段化的Vi多糖與碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺在5至6的pH反 應(yīng)，以形成N-羥基琥珀酰亞胺酯 c. 使步驟b)中獲得的N-羥基琥珀酰亞胺酯Vi衍生物與所述載體蛋白，以產(chǎn)生綴合物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述載體蛋白是CRMm。14. 根據(jù)權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)的方法可獲得的適合于疫苗中使用的綴合物。15. 具有40至55kDa的平均分子量的片段化的Vi多糖和選自CRM197或白喉類毒素的載體 蛋白在制備綴合物疫苗中的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK105828839SQ201480061264
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年11月7日
【發(fā)明人】C.A.麥克倫南, L.B.馬丁, F.米科利, A.J.紹爾
【申請人】葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司