用于診斷和治療腫瘤的病毒樣顆粒綴合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容涉及使用與光敏分子綴合的病毒樣顆粒來(lái)診斷和/或治療腫瘤(例如眼腫瘤)的方法和組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于診斷和治療腫瘤的病毒樣顆粒綴合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)依據(jù)351^.(：.§119(6)要求于2013年9月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/ 879,627的權(quán)益，其通過(guò)引用整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)內(nèi)容涉及腫瘤診斷和治療的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0004] 盡管有許多治療可用于癌癥，但是很多形式的癌癥仍無(wú)法治愈、不可治療或者變 得對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療具有抗性并且用于很多癌癥的有效治療具有不期望的副作用。眼癌(ocular cancer)(例如眼黑素瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤）的治療特別具有挑戰(zhàn)性。診斷為患有眼黑素瘤 的患者根據(jù)腫瘤大小具有很少治療選擇，包括：（1)外科手術(shù)，例如切除術(shù)(resection)、摘 出術(shù)(enucleation)或摘除術(shù)(exenteration )，其全部是高度侵入性的并且主要涉及移除 眼和視神經(jīng)部分（在外科手術(shù)后，患者通常安裝人工眼）；和（2)斑塊近程治療（plaque brachytherapy)，其為一種放射治療，其中將用放射性粒子(radioactive seed)覆蓋一側(cè) 的薄金屬(例如，金)片縫合到眼的外壁上且所述粒子以腫瘤為目標(biāo)。在治療結(jié)束時(shí)，將該薄 金屬片移除，所述治療通常持續(xù)數(shù)天。放射性相關(guān)的嚴(yán)重并發(fā)癥包括:最常見(jiàn)的白內(nèi)障形 成，繼之為玻璃體出血。其他的并發(fā)癥包括干眼、角膜炎、放射誘發(fā)性虹膜新血管形成 (radiation-induced iris neovascularization)、新生血管性青光眼、放射誘發(fā)性視網(wǎng)膜 病、放射誘發(fā)性視神經(jīng)病變、鞏膜外沉積(ep i sc I era I depos i t)、鞏膜壞死和/或眼外肌改 變。已報(bào)道，在用斑塊近程治療進(jìn)行治療的10%至63%的患者中發(fā)生放射性視網(wǎng)膜病，并且 從治療到發(fā)生黃斑病變的平均時(shí)間為約25.6個(gè)月。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本公開(kāi)內(nèi)容至少部分地提供了用于檢測(cè)和/或選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞(例如用于 診斷和/或治療癌癥(例如，眼癌））的方法和組合物。在一些情況下，本文中提供的方法和組 合物可用于選擇性地殺傷癌性腫瘤細(xì)胞而不損傷健康細(xì)胞。例如，可選擇性地向腫瘤細(xì)胞 遞送包含光敏分子(例如，與光敏分子綴合）的病毒樣納米顆粒，并通過(guò)暴露于光來(lái)對(duì)其進(jìn) 行光活化。當(dāng)光活化時(shí)，光敏分子吸收光子，并且所吸收的能量導(dǎo)致引起毒性(例如，細(xì)胞毒 性）的分子改變。"光敏病毒樣納米顆粒"（在本文中還稱(chēng)為"光敏病毒樣顆粒"）指與光敏分 子綴合的病毒樣納米顆粒。令人驚奇的是，光敏分子與病毒樣納米顆粒的綴合不干擾該納 米顆粒的組織/腫瘤向性(tropism)(例如，病毒樣納米顆粒對(duì)特定宿主腫瘤組織或腫瘤細(xì) 胞的特異性）。
[0007] 本公開(kāi)內(nèi)容的病毒樣納米顆粒(還稱(chēng)為病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)) 一般由LI衣殼蛋白或LI和L2衣殼蛋白的組合裝配，并且在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子 與形成病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白綴合。因此，本公開(kāi)內(nèi)容的多個(gè)方面提供了靶向腫瘤的 病毒樣納米顆粒，其包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。
[0008]本公開(kāi)內(nèi)容的一些方面還提供了靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其每個(gè)顆粒包含約50至 約500、約50至約600、約50至約700、約50至約800、約50至約900或約50至約1000個(gè)光敏分 子。在一些實(shí)施方案中，靶向腫瘤的病毒樣顆粒每個(gè)顆粒包含約400、約500、約600、約700、 約800、約900或約1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中，靶向腫瘤的病毒樣顆粒每個(gè)顆粒包 含500個(gè)光敏分子或1000個(gè)光敏分子。
[0009]在一些實(shí)施方案中，所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒(papilloma virus)衣殼蛋白。例 如，在一些實(shí)施方案中，所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒（non-human papilloma virus)衣殼蛋白，例如牛乳頭瘤病毒(bovine papilloma virus)衣殼蛋白。在 一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒(human papilloma virus)衣殼蛋白 并且不與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV 18或?qū)PV具有特異性的已 有(pre-existing)抗體交叉反應(yīng)。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含乳頭狀瘤Ll或L1/L2蛋白（例如，人、?；?其他物種）。在一些實(shí)施方案中，所述Ll或L1/L2 VLP不與針對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18的中和性抗體或?qū)ζ渌鸋PV具有特異性的已有抗體交叉反應(yīng)。然而，在一些實(shí)施方案中， 所述病毒樣顆粒包含HPVl 6的人乳頭瘤病毒衣殼蛋白。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的表面暴露的肽綴合。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含Ll衣殼蛋白或Ll和L2衣殼蛋白的組合。 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒由Ll衣殼蛋白組成。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含BPV Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID N0:2)，BPV LI和BPV L2衣殼蛋白的組合。在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含HPV LI衣殼蛋白或HPV Ll和HPV L2衣殼蛋白的組合。在一些實(shí)施方案中，HPV Ll衣殼蛋白是具有經(jīng)修飾的免疫原 性和/或抗原性的變體HPV16/31 Ll蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。因此，在一些實(shí)施方案中，病 毒樣顆粒包含變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白或變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID NO: 1)和HPV L2衣殼蛋白的組合，或者由其組成。
[0014]在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒的衣殼蛋白具有經(jīng)修飾的免疫原性和/或抗原性。 這樣的衣殼蛋白的非限制性實(shí)例是HPV16/31 Ll衣殼蛋白（例如，SEQ ID N0:1)。與野生型 病毒樣顆粒相比，本文中可將包含經(jīng)修飾的衣殼蛋白的病毒樣顆粒稱(chēng)為包含經(jīng)修飾免疫原 性和/或抗原性的病毒樣顆粒。
[0015]在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白共價(jià)綴合。在一些實(shí)施方案中，所述 光敏分子與衣殼蛋白的氨基酸綴合。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的氨基 酸的胺基團(tuán)（例如，脂族伯胺)綴合。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白的賴(lài)氨酸 殘基的胺基團(tuán)（例如，賴(lài)氨酸的側(cè)鏈胺)綴合。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與衣殼蛋白 的精氨酸和/或組氨酸殘基的胺基團(tuán)綴合。本公開(kāi)內(nèi)容提供了用于使光敏分子與賴(lài)氨酸以 及包含胺基團(tuán)的其他氨基酸綴合的方法。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子不破壞(compromise)(例如，阻止、干擾或抑制） 病毒樣顆粒與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子不破壞(例如，阻止、 干擾或抑制）病毒樣顆粒與腫瘤細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycan)或其他多糖的結(jié)合。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含約10至約1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施 方案中，所述病毒樣顆粒包含約50至約1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆 粒包含約100至約1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含約100至約500 個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含約500至約1000個(gè)或更多個(gè)光敏分 子。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含約10至約1000個(gè)光敏分子，所述光敏分 子與Ll衣殼蛋白、L2衣殼蛋白或Ll衣殼蛋白和L2衣殼蛋白之組合的賴(lài)氨酸殘基或其他氨基 酸殘基綴合。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子通過(guò)紅外光、近紅外光或紫外光來(lái)活化。當(dāng)如本 文中的其他部分所述，當(dāng)光敏分子吸收光子并且所述吸收的能量導(dǎo)致引起毒性的分子改變 時(shí)，認(rèn)為所述分子被"活化"。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子包含熒光染料、紅外染料、近紅外染料、撲啉分 子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子是卟啉分子。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的卟啉分子 的實(shí)例包括但不限于:HpD(血卟啉衍生物）、基于HpD的分子(HpD-based)、ΒΗ)(苯并卟啉衍 生物）、ALA(5-氨基乙酰丙酸)和德卟啉(texaphyrin)。在一些實(shí)施方案中，所述卟啉分子是 維替泊芬(verteporf in，Visudyne@)。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子是葉綠素分子。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的葉綠色 分子的實(shí)例包括但不限于：二氫卟酚（chlor in)、紅紫素 （purpur in)和菌綠素 (bacteriochlorin)〇
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子是染料。用于根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的染料的實(shí) 例包括但不限于釀?shì)?口111：11&1〇〇5^11；[116)和萘菁(11&口1：11&1005^11；[116)。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述酞菁染料是焚光分子和近紅外分子二者。例如，在一些實(shí) 施方案中，所述酞菁染料是IR700染料(例如，IRl>ye_7〇〇DX，U-C：OR?hiR7〇〇染料是 一種吸收和發(fā)射波長(zhǎng)在通常為680nm至800nm的近紅外(near-inf rared，NIR)光譜內(nèi)的焚光 染料。本文中還提供了吸收和發(fā)射波長(zhǎng)在NIR光譜內(nèi)的另一些熒光染料。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子選自：酞菁染料（例如，IR700染料，例如 IRDyew7〇〇DX)、撲啉分子(例如，維替泊芬，例如Visudyne?)以及酞菁染料和卟啉分子 的組合。
[0026] 本公開(kāi)內(nèi)容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對(duì)象施用本文中 提供的任一種病毒樣顆粒或光敏病毒樣顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在允許光 敏分子可視化的波長(zhǎng)下活化病毒樣顆粒的光敏分子。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容 的光敏分子用作成像劑和/或診斷劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在導(dǎo)致光敏分子具 有細(xì)胞毒性的光波長(zhǎng)下活化所述分子。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在這樣的光波長(zhǎng) 下活化光敏分子，所述光波長(zhǎng)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生造成導(dǎo)致壞死的直接且不可逆的細(xì)胞損傷 的能量傳遞。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的光敏分子用作治療劑和/或預(yù)防劑。
[0027] 本公開(kāi)內(nèi)容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對(duì)象施用靶向腫 瘤的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。在一些實(shí)施方案中，所 述方法包括在使光敏分子可見(jiàn)的波長(zhǎng)下活化病毒樣顆粒的所述分子。即，所述光敏分子在 光激發(fā)之后重新發(fā)射光。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在使光敏分子具有細(xì)胞毒性從 而殺傷腫瘤細(xì)胞的波長(zhǎng)下活化所述分子。即，所述光敏分子在光激發(fā)之后經(jīng)歷導(dǎo)致光敏分 子變得對(duì)細(xì)胞具有毒性的分子改變。
[0028] 本公開(kāi)內(nèi)容的一些方面提供了這樣的方法，其包括向患有腫瘤的對(duì)象施用靶向腫 瘤的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含約50至約1000、約50至500,或約500至1000個(gè)光敏分 子。在一些實(shí)施方案中，方法包括向患有腫瘤的對(duì)象施用靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個(gè)或更多個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中， 所述方法包括在使光敏分子可見(jiàn)的波長(zhǎng)下活化所述分子。在一些實(shí)施方案中，所述方法包 括在使光敏分子具有細(xì)胞毒性從而殺傷腫瘤細(xì)胞的波長(zhǎng)下活化所述分子。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子是激光活化的。在一些實(shí)施方案中，所述激光是 紅外激光、近紅外激光或紫外激光。在一些實(shí)施方案中，所述紅外激光為5焦耳(J)至100J (或J/cm2)(例如，5J、6J、7J、8J、9J、10J、11J、12J、13J、14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、 21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、33J、34J、35J、36J、37J、38J、39J、 40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J,52J,53J,54J,55J,56J,57J,58J, 59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、71J、72J、73J、74J、75J、76J、77J、 78J、79J、80J、81J、82J、83J、84J、85J、86J、87J、88J、89J、90J、91J、92J、93J、94J、95J、96J、 97J、98J、99J或IOOJ(或J/cm 2))。在一些實(shí)施方案中，所述激光施加約5秒至約5分鐘。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，在向?qū)ο笫┯貌《緲宇w粒后約30分鐘至約48小時(shí)活化光敏分 子。例如，可在向?qū)ο笫┯貌《緲宇w粒后30分鐘活化光敏分子。在一些實(shí)施方案中，在向?qū)?象施用病毒樣顆粒后1小時(shí)、2小時(shí)(h)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10 小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21 小時(shí)、22小時(shí)、23或24小時(shí)活化光敏分子。在一些實(shí)施方案中，在向?qū)ο笫┯貌《緲宇w粒后1 天、2天或3天活化光敏分子。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是眼腫瘤或已轉(zhuǎn)移至眼部的腫瘤。例如，在一些實(shí)施 方案中，所述眼腫瘤位于玻璃體(vitreous)、脈絡(luò)膜腔(choroidal space)、虹膜、睫狀體、 鞏膜、視網(wǎng)膜中央凹（fovea)、視網(wǎng)膜、視盤(pán)或視神經(jīng)中。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、結(jié)腸、乳腺、卵巢、前 列腺、腦、腦脊膜(meninges)、睪丸、胃腸道、腎或膀胱中。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤無(wú)需外科手術(shù)介入即可接近(accessible)。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤位于頭、頸、子宮頸、喉或皮膚中。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是孤兒?。╫rphan disease)或罕見(jiàn)?。╮are disease)〇
[0036] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是癌性的。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是轉(zhuǎn)移性 的。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是癌前期的或發(fā)育不良性的。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒通過(guò)注射來(lái)施用。例如，所述病毒樣顆?？赏?過(guò)眼內(nèi)注射到玻璃體中來(lái)施用或者可靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒用 空心針(ho 11 ow needle)或包被針（coated needle)、微型針(mini-needIe)或顯微操作針 (micro-needle)來(lái)施用。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒表面(topically)施用。在一 些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒通過(guò)植入來(lái)施用。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。例如，在一些實(shí)施方案 中，所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白，例如牛乳頭瘤病毒(BPV)衣殼蛋 白。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白并且不與人乳頭瘤病 毒(HPV) 16、HPV 18或?qū)PV具有特異性的已有抗體交叉反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述病毒 樣顆粒包含人乳頭瘤病毒16型衣殼蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述VLP不與對(duì)人乳頭瘤病毒 (HPV) 16、HPV 18 VLP具有特異性的抗體或由HPV感染特異性地誘導(dǎo)的已有抗體結(jié)合。
[0039] 本公開(kāi)內(nèi)容的一些方面提供了在對(duì)象中監(jiān)測(cè)腫瘤（例如，眼腫瘤和惡性痣 (malignant nevi))的方法，所述方法包括向該對(duì)象(例如，向該對(duì)象的眼部)施用本文中提 供的任一種病毒樣顆粒(例如包含光敏分子(例如，熒光染料或紅外染料）的病毒樣顆粒）， 并檢測(cè)腫瘤的位置。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)用激光(例如紫外激光或紅外激 光）照射該對(duì)象(例如，該對(duì)象的眼部)來(lái)檢測(cè)腫瘤的位置。在一些實(shí)施方案中，所述方法包 括在施用病毒樣顆粒之前鑒別懷疑患有腫瘤的對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通 過(guò)向患有或懷疑患有腫瘤的對(duì)象或?qū)ο蟮哪[瘤施用光敏病毒樣顆粒來(lái)診斷和/或治療腫 瘤。
[0040] 本公開(kāi)內(nèi)容的另一些方面提供了選擇性地抑制癌細(xì)胞增殖或殺傷癌性細(xì)胞而不 抑制非癌性(例如，正常、健康)細(xì)胞的增殖或生存力的方法，所述方法包括向?qū)ο蟮哪[瘤 (例如，向該對(duì)象的眼腫瘤)施用本文中提供的任一種靶向腫瘤的病毒樣顆粒(例如包含光 敏分子(例如紅外染料)的病毒樣顆粒），并通過(guò)使腫瘤經(jīng)受紅外激光(例如，在約660nm至約 740nm的波長(zhǎng)和至少8焦耳的劑量下)來(lái)有效地輻照腫瘤的癌性細(xì)胞。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了病毒樣納米顆粒(還稱(chēng)為病毒樣顆粒），其 包含與乳頭瘤病毒Ll蛋白（例如，牛乳頭瘤病毒Ll蛋白）綴合的光敏分子。在一些實(shí)施方案 中，所述病毒樣納米顆粒的直徑為20至60納米（例如，10、25、30、35、40、45、50、55或60納 米）。在一些實(shí)施方案中，病毒樣納米顆粒包含300至500個(gè)Ll(例如，BPV LI)衣殼蛋白，例如 360個(gè)Ll衣殼蛋白（例如，基于二十面體對(duì)稱(chēng)）。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在一些實(shí)施方案中，病毒樣納米顆 粒各自包含約 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、 460、470、480、490或500個(gè)1^1(例如，8?￥1^1)衣殼蛋白。然而，在一些實(shí)施方案中，病毒樣納 米顆粒包含少于300個(gè)Ll (例如，BPV Ll)衣殼蛋白。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了與100至1000個(gè)光敏分子(例如，100、200、 300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)分子)共價(jià)綴合的牛乳頭瘤病毒病毒樣納米顆粒。 在一些實(shí)施方案中，牛乳頭瘤病毒(BPV)病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白包含BPV Ll衣殼蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣殼蛋白的組合，或者由其組成。在一些實(shí)施方案中，光敏分子與病毒樣 納米顆粒(或者與病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白）通過(guò)如下形成的共價(jià)鍵綴合:光敏分子中的 酯基團(tuán)與衣殼蛋白中的胺基團(tuán)反應(yīng)，從而形成酰胺鍵。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi) 容的病毒樣納米顆粒的衣殼蛋白與光敏分子通過(guò)酰胺鍵綴合。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含300至500個(gè)BPV Ll衣殼蛋白并且/或 者直徑為20至60nm的病毒樣納米顆粒，其中至少一些（例如，10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或100%)與1至5個(gè)（例如，1、2、3、4或5個(gè))光敏分子（例如，11?700染 料，例如lRDveK7〇〇DX)共價(jià)綴合(例如，通過(guò)酰胺鍵）。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了產(chǎn)生病毒樣納 V 米顆粒的方法和將病毒樣納米顆粒作為診斷劑、治療劑或預(yù)防劑施用于對(duì)象的方法。
[0044] 附圖簡(jiǎn)述
[0045] 圖1示出了使用與光敏分子綴合的病毒樣顆粒(VLP)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制。
[0046] 圖2示出了二價(jià)靶向（例如，通過(guò)抗體)和多價(jià)靶向（例如，通過(guò)VLP)的比較。
[0047]圖3示出了顯示VLP與細(xì)胞結(jié)合的特異性由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG)相互作用介導(dǎo)并且受肝素抑制的圖。其還示出了僅當(dāng)光敏 VLP與細(xì)胞結(jié)合并且使細(xì)胞經(jīng)受紅外輻照時(shí)腫瘤細(xì)胞才被特異性殺傷。
[0048]圖4示出了顯示細(xì)胞死亡依賴(lài)于紅外輻射的劑量以及所遞送VLP和光敏分子（例 如，染料)的量的圖。
[0049]圖5示出了顯示在與IR700綴合的VLP(在該圖中指定為PsV)下在輻照之后的體外 卵巢癌細(xì)胞(SK0V-3)死亡的圖。
[0050] 圖6A示出了對(duì)對(duì)照VLP的電噴霧電離-飛行時(shí)間（electrospray ionization- time-of-f light，ESI-T0F)分析。圖6B示出了對(duì)與1000個(gè)分子的IR700綴合的VLP(在該圖中 指定為PsV)的ESI-TOF分析。
[0051 ] 圖7A至70不出了人表皮生長(zhǎng)因子受體陰性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2-)眼黑素瘤細(xì)胞系（92 · I)的細(xì)胞死亡的圖，其對(duì)二價(jià)劑(例如， 抗體)和多價(jià)劑(例如，光敏VLP，還稱(chēng)為VLP綴合物，在該圖中指定為PsV)的有效性進(jìn)行比 較。
[0052] 圖8A至80不出了人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性（human epidermal growth factor receptor 2 negative，HER2+)卵巢癌細(xì)胞系（SK0V-3)的細(xì)胞死亡的圖，其對(duì)二價(jià)劑（例如， 抗體)和多價(jià)劑(例如，光敏VLP，還稱(chēng)為VLP綴合物，在該圖中指定為PsV)的有效性進(jìn)行比 較。
[0053] 圖9示出了顯示疫苗誘導(dǎo)的抗HPV16中和性抗體不阻斷BPV*IR700 VLP與眼黑素 瘤細(xì)胞系92.1結(jié)合的圖。
[0054] 圖10A示出了lRJDye?7〇〇DX NHS酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖10B示出了Visudyu#的化學(xué) 結(jié)構(gòu)，其中反應(yīng)性羧基用圓圈標(biāo)出。
[0055] 圖11示出了反應(yīng)方案，其涉及（1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽） (EDC)和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)介導(dǎo)的Visudy 116#和VLP的連接。在該方案 中，①代表'Visudyne'%并且②代表VLP。注意，有兩條途徑到達(dá)期望的終產(chǎn)物?；腔?NHS的 存在易于穩(wěn)定反應(yīng)并且增提高望產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0056] 圖12示出了病毒樣納米顆粒與多種類(lèi)型癌細(xì)胞結(jié)合之HSPG依賴(lài)性結(jié)合的代表性 樣品的直方圖，所述病毒樣納米顆粒包含HPV16衣殼蛋白、變體HPV16/31衣殼蛋白和BPVl衣 殼蛋白（L1，或Ll和L2蛋白）。
[0057] 圖13A和13B示出了切除腫瘤組織在明視野（圖13A)和熒光（圖13B)中的圖像，所述 切除腫瘤組織來(lái)自注射后12小時(shí)之經(jīng)I 3BS注射的陰性對(duì)照小鼠、注射后12小時(shí)之經(jīng)光敏病 毒樣納米顆粒注射的小鼠（#3和#4)和注射后24小時(shí)之經(jīng)光敏病毒樣納米顆粒注射的小鼠 (#1和#2)。
[0058] 圖14示出了對(duì)離體TC-I腫瘤樣品中的腫瘤相關(guān)的總病毒樣納米顆粒相關(guān)熒光的 定量表示，所述樣品切除于靜脈內(nèi)注射VLP后12和24小時(shí)(與圖13相同的腫瘤）。
[0059]圖15示出了實(shí)施例14的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。
[0060] 圖16A和16B示出了皮下92 · 1眼黑素瘤(ocular melanoma，0M)細(xì)胞在體內(nèi)施用光 敏病毒樣納米顆粒(在該圖中指定為NP)和光滴定后的細(xì)胞死亡百分比的圖（光處理后24小 時(shí)測(cè)量的細(xì)胞生存力）。
[0061 ]圖17A至17C示出了圖16A和16B中所示的數(shù)據(jù)的原始直方圖。
[0062] 圖18(上面的組圖）示出了從經(jīng)皮下接種100μΙ PBS中的2 X IO5個(gè)TC-I腫瘤細(xì)胞并 經(jīng)如下施用的動(dòng)物獲得的組織樣品：（1)不處理；（2)100yg病毒樣納米顆粒(在該圖中指定 為NP)，所述納米顆粒由變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白裝配且標(biāo)記有丨RDye'jOODX [無(wú)光];(3汗83與501/〇112光；（4)20(^8病毒樣納米顆粒與501/〇112光；（5)10(^8病毒樣納米 顆粒與50J/cm 2光;和(6)50yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光。圖18(下面的組圖）示出了六種 測(cè)試條件各自的死亡細(xì)胞百分比。
[0063]圖19A示出了實(shí)施例15中所述的實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖19B示出了注射有病毒樣納米顆 粒(在該圖中指定為納米顆粒）的動(dòng)物相對(duì)于對(duì)照(具有光）中的存活百分比的圖。圖19C示 出了各小鼠中的腫瘤體積(上面的組圖）、"E7四聚體+CD8+T細(xì)胞"和"INF- γ分泌CD8+細(xì)胞"。 [0064]圖20示出了來(lái)自效力測(cè)定的結(jié)果的圖，所示效力測(cè)定比較了光敏BPV病毒樣納米 顆粒和光敏HPV病毒樣納米顆粒對(duì)細(xì)胞存活力的作用。
[0065]圖21示出了來(lái)自結(jié)合測(cè)定的結(jié)果的圖，所述結(jié)合測(cè)定比較了光敏BPV病毒樣納米 顆粒和光敏HPV病毒樣納米顆粒與細(xì)胞的結(jié)合。
[0066]圖22示出了在用光敏病毒樣納米顆粒(在該圖中指定為PsV)處理之后頭頸癌細(xì)胞 的腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)的圖。
[0067]圖23Α和23Β描繪了本公開(kāi)內(nèi)容的光敏病毒樣納米顆粒產(chǎn)生過(guò)程的實(shí)例（例如，如 實(shí)施例20中所述）。
[0068] 發(fā)明詳述
[0069] 光動(dòng)力學(xué)治療（photodynamic therapy，PDT)是使用無(wú)毒的光敏分子的一種光治 療形式，所述光敏分子當(dāng)選擇性地暴露于光時(shí)，變得具有毒性并且靶向和/或殺傷惡性細(xì)胞 以及其他患病細(xì)胞。PDT在治療癌癥中面臨的挑戰(zhàn)是將高濃度的光敏分子排他性地遞送至 腫瘤細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)靶向遞送，可使用抗體，但是抗體由于其每個(gè)抗體2至8個(gè)光敏分子的遞 送能力而受到的限制。此外，有重要的腫瘤缺乏鑒別出的腫瘤受體分子，并且因此不能用抗 體來(lái)靶向。因而，很多腫瘤仍然無(wú)法治療(例如，眼黑素瘤）。另外，還在非腫瘤細(xì)胞的表面上 發(fā)現(xiàn)很多被抗體/染料綴合物靶向的分子(例如，EGFR)，從而導(dǎo)致不想要的脫靶效應(yīng)。
[0070] 本公開(kāi)內(nèi)容部分地基于以下出人意料的發(fā)現(xiàn):可將病毒樣顆粒(VLP)(例如，乳頭 狀瘤VLP)(在本文中還稱(chēng)為病毒樣納米顆粒)化學(xué)修飾成攜帶很多光敏分子(例如，IR700) 而不喪失其靶向腫瘤的能力或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。例如，在一些實(shí)施方案中，可將VLP化學(xué)修飾成 攜帶多于50個(gè)分子、多于100個(gè)分子，或多于1000個(gè)分子(或約1000個(gè)光敏分子）。由Ll，或Ll 和L2衣殼蛋白裝配的病毒樣顆?？蛇x擇性地與癌細(xì)胞結(jié)合并感染癌細(xì)胞而不影響非癌性 細(xì)胞，從而使治療的細(xì)胞毒性最小化(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. US20100135902A1，其整體 通過(guò)引用并入本文）。此外，在一些實(shí)施方案中，遞送高量光敏分子/顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)用極少量 的藥物(例如，皮摩爾濃度)在光輻射之后選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0071] VLP的關(guān)鍵細(xì)胞結(jié)合特征是衣殼蛋白（例如，LI)上存在大量的肝素結(jié)合位點(diǎn)。令人 驚奇地，光敏分子與表面氨基酸的綴合(例如，通過(guò)酰胺鍵與表面氨基酸例如表面賴(lài)氨酸殘 基、精氨酸殘基或組氨酸殘基綴合)不破壞VLP與腫瘤細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)的結(jié)合。盡管，本公開(kāi)內(nèi)容描述了光敏分子與衣殼蛋白的表面暴露肽的綴合，但是應(yīng) 理解光敏分子可與衣殼蛋白的任何肽綴合。即，光敏分子可僅與Ll蛋白綴合或者與Ll和L2 蛋白的組合綴合。與光敏分子綴合的蛋白質(zhì)和氨基酸殘基可取決于病毒樣顆粒的組成。
[0072] 前述發(fā)現(xiàn)對(duì)開(kāi)發(fā)新的靶向癌癥治療具有重要的啟示。例如，本公開(kāi)內(nèi)容的光敏VLP (還稱(chēng)為VLP綴合物)相對(duì)于具有非常有限遞送能力的其他靶向分子(例如抗體)而言提供一 定的優(yōu)勢(shì)。另外，本公開(kāi)內(nèi)容的光敏VLP可用于靶向由于尚未鑒定到合適的腫瘤表面特異性 決定簇而不能通過(guò)抗體或其他革G向分子革El向的廣泛多種腫瘤(例如，眼腫瘤）。此外，所述光 敏VLP可用于治療遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。另外，所述光敏分子可用于診斷和治療早期惡性或癌前期病變 (例如，轉(zhuǎn)化性、惡化前或惡性眼痣）。
[0073] 本文中使用的"病毒樣顆粒"（VLP)指有組織的衣殼樣結(jié)構(gòu)(例如，形狀為大致球形 或圓柱形），其包含Ll或Ll和L2殼粒(capsomer)的自裝配有序排列并且不含病毒基因組。病 毒樣顆粒在形態(tài)和抗原性上類(lèi)似于真正的病毒體(viron)，但是其缺乏病毒遺傳物質(zhì)（例 如，病毒核酸），從而使顆粒不具感染性。VLP可用于向接受者細(xì)胞遞送藥劑(例如，預(yù)防劑、 治療劑或診斷劑）或者閉合的環(huán)狀或線(xiàn)性DNA或RNA分子。應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)"病毒樣顆粒"或 "VLP"和"假病毒"或"PsV"在本文中可互換使用并且還可與術(shù)語(yǔ)"病毒樣納米顆粒"互換使 用。
[0074] 本文中使用的"祀向腫瘤的病毒樣顆粒"指靶向腫瘤(例如，癌性)細(xì)胞但不靶向非 腫瘤(例如，非癌性，或正常、健康的)細(xì)胞的VLP(例如，在完好組織中）。
[0075]根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的VLP相對(duì)于野生型乳頭瘤病毒VLP而言可具有經(jīng)修飾的免疫原 性和/或抗原性。所述VLP可例如由具有經(jīng)修飾免疫原性和/或抗原性的變體衣殼蛋白的殼 粒裝配。具有"經(jīng)修飾免疫原性和/或抗原性"的變體衣殼蛋白是這樣的衣殼蛋白，對(duì)其氨基 酸進(jìn)行了天然或合成修飾(例如，突變、替換、缺失、聚乙二醇化或插入）以降低或阻止衣殼 蛋白被已有(例如，內(nèi)源性)病毒血清型特異性抗體識(shí)別。變體衣殼蛋白可以是人乳頭瘤病 毒(HPV)Ll變體、非人乳頭瘤病毒Ll變體或基于來(lái)自不同HPV血清型之氨基酸組合的乳頭瘤 病毒Ll變體。例如，具有經(jīng)修飾免疫原性和/或抗原性的Ll變體可以是基于HPV血清型16和 HPV血清型31(在本文中稱(chēng)為"變體HPV16/31 Ll蛋白"-SEQ ID N0:1)的重組蛋白，其在國(guó)際 公布No.W0/2010/120266(其整體通過(guò)引用并入本文）中進(jìn)行了描述。
[0076]在一些實(shí)施方案中，VLP是乳頭瘤病毒VLP。所述VLP可以是人乳頭瘤病毒VLP(例 如，來(lái)自于可感染人的病毒），然而在另一些實(shí)施方案中，所述VLP為非人乳頭瘤病毒VLP。非 人VLP的實(shí)例包括由但不限于來(lái)自于以下的那些：牛乳頭瘤病毒、鼠乳頭瘤病毒、棉兔 (cotton-rabbit)乳頭瘤病毒和獼猴或恒河猴乳頭瘤病毒顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述 VLP是牛乳頭瘤病毒病毒樣納米顆粒(例如，1型病毒樣納米顆粒）（例如，由BPV Ll衣殼蛋白 或BPV Ll和BPV L2衣殼蛋白的組合裝配）。
[0077]本文中使用的"衣殼蛋白"指其中一些形成殼粒低聚體的蛋白質(zhì)單體。本文中使用 的"殼粒"指病毒衣殼的基本低聚體結(jié)構(gòu)單位，其為保護(hù)病毒(例如，人乳頭瘤病毒(HPV))的 遺傳物質(zhì)的外部蛋白質(zhì)覆蓋物。本公開(kāi)內(nèi)容的衣殼蛋白包括乳頭瘤病毒Ll主要衣殼蛋白 (major capsid protein)和乳頭瘤病毒L2次要衣殼蛋白（minor capsid protein)。在一些 實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的VLP僅包含LI衣殼蛋白，而在另一些實(shí)施方案中，所述VLP包含LI 和L2衣殼蛋白的混合物(或組合）。
[0078]在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白的百分比大于該病毒樣顆粒中L2衣 殼蛋白的百分比。例如，在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白的百分比為(病毒樣 顆粒中的總衣殼蛋白數(shù)量的）80%至100%。在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒中Ll衣殼蛋白 的百分比為 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。 在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒中L2衣殼蛋白的百分比為(該病毒樣顆粒中的總衣殼蛋白 數(shù)量的H %至25%。例如，在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒中L2衣殼蛋白的百分比為1 %、 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、 19%或 20%。
[0079]在一些實(shí)施方案中，病毒樣顆粒包含12至72個(gè)L2蛋白。在一些實(shí)施方案中，病毒樣 顆粒包含360個(gè)Ll蛋白和12至72個(gè)L2蛋白。在一些實(shí)施方案中，衣殼蛋白裝配成直徑為20至 60nm的病毒樣納米顆粒。例如，衣殼蛋白可裝配成直徑20、25、30、35、40、45、50、55或6011111的 病毒樣納米顆粒。
[0080] 本文中使用的"外衣殼蛋白"指暴露在VLP表面的衣殼蛋白。在一些實(shí)施方案中，外 衣殼蛋白（例如，Ll蛋白）與(例如，至少1個(gè))光敏分子綴合。
[0081] 本文中使用的"光敏分子"指當(dāng)選擇性地暴露于光時(shí)變得"活化"（還稱(chēng)為"光活 化"）的無(wú)毒分子。在一些實(shí)施方案中，活化的光敏分子在光激發(fā)之后重新發(fā)射光(例如，熒 光團(tuán)）。在一些實(shí)施方案中，活化的光敏分子在光激發(fā)之后可變得具有毒性或者可產(chǎn)生毒性 分子。例如，稱(chēng)為光敏劑的一類(lèi)光敏分子在吸收光之后可躍迀到激發(fā)態(tài)并發(fā)生氧的系間跨 越(intersystem crossing)以產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧(singlet oxygen)。這種單線(xiàn)態(tài)氧迅速攻擊其 遇到的任何有機(jī)化合物，因此高度細(xì)胞毒性的。
[0082]根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的多個(gè)方面，光敏分子可與VLP的衣殼蛋白（例如，Ll和/或L2衣殼 蛋白）綴合。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子與VLP的衣殼蛋白共價(jià)綴合。在一些實(shí)施方案 中，所述光敏分子與VLP的衣殼蛋白的賴(lài)氨酸殘基共價(jià)綴合。本文中可將與光敏分子綴合的 VLP稱(chēng)為"VLP綴合物"或"光敏VLP"。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子包含NHS(N-羥基琥珀 酰亞胺)酯基團(tuán)，其與衣殼蛋白的胺基團(tuán)（例如，賴(lài)氨酸或其他氨基酸的胺基團(tuán)）反應(yīng)以形成 共價(jià)酰胺鍵。
[0083] 光敏分子(photosensitive molecule，PM)與VLP的比例可變化。在一些實(shí)施方案 中，VLP:PM的比例為約1:10至約1:1000、約1:10至約1:500、約1:50至約1:500或約1:50至約 1:1000。即，在一些實(shí)施方案中，VLP可包含約10至約1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方案中， VLP:PM 的比例為1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1: 350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950或 1:1000。在一些實(shí)施方案中，所述￥1^可包含10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000個(gè)光敏分子。在一些實(shí)施方 案中，所述VLP可包含多于1000個(gè)光敏分子或少于10個(gè)光敏分子。
[0084] 1個(gè)以上光敏分子可與單個(gè)衣殼蛋白綴合。例如，單個(gè)衣殼蛋白（例如，Ll或L2衣殼 蛋白）可與1至5個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))光敏分子綴合。因此，衣殼蛋白的一個(gè)以上氨基酸 可與光敏分子綴合。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)衣殼蛋白可與1至2、1至3或2至3個(gè)光敏分子綴 合。因此，光敏分子可與單個(gè)衣殼蛋白的1、2、3、4或5個(gè)不同氨基酸（例如，賴(lài)氨酸、精氨酸 和/或組氨酸，或其他氨基酸)綴合。
[0085] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的光敏分子的實(shí)例包括但不限于熒光染料、紅外染料、近紅 外染料、卟啉分子和葉綠素分子。
[0086] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的熒光染料的實(shí)例包括但不限于：吖啶橙、吖啶黃、Alexa Fluor、7-氨基放射菌素 D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料、金胺-羅丹明染色劑、苯并蒽酮、 bimane、9, 10-雙（苯基乙炔基）蒽、5，12-雙（苯基乙炔基）并四苯、雙苯酰亞胺 (bisbenzimide)、黑光漆、鈣黃綠素、羧基熒光素、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯、羧基熒 光素琥珀酰亞胺酯、1-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9,10-二苯基蒽、香豆素、DAPI、暗淬滅劑（dark quencher)、Di0C6、DyLight Fluor、Fluo_3、 ?1110-4、？1110?1'(^6、焚光素、異硫氰酸焚光素、焚光素圖像引導(dǎo)的外科手術(shù)、；^1101'0-」3(16染 色劑、fura-2、fura_2-乙酰氧基甲基酯、GelGreen、GelRed、綠色焚光蛋白、七甲川染料 (heptamethine dye)、印度黃、Indo-I、螢光黃、螢光素、MCherry、部花青(Merocyanine)、尼 羅藍(lán)、尼羅紅、光學(xué)增白劑、二萘嵌苯（perylene)、焰紅染料（phloxine)、藻膽素 (phycobilin)、藻紅蛋白、藻紅素、碘化丙錠、pyranine、羅丹明、羅丹明123、羅丹明6G、 RiboGreen、RoGFP、紅焚?。╮ubrene)、（E)-二苯乙稀、（Z)-二苯乙稀、磺基羅丹明101、磺基 羅丹明B、SYBR Green I、synapto_pHluorin、四苯基丁二稀、四鈉三（紅菲繞啉二磺酸鹽）韋了 (Π )、德克薩斯紅(Texas Red)、鈦黃、TSQ、傘形酮(umbelliferone)、黃色熒光蛋白和YOYO-1〇
[0087] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的光敏染料的實(shí)例包括但不限于：HpD、卟吩姆鈉 (Photofrin?、Photogera_ V PhotosailHemporfin_)、m - τ H p c、替莫泊芬 (Foscan?)、維替泊芬（Visudyne?)、HPPH( photochlor?)、鈀-細(xì)菌-脫鎂葉綠 酸（Tookad?.)、5-ala、5氨基乙酰丙酸（.Levulan?)、5-ala甲酯（Metvix? )、.5_ ala節(jié)酯（Benzvix? )、5-ala己酯（.Hexvix?)、镥（π〗）-德卟啉或莫特沙芬-镥 (Lutex?、LuMn?、Angrin ⑨、Optrin? )、SnET2、本紫紅素乙酯錫（IV) (Purlytin⑧、jPliotrex?)、NPe6、單-L-天冬胺?；溥卜觘6、他拉泊芬鈉 (Talporfm(i、Laserphyrinii )、B 〇 p p、硼化原卟啉（BOPP?:)、鋅酞菁 (CGP5S847? )、硅酞菁（Pc4? )、磺化鋁酞菁衍生物的混合物（Photosens? )、 ΑΤΜΡη、乙酰氧基-四（β-甲氧基乙基-)卟啉烯）、ΤΗ9402和二溴羅丹明甲酯。
[0088] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的光敏染料的實(shí)例包括可用于熒光成像的那些（例如，近紅 夕Knir)熒光染料），例如La JoiiaBluejv 和:IRl)ye、R7〇〇DX。
[0089] 本公開(kāi)內(nèi)容還提供了向患有腫瘤的對(duì)象施用包含與衣殼蛋白綴合之光敏分子的 靶向腫瘤的病毒樣顆粒的方法，或向患有腫瘤的對(duì)象施用包含約50至約1000(例如，50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或 1000)個(gè)光敏分子之靶向腫瘤的病毒樣顆粒的方法。
[0090] 在一些實(shí)施方案中，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物，例如人。
[0091] 施用模式可通過(guò)注射、輸注、植入、表面施用或者通過(guò)通常用于遞送病毒樣顆粒的 任何其他方式。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)注射區(qū)域使用空心針、包被針、微型針或顯微操作 針。在一些實(shí)施方案中，施用模式通過(guò)注射到眼內(nèi)空間中或者注射到眼玻璃體中（例如，以 靶向眼腫瘤或已轉(zhuǎn)移到眼部的腫瘤）。
[0092] 可用于遞送本公開(kāi)內(nèi)容的病毒樣顆粒的試劑的試劑包括但不限于：鹽水、MgCl2、 海藻糖、透明質(zhì)酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或前述兩種或更多種試劑的任意組合。
[0093] 本公開(kāi)內(nèi)容的光敏分子可在合適的波長(zhǎng)下被活化。在一些實(shí)施方案中，所述光敏 分子的活化使其具有細(xì)胞毒性或者能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒性分子。合適的波長(zhǎng)包括但不限于：紫 外波長(zhǎng)、可見(jiàn)波長(zhǎng)、紅外波長(zhǎng)或近紅外波長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子在600nm至 800nm或660nm至740nm的波長(zhǎng)下被活化并且變得具有細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，所述光 敏分子在以下波長(zhǎng)下被活化并且變得具有細(xì)胞毒性：約600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、 650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、 770nm、780nm、790nm或800nnu在一些實(shí)施方案中，所述光敏分子在小于600nm或大于800nm 的波長(zhǎng)下被活化。用于光敏分子活化的合適波長(zhǎng)將取決于所使用的具體分子。
[0094] 本公開(kāi)內(nèi)容的光敏分子根據(jù)所述分子的類(lèi)型可通過(guò)紅外光、近紅外光或紫外光來(lái) 活化。例如，在一些實(shí)施方案中，可使用紅外激光、近紅外激光或紫外激光來(lái)活化VLP綴合物 的光敏分子。通過(guò)所述激光遞送的能量的范圍可以是約5J至約100J、約5焦耳(J)至約50J， 或約8J至約36J。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)所述激光遞送的能量為8J、9J、10J、11J、12J、13J、 14J、15J、16J、17J、18J、19J、20J、21J、22J、23J、24J、25J、26J、27J、28J、29J、30J、31J、32J、 33J,34J,35J,36J,37J,38J,39J,40J,41J,42J,43J,44J,45J,46J,47J,48J,49J,50J,51J, 52J、53J、54J、55J、56J、57J、58J、59J、60J、61J、62J、63J、64J、65J、66J、67J、68J、69J、70J、 71了、721、731、7封或751。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)所述激光遞送的能量為10幾2(^、30了、 40J、50J、60J、70J、80J、90J或100J。
[0095] 可向光敏分子(或光敏VLP)施加光或激光約5秒至約5分鐘。例如，在一些實(shí)施方案 中，向光敏分子施加光或激光5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55秒以活化所述分子。在 一些實(shí)施方案中，向光敏分子施加激光1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5分鐘，或者更久。應(yīng)理 解，向光敏分子施加光或激光的時(shí)間長(zhǎng)度可根據(jù)例如該激光的能量(例如，瓦特?cái)?shù))而變化。 例如，可向光敏分子施加具有較低瓦特?cái)?shù)的激光較長(zhǎng)的時(shí)間以活化所述分子。
[0096] 可在施用VLP綴合物后約30分鐘至約48小時(shí)向光敏分子(或VLP綴合物)施加光或 激光。例如，在一些實(shí)施方案中，在施用VLP綴合物后30、35、40、45、50或55分鐘向光敏分子 施加光或激光。例如，在一些實(shí)施方案中，在施用VLP綴合物后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)向光敏分子施加光或激光。在一些實(shí)施 方案中，在施用VLP綴合物后36或48小時(shí)向光敏分子施加光或激光。
[0097]可直接向腫瘤部位施加光或激光。例如，可通過(guò)照射眼部來(lái)活化靶向眼腫瘤的VLP 綴合物。
[0098] 根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，任何類(lèi)型的腫瘤均可以是靶標(biāo)。腫瘤的實(shí)例包括但不限于位于 眼部、肺、胸膜、肝、胰、胃、食管、結(jié)腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、腦脊膜、睪丸、腎、膀胱、頭、 頸、子宮頸和/或皮膚的那些。
[0099] 在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是眼腫瘤。所述眼腫瘤可位于玻璃體、脈絡(luò)膜腔、虹 膜、睫狀體、鞏膜、視網(wǎng)膜中央凹、視網(wǎng)膜、視盤(pán)或視神經(jīng)。
[0100]在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是癌性或惡性的。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是轉(zhuǎn) 移性的。還可靶向其他腫瘤。例如，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜诎邢蜃訉m頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、黑素 瘤癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、頭和/或頸癌細(xì)胞以及膀胱癌細(xì)胞的方法和組合物。
[0101] 組合物
[0102] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的病毒樣顆粒(病毒樣納米顆粒)是光敏分子綴合 的病毒樣納米顆粒。所述病毒樣納米顆粒包含來(lái)自乳頭瘤病毒的一種或兩種類(lèi)型的衣殼蛋 白。在一些實(shí)施方案中，所述衣殼蛋白是經(jīng)修飾的。衣殼蛋白通常自裝配成直徑為約55nm的 "空"原衣殼(proto-capsid)(例如，包含空核心的類(lèi)球形顆粒）。在原衣殼成熟形成病毒樣 納米顆粒(病毒樣顆粒)之后，隨后使病毒樣納米顆粒與光敏分子(例如，IR700染料，例如 m.[)yew)700DX，由U-COlf制造的紅外染料)化學(xué)綴合。
[0103] 在一些實(shí)施方案中，所述光敏病毒樣納米顆粒提供在一次性使用小瓶(例如，硼硅 酸鹽玻璃小瓶）中的無(wú)菌溶液(例如，1或2ml)中。在一些實(shí)施方案中，所述光敏病毒樣納米 顆粒在無(wú)菌水溶液中提供，所述無(wú)菌水溶液任選地包含似(：1、1((：1、他冊(cè)〇4.2!1 20、1(趾〇4或者 前述兩種或更多種的任意組合。在一些實(shí)施方案中，NaCl可以以400至600mMol(例如， 500mMol)的濃度存在于溶液中。在一些實(shí)施方案中，KCl可以以2至6mMol(例如，2.7mMol)的 濃度存在于溶液中。在一些實(shí)施方案中，Na 2HP〇4.2H20可以以5至15mMol (例如，IOmMol)的濃 度存在于溶液中。在一些實(shí)施方案中，KH2PO4可以以1至3mMol (例如，2mMol)的濃度存在于溶 液中。
[0104] 在一些實(shí)施方案中，光敏病毒樣納米顆粒是經(jīng)稀釋的并且使用通常用于眼科操作 的無(wú)菌的注射器或針來(lái)眼內(nèi)施用。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了其他施用途徑和向其他腫瘤和/轉(zhuǎn) 移瘤施用，如本文中的其他部分所述。
[0105] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)病毒樣納米顆粒包含12至72個(gè)殼粒，其中每個(gè)殼粒包含5 分子的Ll衣殼蛋白（例如，每分子為55至56kD)和1分子的L2衣殼蛋白（例如，每分子為 52kD)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)病毒樣納米顆粒包含12至72個(gè)殼粒，其中每個(gè)殼粒僅包含 Ll衣殼蛋白（例如，每個(gè)殼粒5分子Ll蛋白）。
[0106] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)病毒樣納米顆粒具有10至1000個(gè)分子(例如，500個(gè)分子） 的光敏分子(IR700染料，例如丨:RDye K'7〇〇DX)與蛋白質(zhì)的至少一個(gè)氨基酸(例如，賴(lài)氨酸氨 基酸)化學(xué)綴合(例如，通過(guò)酰胺鍵）。
[0107] 產(chǎn)生病毒樣顆粒的方法
[0108] 為了產(chǎn)生本公開(kāi)內(nèi)容的光敏病毒樣納米顆粒，可將哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如293T細(xì)胞 (例如，HEK293F細(xì)胞））培養(yǎng)(例如，懸浮培養(yǎng))并用編碼BPV或HPV Ll(或者Ll和L2)衣殼蛋白 的核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。這誘導(dǎo)形成原衣殼（例如，如Buck等Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19,2007年12月中所述）。在細(xì)胞團(tuán)回收和破碎之后，可用benzonase 處理對(duì)原衣殼進(jìn)行宿主DNA清除并使其經(jīng)受隨后的體外成熟過(guò)程以形成穩(wěn)定的病毒樣納米 顆粒。在純化之后，可使病毒樣納米顆粒與光敏分子(例如，IR700 NHS酯)化學(xué)綴合以產(chǎn)生 光敏病毒樣納米顆粒。圖23示出了本文中提供的產(chǎn)生過(guò)程的一個(gè)實(shí)例的示意性圖示。
[0109] 因此，在一些方面，本文中提供了產(chǎn)生光敏分子的方法，其包括(a)用編碼一種或 更多種衣殼蛋白的核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而形成原衣殼，（b)收集原衣殼并使原衣殼經(jīng)受體 外成熟過(guò)程，從而形成穩(wěn)定的病毒樣納米顆粒，以及(C)使病毒樣納米顆粒與50至1000個(gè)光 敏分子綴合。在一些實(shí)施方案中，所述病毒樣納米顆粒與500個(gè)光敏分子綴合。在一些實(shí)施 方案中，所述病毒樣納米顆粒通過(guò)酰胺鍵與光敏分子綴合(例如，通過(guò)光敏分子的酯基與病 毒樣納米顆粒衣殼蛋白的氨基酸的胺基團(tuán)反應(yīng)）。 實(shí)施例
[0110] 實(shí)施例 1-//?/_>% K700DX 的綴合
[0111] VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒)與 光敏分子(例如，丨:RI)yefi700DX)的化學(xué)綴合操作如下。通常來(lái)說(shuō)，使VLP的溶液以lmg/ml的 濃度維持在PBS，pH = 7.2和0.3至0.5M NaCl中。IR700(例如，IRDye:?700DX)分子作為干 NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)酯(NHS-酯與蛋白質(zhì)上的胺基團(tuán)反應(yīng)以形成共價(jià)酰胺鍵）（圖10A) 由生產(chǎn)商供應(yīng)。蛋白質(zhì)上的可利用胺基團(tuán)是蛋白質(zhì)的氨基末端或氨基酸(例如，賴(lài)氨酸)上 的ε_(tái)氨基。將干燥固體IR700-NHS酯以5mg/ml的濃度溶解于DMSO中并冷凍儲(chǔ)存。通常來(lái)說(shuō)， VLP:染料的不同比例通過(guò)將不同量的IR700-NHS與固定量的VLP(通常為Iml的I3BS中的Img/ ml溶液)混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。典型的比例和IR700-NHS的量列于下表中： 「01121 券1
[0114] 為了實(shí)現(xiàn)200:1的比例，將Iml的PBS中的lmg/ml VLP與3.2μ1 IR700-NHS酯溶液混 合。使這些反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2至4小時(shí)。在反應(yīng)完成之后，通過(guò)肝素親和柱色譜純化VLP以 使未結(jié)合的IR700-NHS與新形成的VLP-IR700綴合物(還稱(chēng)為光敏VLP)分離。
[0115] 實(shí)施例2_衫畑辦財(cái)?的綴合
[0116] Visudynea^VLP的綴合遵循略不同于IR7OO-NHS的方案。Visudyne*分子需要 在綴合至VLP之前與NHS進(jìn)行官能化。該官能化通過(guò)使用EDC(1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽)來(lái)實(shí)現(xiàn)。EDC用于官能化具有游離羧酸分子的分子，例如Vimidyne ii (參見(jiàn)圖10B，用圓圈標(biāo)出），并且在磺基-NHS存在下有效地將NHS部分轉(zhuǎn)移至該試劑。該反應(yīng) 方案概括于圖11中。簡(jiǎn)言之，使約2mM EDC和2 X摩爾過(guò)量的磺基-NHS與不同量的 Visudyne#反應(yīng)。在于室溫下15分鐘之后，通過(guò)添加2-巰基乙醇直至2〇mM的終濃度來(lái)停止 反應(yīng)。將該反應(yīng)混合物添加至PBS，pH=7.2+0.3-0.5M NaCl中的lmg/ml濃度的Img VLP并在 室溫下孵育2至4小時(shí)。最后，通過(guò)肝素親和柱色譜使未反應(yīng)的組分與VLP綴合物分離。
[0117]實(shí)施例3-VLP結(jié)合特異性由HSPG介導(dǎo)并且受肝素的抑制。
[0118] 在以下條件下處理懸浮的SK-0V-3細(xì)胞:無(wú) VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白 和!^1^蛋白之組合的病毒樣納米顆粒），與人丨6\3卩1|101'1<丨88(圖3/1488*?^"）或 IR700(圖3，"11?700*?^"）綴合的￥1^，或在批?6存在下孵育的相同￥1^綴合物。在孵育之 后，使這些培養(yǎng)物經(jīng)受4焦耳的690mm近紅外光。未經(jīng)光輻照細(xì)胞的平行組用作對(duì)照。在輻照 之后，評(píng)估培養(yǎng)物的細(xì)胞死亡程度。圖3顯示顯著細(xì)胞殺傷的唯一條件是細(xì)胞暴露于 IR700* PsV和4焦耳的光。在暴露于AF488* PsV下未觀(guān)察到類(lèi)似的細(xì)胞死亡，表明細(xì)胞死亡 是IR700染料綴合物特異性的。此外，在HSPG存在下細(xì)胞死亡幾乎完全消除，表明VLP與細(xì)胞 的結(jié)合對(duì)于IR700介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是至關(guān)重要的。
[0119] 實(shí)施例4-細(xì)胞死亡取決于紅外輻射以及VLP和IR700的量。
[0120]用不同濃度的VLP(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒 樣納米顆粒）處理懸浮的SK-0V-3細(xì)胞，所述VLP已綴合有不同量的IR700染料（例如， IRDyeil^OODX)。使用未與IR700染料綴合的VLP作為對(duì)照。在孵育之后，使這些培養(yǎng)物經(jīng)受 0或16焦耳的690nm近紅外光。在光處理之后，評(píng)估細(xì)胞死亡的程度。圖4顯示細(xì)胞死亡依賴(lài) 于IR700染料的存在和光處理二者。這得到以下觀(guān)察結(jié)果的支持:細(xì)胞死亡依賴(lài)于VLP濃度 和IR700染料綴合比例二者。
[0121] 實(shí)施例5-SK0V-3細(xì)胞在經(jīng)與IR700綴合的VLP處理之后于輻照后的體外細(xì)胞死亡。
[0122] 將SK0V-3卵巢癌細(xì)胞平板接種在24孔板上并用兩種不同濃度的光敏VLP顆粒(例 如，與IR700染料綴合之包含變體HPV16/31L1蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒） (2.5yg(紅)和0.25yg(藍(lán)））在37°C下處理1小時(shí)。在結(jié)合之后，將細(xì)胞洗滌，隨后用4J的光處 理?；趯?duì)LDH釋放的酶促評(píng)估來(lái)確定細(xì)胞死亡(通過(guò)測(cè)量490nm下的吸光度來(lái)確定）。分別 測(cè)試三種不同摩爾比的VLP: IR700綴合：1:500、1:1000和1:2000。圖5顯示對(duì)于這兩個(gè)受試 濃度而言，均在1:1000的VLP: IR700( "PsV: IR70"）比例下觀(guān)察到最大的細(xì)胞死亡效力。使用 去污劑介導(dǎo)的細(xì)胞裂解作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0123] 實(shí)施例6-IR700_PsV復(fù)合物的結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)
[0124] 圖6示出了對(duì)對(duì)照VLP(PsV) (A)和IR700綴合的VLP(PsV) (B)的ESI-TOF分析。在圖 6B中，將反應(yīng)設(shè)置成實(shí)現(xiàn)每個(gè)VLP(PsV)分子與1000個(gè)IR700分子綴合。ESI-TOF掃描中的信 號(hào)尖峰對(duì)應(yīng)于VLP Ll蛋白。相對(duì)于對(duì)照樣品，在綴合樣品中觀(guān)察到5517amu的轉(zhuǎn)移，所述綴 合樣品對(duì)應(yīng)于平均3個(gè)綴合IR700分子（1840amu)/Ll蛋白或者約1000個(gè)IR700分子/VLP(通 常來(lái)說(shuō)，每個(gè)VLP具有360個(gè)Ll)。
[0125] 實(shí)施例7-藥劑結(jié)合決定在眼黑素瘤細(xì)胞系中細(xì)胞死亡的程度。
[0126] 使懸浮的眼黑素瘤細(xì)胞系(92.1;HER2J暴露于不同稀釋度之與IR700染料(例如， IRDyeii 700DX)綴合的Herceptiliii抗體或與IR7〇〇染料綴合的VLP (例如，包含變體 HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒）。然后，評(píng)估平行培養(yǎng)物的藥劑 結(jié)合（圖7C)或者在不存在（圖7B)或存在（圖7A)16焦耳的690nm近紅外光下的細(xì)胞死亡。圖 7C顯示VLP與92.1眼黑素瘤細(xì)胞的結(jié)合具有濃度依賴(lài)性，而基本不存在Herceptiiili!抗體 結(jié)合。圖7B顯示，在光不存在下，無(wú)細(xì)胞死亡。圖7A顯示僅在經(jīng)光敏VLP處理的細(xì)胞中的濃度 依賴(lài)性細(xì)胞死亡。
[0127] 實(shí)施例8-藥劑結(jié)合決定在卵巢癌細(xì)胞系中細(xì)胞死亡的程度。
[0128] 使懸浮的SK-0V-3細(xì)胞(HER2-)暴露于不同稀釋度之與IR700染料(例如，IRDve wi V 700DX)綴合的Herceptin8抗體或VLP顆粒(例如，包含變體HPVl6/31 Ll蛋白和HPV L2蛋 白之組合的病毒樣納米顆粒）。然后，評(píng)估平行培養(yǎng)物的H:erceptin#SvLP結(jié)合（圖8C)或 者在不存在（圖8B)或存在（圖8A) 16焦耳的690nm近紅外光下的細(xì)胞死亡。圖8C顯示，VLP結(jié) 合在sk-ov-3細(xì)胞中達(dá)到飽和。.Herceptin #結(jié)合也是濃度依賴(lài)性的，但是相對(duì)于VLP而言 程度降低。圖8B顯示，在不存在光下，無(wú)細(xì)胞死亡。圖8A顯示在兩種條件下均具有濃度依賴(lài) 性細(xì)胞死亡，但是與結(jié)合類(lèi)似，在VLP下響應(yīng)飽和，而在.Hereeptin iil下細(xì)胞死亡出現(xiàn)濃度 依賴(lài)性提高。這些數(shù)據(jù)表明，與IR700綴合的VLP(PsV-IR700)比與IR700綴合的 1161^只付11^(1161^印1^11-11? 7〇0)更有效。
[0129] 實(shí)施例9-疫苗誘導(dǎo)的抗HPV16中和性抗體不阻斷BPV* IR 700 VLP與眼黑素瘤細(xì) 胞系92.1的結(jié)合。
[0130] 測(cè)試含有不同抗體的血清樣品抑制光敏VLP顆粒(例如，HPV16 VLP或BPV VLP)與 92.1眼黑素瘤細(xì)胞系結(jié)合的能力。圖9顯示"無(wú)血清"或"首次用于實(shí)驗(yàn)的血清"（na'ive serum)條件不含中和VLP結(jié)合的活性。此外，觀(guān)察到的阻斷活性對(duì)病毒血清型具有特異性。 即，僅與IR700染料綴合的人乳頭瘤病毒樣顆粒(HPV16-IR700)被含HPV16抗體的血清中和。 與IR700綴合的牛乳頭瘤病毒樣顆粒(BPV-IR700)不會(huì)被含HPV16特異性抗體的血清中和。
[0131] 實(shí)施例10-免疫原性評(píng)價(jià)
[0132] 在與實(shí)施例9中所述類(lèi)似的研究中，通過(guò)連續(xù)稀釋含有針對(duì)HPV16或BPV之抗體的 血清來(lái)確定中和效價(jià)。表2中所述的結(jié)果顯示針對(duì)HPV16的抗體僅中和HPV16。此外，針對(duì)BPV 的抗體僅中和BPV。因此，不存在HVP16抗體對(duì)BPV以及BPV抗體對(duì)HVP16的交叉反應(yīng)性。
[0133] 表2
[0135] 實(shí)施例11-結(jié)合研究
[0136] 該實(shí)施例的目的是評(píng)估病毒樣納米顆粒與多種類(lèi)型癌細(xì)胞的結(jié)合。所述病毒樣顆 粒包含人乳頭瘤病毒16(HPV16)衣殼蛋白、變體HPV16/31 Ll衣殼蛋白和牛乳頭瘤病毒 (BPV)衣殼蛋白。另外，對(duì)含有Ll和L2衣殼蛋白或者僅含Ll衣殼蛋白的病毒樣納米顆粒進(jìn)行 測(cè)試以確定病毒樣納米顆粒與癌細(xì)胞的結(jié)合是否依賴(lài)于L2。該研究的結(jié)果顯示BPV病毒樣 納米顆粒和HPV病毒樣納米顆粒具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。
[0137] 對(duì)一大組細(xì)胞系進(jìn)行篩選，其包括:雜細(xì)胞系（例如，293TT、HaCaT、PAM_212和TC-l)、子宮頸細(xì)胞系（例如，HeLa、SiHa、CaSki和C-33A)、卵巢細(xì)胞系（例如，M0SEC、SHIN-3、SK-0￥-3、肝-3 45-2、厶2780、0￥〇厶1?-3和(^^1?-4)、黑素瘤細(xì)胞系（例如，816卩10、51(]\^1^-2、 SKMEL-5、SKMEL-28和UACC)、眼黑素瘤細(xì)胞系（例如，92.1、MKT-BR、0CM-1 和UW-I)、肺細(xì)胞系 (例如，NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460 和 NCI-H522)、頭頸細(xì)胞系（例如，CAL-33(HPV-)、FaDu (HPV-)、HSC-3(HPV_)、SNU-1076(HPV_)、UM-SCC-47(HPV+)、UPCI-SSC-90(HPV+)和UPCI-SCC-154 (HPV+))，以及膀胱細(xì)胞系（例如，5637、J82、RT112、SCaBER、SVHUC、T24、UMUC-3、 UMUC-5)。
[0138] 在實(shí)驗(yàn)之前，使病毒樣納米顆粒與AlexaFlu〇r488綴合使得容易且直接地分析病 毒樣納米顆粒與細(xì)胞表面的結(jié)合。使用不干擾結(jié)合的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-酯化學(xué)來(lái)使 AlexaFluor488與病毒樣納米顆粒連接。在10μg/ml、lμg/ml和0. Ιμ/ml的濃度下測(cè)試每種病 毒樣納米顆粒。
[0139] 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理以將其從組織培養(yǎng)板的塑料表面移除，洗滌并允許在搖 動(dòng)臺(tái)上于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在37°C下復(fù)蘇4小時(shí)。然后，將細(xì)胞洗滌，計(jì)數(shù)并以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔 置于96孔圓底板的磷酸緩沖鹽水(PBS)/2%胎牛血清(FBS)中。將病毒樣納米顆粒以100μΙ PBS/2%FBS的終體積添加至細(xì)胞。還向孔添加經(jīng)與肝素預(yù)孵育的病毒樣納米顆粒（lmg/ml， 1小時(shí)，4°C )，作為對(duì)照。然后，將細(xì)胞和病毒樣納米顆粒在4°C下孵育1小時(shí)（在暗處），用 PBS/2% FBS洗滌兩次并用4%多聚甲醛在室溫下固定15分鐘。最后，將細(xì)胞再次洗滌，重懸 于200μ1 PBS/2% FBS中并使用BD FACSDIVA?(BD Biosciences，San Jose，CA)和FlowJo軟 件在BD FACSCANTO? II(K) Biosciences，San Jose，CA)上進(jìn)行分析。
[0140] 使用 TC-l、HeLa、SK-0V-3、SKMEL-28、92.1、NCI-H322M、HSC-3、UPCI-SCC-15^PT24 細(xì)胞系的結(jié)果以直方圖示于圖12中。由圖12可以明顯看出：在結(jié)合測(cè)定中，所有的病毒樣納 米顆粒不管其血清型或組成(LI相對(duì)于L1/L2)都與癌細(xì)胞結(jié)合。此外，肝素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，表明 病毒樣納米顆粒結(jié)合是特異性且HSPG依賴(lài)性的。
[0141] 實(shí)施例12-生物分布時(shí)間過(guò)程
[0142] 該實(shí)施例的目的是評(píng)估病毒樣顆粒在靜脈內(nèi)注射到荷瘤動(dòng)物之后腫瘤的定位和 清除的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
[0143] 純病毒樣納米顆粒通過(guò)用IR700染料(例如，IRDye?700DX)以1:500的病毒樣納 米顆粒:染料比例標(biāo)記病毒樣納米顆粒(例如，包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2之組合 的病毒樣納米顆粒)來(lái)制備。光敏病毒樣納米顆粒使用0PTIPREP?密度滴度介質(zhì)通過(guò)密度梯 度超速離心來(lái)純化。
[0144] 在05781/6白鼠中通過(guò)皮下注射10(^1?83中的2\105個(gè)1'(：-1癌細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生腫瘤。 約兩周之后，將動(dòng)物隨機(jī)分成處理組。通過(guò)靜脈內(nèi)注射使荷瘤動(dòng)物接受I 3BS或200yg光敏病 毒樣納米顆粒(1〇〇μ1體積）。在注射后12或24小時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。在安樂(lè)死之后，收獲 腫瘤組織并對(duì)IR700染料(例如，IRDye?700DX)的熒光進(jìn)行成像，其指示光敏病毒樣納米 顆粒的存在。
[0145] 圖13B顯示從12小時(shí)和24小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的腫瘤組織中均具有可檢出的 IR700染料(例如，IRDye? 700DX)熒光，而在PBS對(duì)照（12小時(shí)時(shí)間點(diǎn)）中未檢測(cè)到熒光。月中 瘤組織中的定量總熒光繪制于圖14中所描繪的圖中。
[0146] 實(shí)施例13-生物分布時(shí)間過(guò)程
[0147] 該實(shí)施例的目的是評(píng)估病毒樣顆粒在靜脈內(nèi)注射到荷瘤動(dòng)物之后腫瘤的定位和 清除的時(shí)間過(guò)程。
[0148] 將經(jīng)純化的病毒樣納米顆粒在裂解物中用AlexaFluor488標(biāo)記并使用0PTIPREP? 密度滴度介質(zhì)通過(guò)密度梯度超速離心進(jìn)行純化。
[0149] 在白化C57B1/6小鼠中通過(guò)皮下注射100μΙ PBS中的2X105個(gè)TC-I癌細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生 腫瘤。約2周之后，通過(guò)靜脈內(nèi)注射以100μΙ的體積遞送200yg光敏病毒樣納米顆粒。在注射 光敏病毒樣納米顆粒之后于以下時(shí)間點(diǎn)收獲腫瘤4=1、2、4、8、12、24、48和72小時(shí)。在收獲 之后，將腫瘤碎片冷凍以用于顯微鏡評(píng)估。對(duì)于該顯微鏡評(píng)估，對(duì)組織切片進(jìn)行進(jìn)一步染 色。將針對(duì)HPV16的兔多克隆血清與AlexaFluor-488二抗聯(lián)合使用。將血管用大鼠抗⑶31抗 體和抗大鼠 AlexaFluor-594二抗共染色。將細(xì)胞核用DAPI突出顯示。
[0150] 數(shù)據(jù)(原位圖像未示出）證明在1-小時(shí)時(shí)間點(diǎn)存在光敏病毒樣納米顆粒。信號(hào)的定 位顯示與血管中相關(guān)。最高染色水平顯示出現(xiàn)在8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，并且在8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)光敏病 毒樣納米顆粒顯示正從血管中向腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。最后，在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，顯示腫瘤 中具有很低的病毒樣納米顆粒信號(hào)。
[0151] 實(shí)施例14-全身性施用后的體內(nèi)效力
[0152] 設(shè)計(jì)該實(shí)施例中所示的研究以測(cè)量單次處理后24小時(shí)的腫瘤生存力。該研究建立 了長(zhǎng)期體內(nèi)研究的指導(dǎo)方案。
[0153] 完整的研究設(shè)計(jì)示于圖15中。根據(jù)腫瘤大小的范圍，將動(dòng)物隨機(jī)分配成使得大和 小腫瘤在每個(gè)組(η = 3，鹽水處理組;η = 5，IR700(例如IRDye?7〇〇DX)-光敏病毒樣納米顆 粒處理組）中平均分布。在光處理前12小時(shí)靜脈內(nèi)施用病毒樣納米顆粒。測(cè)試100微克（100μ g)和200yg劑量。光處理包括25J(在400mW下62.3秒)或50J(在400mW下125秒）。24小時(shí)之后， 收獲腫瘤并使用膠原酶和DNA酶進(jìn)行處理以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。然后，施用BD 黃色染色劑，并將細(xì)胞放置通過(guò)FACSCANT0? π。數(shù)據(jù)作為死細(xì)胞的百分 比來(lái)報(bào)道，如Pacific orange通道中的焚光位移所指示的（圖16Α)。
[0154] 2 0 0 μ g單劑量的I R 7 0 0 (例如，IRBye? 700DX)光敏病毒樣納米顆粒 (nanoparticle，NP)在用50J的光處理之后能夠殺傷大部分的腫瘤細(xì)胞（圖16B和圖17C)。當(dāng) 用25J的光處理腫瘤時(shí)，200yg NP下的殺傷水平降低接近一半（圖16B和圖17B)。IOOyg的NP 在25J光下不足以誘導(dǎo)殺傷（圖16B和圖17B);然而在50J劑量下觀(guān)察到一定程度的腫瘤死亡 (圖16B和圖17C)。該研究為體內(nèi)研究提供了必需的IR700(例如，:丨RDyf 700DX)光敏病毒 樣納米顆粒和光劑量信息。
[0155] 實(shí)施例15-免疫系統(tǒng)活化研究
[0156] TC-I腫瘤模型能夠在免疫活性動(dòng)物中檢測(cè)用病毒樣納米顆粒處理之后的抗腫瘤 免疫誘導(dǎo)。TC-I腫瘤系由經(jīng)HPV16癌基因 E6和E7以及表達(dá)C-Ha-Ras的突變基因永生化的 C57B1/6肺上皮細(xì)胞發(fā)展而來(lái)(Lin KY，等，Cancer Research. 56( 1): 21-6，1996)。這些細(xì)胞 可皮下植入或者，對(duì)于研究轉(zhuǎn)移模型，其可靜脈內(nèi)注射以將細(xì)胞接種在肺中。近二十年來(lái)， 這些細(xì)胞已用于測(cè)試E6和E7治療性疫苗的效力。E7以C57B1/6為背景具有獨(dú)特的MHC I類(lèi)表 位，已表明如果可引發(fā)針對(duì)它的CD8 T-細(xì)胞應(yīng)答，則其具有保護(hù)性（H-2Db，aa 49-57 RAHYNIVTF)(Feltkamp MC，等European Journal of Immunology.23(9):2242-9,1993)?？?如下檢測(cè)這些應(yīng)答:對(duì)細(xì)胞進(jìn)行四聚體染色并用肽重新刺激細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因 子染色。
[0157] 劑量響應(yīng)研究：向動(dòng)物皮下接種100μΙ PBS中的2 X IO5個(gè)TC-I細(xì)胞。在接種后約兩 周，將動(dòng)物隨機(jī)分成六組：（1)無(wú)處理對(duì)照；（2)無(wú)光的IOOyg病毒樣納米顆粒（標(biāo)記有 IRDye?700DX且包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白的組合)對(duì)照；（3)PBS與50J/cm2 光對(duì)照；（4)200yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光；（5)100yg病毒樣納米顆粒與50J/cm2光;和 (6) 50yg病毒樣納米顆粒與50 J/cm2光。通過(guò)靜脈內(nèi)注射使小鼠接受100μΙ體積的PBS或病毒 樣納米顆粒，并在12小時(shí)后使用690nm激光向腫瘤施加光。24小時(shí)后將腫瘤收獲，消化以產(chǎn) 生單細(xì)胞懸液并用生存力染色劑染色以測(cè)量死細(xì)胞的百分比（圖18，上方）。
[0158] 高劑量組中的幾只動(dòng)物經(jīng)歷與腫瘤溶解綜合征（tumor lysis syndrome)相關(guān)的 癥狀，這可能歸因于大量且迅速的腫瘤壞死并且細(xì)胞內(nèi)成分釋放到動(dòng)物的系統(tǒng)中。盡管 "lOOyg病毒樣納米顆粒與50J/cm 2光"組中沒(méi)有死亡，但是該組中的小鼠的確展現(xiàn)出一些疾 病體征（圖18,上方）。"無(wú)光的IOOyg納米顆粒"和"PBS與50J/cm 2光"組未展現(xiàn)出疾病體征， 表明所觀(guān)察的響應(yīng)是由病毒樣納米顆粒和光的組合引起的。總之，接受病毒樣納米顆粒和 光的所有組中均具有明顯的壞死。所有組中均發(fā)生最大殺傷并且未觀(guān)察到劑量響應(yīng)(圖18， 下方）。
[0159] 存活研究：向動(dòng)物皮下接種100μΙ PBS中的2X IO5個(gè)TC-I細(xì)胞。在接種后約2至3 周，將動(dòng)物隨機(jī)分成處理組(25yg病毒樣納米顆粒)和安慰劑組(僅PBS)。使小鼠接受兩輪處 理，相隔三天。認(rèn)為以下為一次處理:單次靜脈內(nèi)注射1〇〇μ1的25yg病毒樣納米顆?；驘o(wú)菌 1^，12小時(shí)后使用69〇11111激光以5(^/〇11 2進(jìn)行光處理。每3至4天測(cè)量腫瘤大小，并且當(dāng)動(dòng)物 的腫瘤大小達(dá)到> 1500mm3時(shí)（圖19A)，對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死。
[0160] 在腫瘤小于500mm3的動(dòng)物中，用病毒樣納米顆粒處理能夠延遲生長(zhǎng)或輻射腫瘤 (圖19B和19C)。在安慰劑組中，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)無(wú)作用。開(kāi)始時(shí)具有最小腫瘤的兩只動(dòng)物 在第一次處理的7天內(nèi)未表現(xiàn)出腫瘤跡象，并且有三只動(dòng)物表現(xiàn)出腫瘤減小的跡象（圖 19C)〇
[0161] 免疫學(xué)研究:對(duì)于免疫學(xué)讀出，在第0天(第一次處理之前）、第10天和第17天收集 血液。裂解紅細(xì)胞并將剩余的細(xì)胞分成兩半，一半對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(⑶62L、⑶127、⑶103、 CD69、CD4、CD8、CD3、H2-DbE7(49-57)四聚體)進(jìn)行染色。將另一半用HPV16E7肽49-57重新刺 激4.5小時(shí)，之后用針對(duì)⑶4、⑶8和IFN- γ的抗體以及生存力染料進(jìn)行染色以區(qū)別活細(xì)胞。
[0162] 在腫瘤生長(zhǎng)受控的兩只動(dòng)物的血液中，可檢測(cè)到"Ε7四聚體+CD8+T-細(xì)胞"和"INF-γ分泌性CD8+細(xì)胞"（在用Ε7肽重新刺激之后)二者，表明已引發(fā)潛在的抗腫瘤響應(yīng)(圖19)。
[0163] 實(shí)施例16-組織學(xué)分析
[0164] 光敏病毒樣納米顆粒(例如，與IR700染料綴合的包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒)在組織學(xué)水平的作用使用鼠異種移植模型進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn) 言之，將1.5 X IO6個(gè)92.1葡萄膜黑素瘤(uveal melanoma)細(xì)胞植入到nu/nu小鼠后脅的皮 下間隙中。允許腫瘤達(dá)到約200mm3,此時(shí)通過(guò)靜脈內(nèi)注射200yg光敏病毒樣納米顆粒來(lái)處理 動(dòng)物。在注射光敏病毒樣納米顆粒后12小時(shí)，用50J/cm 2的690nm近紅外光輻照腫瘤部位。再 24小時(shí)之后，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，將腫瘤組織切除，在福爾馬林中固定，進(jìn)行石蠟包埋和處 理以用于標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢查。
[0165] 蘇木精和伊紅(H&E)圖像揭示:相比較于未處理組具有高度壞死（圖像未示出）。當(dāng) 與對(duì)照腫瘤相比時(shí)，經(jīng)光敏病毒樣納米顆粒和激光處理的腫瘤具有蒼白外觀(guān)。通過(guò)在較高 放大倍數(shù)下進(jìn)行檢查，經(jīng)光敏病毒樣納米顆粒處理腫瘤的細(xì)胞與經(jīng)對(duì)照處理的腫瘤相比表 現(xiàn)出顯著的細(xì)胞質(zhì)損失。另外，壞死程度覆蓋整個(gè)腫瘤，從而得出NIR光穿透通過(guò)整個(gè)腫瘤 組織深度的結(jié)論。
[0166] 實(shí)施例17-葡萄膜黑素瘤的原位異種移植模型中的病毒樣納米顆?；钚?br>[0167] 最常見(jiàn)的眼部原發(fā)性惡性腫瘤是葡萄膜黑素瘤(UM)。在美國(guó)，每年出現(xiàn)約2,000位 患者，而在歐洲發(fā)生得更為頻繁。盡管對(duì)UM存在數(shù)種治療選擇，但是沒(méi)有哪種治療能可靠地 控制腫瘤生長(zhǎng)、保護(hù)視力并且使輻射相關(guān)副作用的發(fā)生最小化。
[0?68]病毒樣納米顆粒光治療(phototherapy，PT)是一種新的分子祀向性癌癥治療，其 涉及需要施用藥物和光活化二者的兩階段過(guò)程。病毒樣納米顆粒PT的藥物部分是與 IRDye?7〇〇DX(用作光敏化劑的一種近紅外(NIR)酞菁染料)綴合的光敏病毒樣納米顆粒 (NP)，之后施加設(shè)計(jì)成治療患有原發(fā)性葡萄膜黑素瘤之成人的非熱NIR光。
[0169]在本研究中，在葡萄膜黑素瘤的原位異種移植模型中對(duì)光敏病毒樣納米顆粒的抗 癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在該模型中，將人葡萄膜黑素瘤細(xì)胞植入免疫抑制兔的脈絡(luò)膜腔中，并允 許其生長(zhǎng)。當(dāng)通過(guò)眼底檢查(fundoscopy)可觀(guān)察到腫瘤時(shí)，將動(dòng)物分配成處理組或?qū)φ战M。 在兩種情況下，均通過(guò)眼底檢查和超聲追蹤動(dòng)物的進(jìn)行性腫瘤生長(zhǎng)或?qū)μ幚淼捻憫?yīng)。在研 究結(jié)束之后，還通過(guò)大體病理學(xué)和組織病理學(xué)檢測(cè)攜帶腫瘤的眼部。
[0170]該研究使用總共20只植入有92.1葡萄膜黑素瘤細(xì)胞系的兔來(lái)進(jìn)行?？傆?jì)，20只動(dòng) 物中有11只發(fā)生腫瘤。有兩只動(dòng)物在處理之前的隨訪(fǎng)期期間意外死亡;將這些動(dòng)物用作未 處理對(duì)照。未經(jīng)激光處理的幾只動(dòng)物具有額外的眼腫瘤;將些動(dòng)物用作內(nèi)對(duì)照。將前房中具 有腫瘤的動(dòng)物從研究中排除。
[0171] 與對(duì)照動(dòng)物相比，所有的經(jīng)處理腫瘤均表現(xiàn)出主要腫瘤響應(yīng)，這通過(guò)眼底檢查、大 體病理學(xué)和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)得到證明。鄰近腫瘤的視網(wǎng)膜組織不受處理的影響。
[0172] 綜上所述，基于在施用光敏病毒樣納米顆粒并施用激光之后觀(guān)察到的腫瘤響應(yīng)和 壞死的程度，本文中提供的治療方法可用于治療葡萄膜黑素瘤。
[0173] 研究時(shí)間表:兩個(gè)處理組：1)全腫瘤處理;2)無(wú)處理。
[0174] 表3
[0176] 方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
[0177] 測(cè)試體系
[0178] 表4
L 0180」 模型
[0181] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0182] 人葡萄膜黑素瘤細(xì)胞系92.1(由Jerry Y博士Niederkorn，University of Texas Southwestern Medical Center ,Dallas，TX惠贈(zèng))在完全培養(yǎng)基(具有 10% 胎牛血清、IOOU/ mL青霉素 G、250ng/mL兩性霉素 B和100yg/mL鏈霉素溶液的RPMI-1640)中在5 % CO2中于37 °C 下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0183] 動(dòng)物和免疫抑制誘導(dǎo)
[0184] 本研究使用平均初始體重為約3kg的新西蘭白兔。通過(guò)每日皮下注射環(huán)孢素 A (CsA;山地明50mg/mL;Novartis Pharmaceuticals ,Cambridge，MA，USA)來(lái)免疫抑制兔。在 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間維持CsA施用以防止自發(fā)性腫瘤消退。劑量方案為:細(xì)胞接種前每天15mg/kg， 持續(xù)3天，此后持續(xù)4周，之后是每天10mg/kg，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)獸醫(yī)的判斷進(jìn)一步減少劑 量。根據(jù)每只動(dòng)物的體重每日調(diào)整CsA劑量。每日測(cè)量體重，并將其張貼在圈養(yǎng)兔的房間中。
[0185] 在隨訪(fǎng)期間，每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物的CsA毒性癥狀，例如牙齦肥大、垂涎、腹瀉和體重減 輕。如果動(dòng)物表現(xiàn)出CsA毒性的早期征象(例如，食欲不振），則立即針對(duì)支持性管理而咨詢(xún) 獸醫(yī)人員，例如食欲刺激物和GI活動(dòng)力增強(qiáng)劑。還可根據(jù)獸醫(yī)的建議考慮調(diào)整注射劑量。
[0186] 細(xì)胞植入
[0?87] 在CsA處理后的第3天，通過(guò)肌內(nèi)注射氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪（6mg/kg)來(lái)麻 醉動(dòng)物。在麻醉之后，向右眼施用1至3滴的0.5%鹽酸丙美卡因，并使用彎曲的套管將1.0 X IO6個(gè)92. 1人葡萄膜黑素瘤細(xì)胞以100μ1懸液的體積注射到兔右眼的脈絡(luò)膜上腔 (suprachoroidal space)中。簡(jiǎn)言之，在眼上放置消毒帷簾以避免任何毛發(fā)或睫毛污染，并 用10 %聚維酮碘(betadine)溶液清潔結(jié)膜。接下來(lái)，在眼肌下使用縫合線(xiàn)來(lái)使眼睛向前轉(zhuǎn) 動(dòng)，并在將結(jié)膜切開(kāi)之后，從角膜緣（limbus)約IOmm進(jìn)行鞏膜切開(kāi)術(shù)。然后，將套管插入到 鞏膜切口（slerotomy)(其長(zhǎng)度的1/3至1/2)中并將細(xì)胞（100yL，含有1.0 X 10-6個(gè)細(xì)胞)注 射到脈絡(luò)膜上腔中。緩慢地取回針，并繃緊閉合鞏膜切口的縫合線(xiàn)以確保注射部位發(fā)生最 低回流。在外科手術(shù)傷口上施用一滴抗生素眼用溶液(紅霉素軟膏）以防止感染。
[0188] 圈養(yǎng)、飼料、水和環(huán)境條件、適應(yīng)環(huán)境
[0189] 在分組圈養(yǎng)中，將動(dòng)物以每組6只圈養(yǎng)并隨意供給新鮮、可口且營(yíng)養(yǎng)充分的食物。 隨意提供干凈、可飲用且未經(jīng)污染的水。將環(huán)境控制設(shè)置為溫度維持在22±4°C(68±5°F)， 并且相對(duì)濕度為50% ± 20%。維持12小時(shí)的光照/黑暗周期。在動(dòng)物到達(dá)設(shè)施(faciIity)之 后，使其適應(yīng)環(huán)境至少5天，之后進(jìn)行基線(xiàn)評(píng)價(jià)。在基線(xiàn)眼底檢查評(píng)價(jià)之后，將動(dòng)物分配到測(cè) 試組。
[0190] 受試品和對(duì)照品
[0191]表5:受試品的載劑
[0197] 劑量制劑的制備
[0198] 將受試品在無(wú)菌注射用水中以1:1稀釋。
[0199] 受試品/對(duì)照品的施用
[0200] 給藥:光敏病毒樣納米顆粒或鹽水通過(guò)眼內(nèi)注射到玻璃體中來(lái)施用。
[0201]激光施用：激光處理使用具有Coherent Opa] :Ph〇t〇aCtivat〇r?激光器的狹縫 燈系統(tǒng)來(lái)施加，所述激光器在83秒的持續(xù)時(shí)間內(nèi)以600mW的功率遞送690nm光，總能量密度 (f Iuence)為50 J/cm2。激光斑點(diǎn)尺寸設(shè)定為5mm的直徑并且這樣，大于該尺寸的腫瘤用重疊 斑點(diǎn)進(jìn)行激光處理。在由于眼部并發(fā)癥(例如，玻璃體炎、視網(wǎng)膜脫離)而不能劃定腫瘤邊界 的明確區(qū)別的情況下，可對(duì)整個(gè)懷疑區(qū)域進(jìn)行激光處理。
[0202] 死亡率/發(fā)病率檢查：除有兩只動(dòng)物死于CsA并發(fā)癥之外，所有的動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn) 期間均保持良好的健康狀況(參見(jiàn)下文）。
[0203] 臨床觀(guān)察:所有動(dòng)物均由動(dòng)物設(shè)施人員每日觀(guān)察;記錄觀(guān)察結(jié)果。大多數(shù)動(dòng)物經(jīng)歷 一定程度的重量減輕和食欲不振，這是由CsA引起。
[0204] 眼科學(xué)
[0205] 頻率:通過(guò)眼底檢查和超聲的眼科檢查每周進(jìn)行。
[0206] 操作：使動(dòng)物鎮(zhèn)靜并使用眼用鹽酸去氧腎上腺素和托吡卡胺滴劑來(lái)使其右眼擴(kuò) 大。接下來(lái)，使用間接雙目檢眼鏡（indirect binocular ophthalmoscope)對(duì)眼進(jìn)行眼底檢 查。眼科學(xué)家對(duì)任何的眼部并發(fā)癥進(jìn)行記錄。當(dāng)鑒別到腫瘤時(shí)，通過(guò)將其與視盤(pán)(視盤(pán)直徑 [DD]; IDD =約1.75mm)進(jìn)行比較來(lái)估計(jì)尺寸。對(duì)于超聲讀數(shù)，在眼底檢查之后立即向眼部施 加超聲探針以使通過(guò)眼底檢查確定的腫瘤的位置可視化。超聲測(cè)量證明在技術(shù)上是困難 的，主要是因?yàn)橐恍┠[瘤位于過(guò)于外周而不能適當(dāng)?shù)乜梢暬?。結(jié)果，并非總是可測(cè)量最大的 腫瘤尺寸;并且在大多數(shù)情況下僅可對(duì)高度進(jìn)行量化。
[0207] 最終操作和解剖病理學(xué)
[0208] 計(jì)劃外死亡:根據(jù)方案指南，在本研究中使用的20只動(dòng)物中，一只動(dòng)物由于重量減 輕（> 20 %的到達(dá)時(shí)體重)而對(duì)其實(shí)施了安樂(lè)死。一只動(dòng)物意外地死于由CaA毒性引起的胃 腸道停滯（gastrointestinal stasis) 〇
[0209] 計(jì)劃性安樂(lè)死：在研究結(jié)束后，根據(jù)公認(rèn)的美國(guó)獸醫(yī)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)（American Veterinary Medical Association，AVMA)指南對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。使用氯胺酮-甲苯噻嗪-乙酰丙嗪（分別為〇.7511111^/1^、511^/1^和20至3511^/1^)和丁丙諾啡(0.211^/1^)的組合在麻 醉下對(duì)動(dòng)物放血。
[0210] 結(jié)果
[0211] 總的來(lái)說(shuō)，有11只動(dòng)物發(fā)生組織病理學(xué)上明顯的腫瘤。如前所述，有兩只動(dòng)物意外 死亡并將其用作未處理對(duì)照。有9只具有不同腫瘤大小的動(dòng)物接受用病毒樣納米顆粒進(jìn)行 處理。一只動(dòng)物由于腫瘤范圍在不能進(jìn)行激光處理的赤道前段中而在評(píng)價(jià)中排除。
[0212] 對(duì)于在眼后部中具有腫瘤并且接受全處理(光敏病毒樣納米顆粒+激光）的動(dòng)物， 觀(guān)察到顯著的腫瘤響應(yīng)，其以以下三個(gè)要素為特征：1)誘導(dǎo)廣泛的腫瘤壞死;2)生長(zhǎng)模式改 變，從擴(kuò)散變?yōu)?袖套樣模式"（sleeve-like pattern);和3)不影響鄰近的視網(wǎng)膜。
[0213] 表8


[0217] 未處理對(duì)照
[0218] 兔#14由于不能接受的重量減輕（>20%初始體重)而在第4周對(duì)其實(shí)施了安樂(lè)死。 針對(duì)腫瘤存在的眼底檢查由于大出血和視網(wǎng)膜脫離而無(wú)說(shuō)服力。該動(dòng)物未接受處理。
[0219] 超聲:該兔由于死亡時(shí)機(jī)而未經(jīng)歷超聲檢查。
[0220] 大體病理學(xué)/組織病理學(xué):基于大體病理學(xué)，觀(guān)察到尺寸為3mm高度(height，H) X 8mm最大腫瘤尺寸（largest tumor dimension，LTD)的眼內(nèi)腫瘤，并且基于組織病理學(xué)，觀(guān) 察到尺寸為2.2mm H和9.5最大腫瘤尺寸的眼內(nèi)腫瘤。基于大體病理學(xué)，觀(guān)察到尺寸為1.4_ 高度和9.4_最大腫瘤尺寸的眼外腫瘤。眼內(nèi)和眼外腫瘤二者中有約10%是壞死的。未檢測(cè) 到袖套模式。
[0221] 全處理
[0222] 兔 9
[0223] 兔#9在第四周在眼底上具有大小為約IDD的臨床上可檢出的腫瘤，立即對(duì)其進(jìn)行 處理。在隨后的一周，估測(cè)腫瘤為0.5DD。在第6周，估測(cè)腫瘤為<0.f5DD，并且在最后一周，未 檢測(cè)到腫瘤。
[0224] 超聲:在第3周時(shí)，超聲未辨別到腫瘤，但是在第4周，鑒別到尺寸為1.04mm高度的 團(tuán)塊。在后續(xù)幾周，超聲的測(cè)量結(jié)果減退，直至截止第6周及此后腫瘤不再可見(jiàn)。
[0225] 大體病理學(xué)/組織病理學(xué)：組織病理學(xué)揭示無(wú)腫瘤或細(xì)胞。然而，尚需獲得整個(gè)眼 的系列切片和免疫組織化學(xué)結(jié)果以進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果。
[0226] 兔 6
[0227] 在第四周，存在腫瘤的臨床懷疑(視網(wǎng)膜下的團(tuán)塊升高），但是在實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間視 網(wǎng)膜下出血、流體和視網(wǎng)膜脫離對(duì)臨床尺寸估測(cè)造成妨礙。
[0228] 超聲:通過(guò)超聲，在第3周檢測(cè)到4.88mm的大團(tuán)塊，其在第4周生長(zhǎng)至5.29mm，在此 點(diǎn)我們開(kāi)始進(jìn)行處理。在第5周，測(cè)量腫瘤為4.88mm，而在第6和7周，測(cè)量腫瘤分別為4.02mm 和4.98mm〇
[0229] 大體病理學(xué)/組織病理學(xué):基于大體病理學(xué)，鑒別到兩種獨(dú)特的腫瘤：眼內(nèi)腫瘤和 結(jié)膜腫瘤，后者懷疑是由細(xì)胞植入期間發(fā)生回流造成。由于結(jié)膜腫瘤的位置原因，不能對(duì)其 進(jìn)行處理，并且因此我們考慮將其作為內(nèi)對(duì)照。眼內(nèi)腫瘤解聚集并且尺寸為7mm HXll mm LTD。還鑒別到尺寸為6mm HX9 LTD mm的延伸部(extraocular extension)，其具有特征性 的質(zhì)地?；诮M織病理學(xué)，測(cè)量眼內(nèi)腫瘤為4.9mm HX8.3 LTD mm并且>70%壞死，其中剩 余的大部分存活細(xì)胞形成前述袖套樣模式。未經(jīng)處理的結(jié)膜腫瘤表現(xiàn)出遠(yuǎn)遠(yuǎn)更低的壞死 (約15 % )并且袖套模式不明顯。
[0230] 該研究的目的是探索光敏病毒樣納米顆粒+NIR光在兔眼中的葡萄膜黑素瘤原位 異種移植模型中的活性。接受光敏病毒樣納米顆粒+激光處理的所有動(dòng)物均對(duì)該處理作出 有利的響應(yīng)。這對(duì)小至中等腫瘤而言特別明顯，作為處理響應(yīng)和完全組織病理學(xué)響應(yīng)，所述 腫瘤具有明顯的腫瘤縮小。例如在第4周時(shí)呈現(xiàn)小腫瘤的兔9中，通過(guò)頭兩個(gè)劑量的處理該 腫瘤完全根除并且在第二處理后兩周在臨床上或組織病理學(xué)上均不再檢測(cè)到。在較大的腫 瘤（例如兔4)中，腫瘤大部分壞死，這與未處理的對(duì)照（兔14)形成明顯對(duì)比，所述對(duì)照僅在 約10%的腫瘤體積中表現(xiàn)出壞死，清楚地指示處理效力。此外，接受全處理之具有眼內(nèi)腫瘤 的數(shù)只動(dòng)物具有未經(jīng)激光處理的眼外延伸部；與經(jīng)處理的腫瘤部分相比，這些部分表現(xiàn)出 顯著更低的壞死，這是支持激光活化的光敏病毒樣納米顆粒用于治療葡萄膜黑素瘤的效力 的另一證據(jù)。鄰近腫瘤的視網(wǎng)膜區(qū)域未受處理的影響。
[0231] 基于處理之后的眼內(nèi)腫瘤響應(yīng)，尤其與對(duì)照（未經(jīng)處理的眼外部分）相比，本文中 提供的數(shù)據(jù)支持光敏病毒樣納米顆粒在腫瘤存在下用于治療眼黑素瘤的選擇性且強(qiáng)效的 抗癌活性。
[0232] 實(shí)施例18-比較HPVLl與BPVLl的體外效力測(cè)定
[0233] 光敏病毒樣納米顆粒(例如，與IR700染料綴合之包含變體HPV16/31 Ll蛋白和HPV L2蛋白之組合的病毒樣納米顆粒）的效力通過(guò)體外細(xì)胞殺傷測(cè)量來(lái)測(cè)定。葡萄膜黑素瘤細(xì) 胞(例如，細(xì)胞系0CM-1或92.1)通過(guò)常規(guī)方法使用EDTA和胰蛋白酶的溶液來(lái)收獲。一經(jīng)從組 織培養(yǎng)塑料移出，就將細(xì)胞懸浮于完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并允許其在37°C下復(fù)蘇約30分鐘。在 該復(fù)蘇期期間，在PBS+2%胎牛血清中以l/21og增量（2000pM、600pM、200pM、60pM、20pM、 6pM、2pM和0.6pM)制備光敏病毒樣納米顆粒的連續(xù)稀釋物。在復(fù)蘇期之后，將細(xì)胞計(jì)數(shù)，離 心并懸浮于TOS+2%FBS中直至細(xì)胞密度為3 X IO6Ail。向病毒樣納米顆粒稀釋物添加等體 積的細(xì)胞懸液以在適當(dāng)濃度（1000pM、300pM、100pM、30pM，、10pM、3pM、IpM和0 · 3pM)的病毒 樣納米顆粒中產(chǎn)生1.5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。這些條件(例如，360μ1)是在冰上孵育約I. 5小時(shí)至 2小時(shí)。
[0234] 在該孵育之后，將管離心以收集細(xì)胞并隨后將細(xì)胞在無(wú)光敏病毒樣納米顆粒的情 況下用PBS+2%FBS洗滌兩次。在最后的離心之后，將細(xì)胞懸浮于200μ1 PBS+2%FBS中。每份 樣品移出1〇〇μ1并將其轉(zhuǎn)移至96孔1/2區(qū)板的孔。然后，使用Coherent Opal Photoactivator眼科激光器用25 J/cm2(600mW，43秒)近紅外光（689nm)福照每份樣品。在福 照之后，隨后將細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移至新的管。將經(jīng)光輻照和未經(jīng)輻照的樣品均放置在37°C下，再 持續(xù)1至2小時(shí)。
[0235] 在該孵育之后，將最終20μ1的細(xì)胞樣品與AOPI染色劑（吖啶橙和碘化丙啶）1:1混 合并使用NexcelomCellometer Auto 2000評(píng)價(jià)細(xì)胞的生存力。圖20顯示，BPVLl和HPVLl在 半最大有效濃度(EC50)(BPVLl = 88pm;HPVLl = 60.5pm)下對(duì)細(xì)胞生存力具有相當(dāng)?shù)淖饔茫?表明所述光敏分子的效力彼此相當(dāng)。
[0236] 圖21示出了分析光敏病毒樣納米顆粒結(jié)合之來(lái)自圖20中所述的殺傷測(cè)定的細(xì)胞 樣品。在Odyssey Clx凝膠/板掃描儀上對(duì)來(lái)自殺傷測(cè)定的細(xì)胞進(jìn)行掃描。Odyssey Clx專(zhuān)門(mén) 設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)和量化一系列紅外染料，包括IR700染料(例如，IRDyeK)7〇〇DX)。因此，在 該測(cè)定中，經(jīng)不同濃度光敏病毒樣納米顆粒處理的細(xì)胞顯示出濃度依賴(lài)性量的與細(xì)胞相關(guān) 的熒光，表明細(xì)胞與BPV-L1-IR700和HPV-L1-IR700二者都結(jié)合。
[0237] 實(shí)施例19-光敏病毒樣納米顆粒在頭頸癌的異種移植模型中的活性。
[0238] 將頭頸癌細(xì)胞植入nu/nu小鼠的背部側(cè)脅中。允許腫瘤生長(zhǎng)兩周。一旦腫瘤達(dá)到 150_3的平均大小，就將動(dòng)物如下隨機(jī)分成6個(gè)研究組(每組7只動(dòng)物）：鹽水;光敏病毒樣納 米顆粒(HPV16/31 Ll/L2;200yg劑量）；鹽水+NIR光(50J/cm2);光敏病毒樣納米顆粒(200yg 劑量)+NIR光(50J/cm2);光敏病毒樣納米顆粒（IOOyg劑量)+NIR光(50J/cm2);以及光敏病毒 樣納米顆粒(50yg劑量)+NIR光(50J/cm 2)。每3天進(jìn)行給藥和NIR光處理。每3至5天記錄腫瘤 測(cè)量結(jié)果。
[0239] 盡管所有的對(duì)照對(duì)其相應(yīng)的處理均未表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性效應(yīng)，但是在所有給藥組中均 觀(guān)察到顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制（圖22)。所觀(guān)察到的腫瘤生長(zhǎng)抑制是劑量依賴(lài)性的。在高劑量 組中存在腫瘤響應(yīng)。在200yg處理組中有兩只動(dòng)物死亡，這與大量細(xì)胞死亡相關(guān)并且潛在地 與腫瘤溶解綜合征相關(guān)的毒性相關(guān)。
[0240]實(shí)施例20-光敏病毒樣納米顆粒的產(chǎn)生
[0241]為了產(chǎn)生本公開(kāi)內(nèi)容的光敏病毒樣納米顆粒，將HEK293F在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)，并 用編碼Ll (或者Ll和L2)衣殼蛋白的雙順?lè)醋淤|(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。這誘導(dǎo)形成原衣殼(如Buck 等Current Protocols in Cell Biology26.1.1-26· 1.19,2007年 12月中所述）。在細(xì)胞團(tuán) 回收并破碎之后，使原衣殼經(jīng)受benzonase處理以去除宿主DNA污染物并經(jīng)受后續(xù)的體外成 熟過(guò)程以形成穩(wěn)定用于綴合的病毒樣納米顆粒。在純化之后，將病毒樣納米顆粒與 IR700NHS酯化學(xué)綴合以產(chǎn)生光敏病毒樣納米顆粒。圖23示出了產(chǎn)生過(guò)程的示意性圖示。
[0242] 由該實(shí)施例中所述的過(guò)程產(chǎn)生的光敏病毒樣納米顆粒已使用SDS-PAGE、SE-HPLC 和DLS進(jìn)行表征，并且顯示純度為90 %至95 %。來(lái)自HEK293細(xì)胞的組蛋白作為病毒樣納米顆 粒組合物的一部分存在并且占病毒樣納米顆?？偟鞍椎?0%至15%。
[0243] 序列
[0244] 變體HPV16/31 Ll蛋白核苷酸序列（SEQ ID N0:1)
[0245] ATGAGCCTGTGGCTGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGC ACCGACGAGTACGTGGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCACCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTA CTTCCCCATCAAGAAGCCCAACAACAACAAGATCCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGA TCCACCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGG GCCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCT GGACGACACCGAGAACGCCAGCGCCTACGCCGCCAACGCCGGCGTGGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACA AGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCACCAAC GTGGCCGTGAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACACCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACAC CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCACCAGCATCT GCAAGTACCCCGACTACATCAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTACCTGAGGAGGGAGCAG ATGTTCGTGAGGCACCTGTTCAACAGGGCCGGCGCCGTGGGCGAGAACGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCAG CGGCAGCACCGCCACCCTGGCCAACAGCAACTACTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGACGCCCAGA TCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTG ACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCCTGTGCGCCGCCATCAGCACCAGCGAGACCACCTACAAGAA CACCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCC TGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACAGCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGCAGCCC CCCCCCGGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCCCC CGCCCCCAAGGAGGACCCCCTGAAGAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGG ACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGCAAGAGG AAGGCCACCCCCACCACCAGCAGCACCAGCACCACCGCCAAGAGGAAGAAGAGGAAGCTGTGA
[0246] BPVlLl核苷酸序列（SEQ ID N0:2)
[0247] ATGGCCCTCTGGCAGCAGGGGCAGAAACTCTACCTGCCACCCACACCCGTGTCAAAAGTCCTGTGTTCC GAGACATACGTCCAGCGGAAGTCAATCTTCTACCACGCCGAGACCGAAAGGCTCCTCACCATCGGCCACCCCTACTA CCCCGTCAGCATTGGCGCTAAGACCGTGCCCAAAGTCTCCGCCAACCAATACCGCGTGTTCAAGATCCAGCTGCCCG ACCCAAACCAGTTCGCCCTGCCCGATCGCACCGTGCATAACCCCTCCAAGGAAAGACTCGTCTGGGCCGTGATCGGC GTCCAAGTCTCACGGGGCCAACCCCTGGGCGGCACCGTGACCGGCCATCCAACCTTCAACGCCCTCCTGGACGCCGA GAACGTCAACCGGAAAGTCACAACACAAACCACCGACGATCGCAAGCAGACCGGGCTGGACGCCAAACAGCAGCAAA TCCTCCTCCTGGGGTGCACACCCGCTGAGGGCGAGTACTGGACCACCGCTCGGCCCTGCGTGACCGACAGGCTGGAG AACGGGGCTTGTCCCCCCCTGGAGCTGAAGAATAAGCATATCGAGGACGGCGACATGATGGAGATCGGCTTCGGCGC CGCTAACTTCAAGGAGATCAACGCCTCCAAGAGCGACCTGCCCCTGGATATCCAGAACGAAATTTGTCTCTATCCCG ATTATCTGAAGATGGCCGAAGATGCCGCCGGCAACTCAATGTTTTTCTTCGCCCGCAAGGAGCAAGTCTACGTGCGG CATATTTGGACACGGGGCGGGAGCGAAAAGGAGGCTCCCACAACCGACTTCTACCTGAAAAACAACAAGGGCGACGC TACACTGAAGATCCCATCCGTCCACTTCGGCTCCCCATCCGGGAGCCTCGTCAGCACCGACAACCAGATCTTCAACA GACCATATTGGCTGTTTAGGGCTCAAGGGATGAATAACGGCATCGCTTGGAACAACCTGCTCTTCCTGACCGTCGGC GATAACACCAGGGGCACCAACCTGACAATCTCCGTGGCTAGCGACGGCACACCCCTGACCGAATACGACTCAAGCAA GTTTAACGTGTATCACCGGCACATGGAGGAGTACAAACTGGCTTTCATCCTGGAACTGTGTAGCGTCGAGATTACCG CCCAGACCGTCAGCCACCTCCAGGGCCTGATGCCAAGCGTCCTGGAGAACTGGGAGATCGGCGTCCAACCACCAACA AGCAGCATCCTGGAAGATACATACAGATACATCGAAAGCCCCGCCACCAAGTGCGCCTCAAACGTGATCCCCGCCAA GGAGGATCCCTACGCCGGCTTCAAATTCTGGAATATCGACCTGAAGGAGAAACTGAGCCTCGATCTGGACCAGTTCC CACTCGGCCGGCGGTTCCTGGCCCAACAGGGCGCTGGCTGCAGCACCGTCCGGAAGAGGCGGATCTCACAAAAGACC AGTTCCAAACCCGCCAAGAAGAAGAAGAAGTAG
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子。2. 權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。3. 權(quán)利要求2所述的病毒樣顆粒，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣 殼蛋白。4. 權(quán)利要求3所述的病毒樣顆粒，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病毒 衣殼蛋白。5. 權(quán)利要求2所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白并 且不與人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18或?qū)PV具有特異性的已有抗體交叉反應(yīng)。6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。7. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白 的組合。8. 權(quán)利要求7所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。9. 權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒具有經(jīng)修飾的免疫 原性和/或抗原性。10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白共 價(jià)綴合。11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白的 賴(lài)氨酸殘基綴合。12. 權(quán)利要求10或11所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過(guò)共價(jià)酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。13. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣 顆粒與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合。14. 權(quán)利要求13所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合。15. 權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約10至約 1000個(gè)光敏分子。16. 權(quán)利要求15所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約50至約1000個(gè)光敏分 子。17. 權(quán)利要求16所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約1000個(gè)光敏分 子。18. 權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅 外染料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。19. 權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過(guò)紅外光、近紅 外光或紫外光來(lái)活化。20. 權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維 替泊芬分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。21. 靶向腫瘤的病毒樣顆粒，其包含約50至約1000個(gè)光敏分子。22. 權(quán)利要求21所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與衣殼蛋白綴合，所述衣殼蛋白 是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。23. 權(quán)利要求22所述的病毒樣顆粒，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒 衣殼蛋白。24. 權(quán)利要求23所述的病毒樣顆粒，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病 毒衣殼蛋白。25. 權(quán)利要求22所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣殼蛋白 并且不與人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18或?qū)PV具有特異性的已有抗體交叉反應(yīng)。26. 權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述病毒樣顆 粒的衣殼蛋白綴合。27. 權(quán)利要求26所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。28. 權(quán)利要求26或27所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白的組 合。29. 權(quán)利要求28所述的病毒樣顆粒，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。30. 權(quán)利要求21至29中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒具有經(jīng)修飾的 免疫原性和/或抗原性。31. 權(quán)利要求22至30中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 共價(jià)綴合。32. 權(quán)利要求22至31中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 的賴(lài)氨酸殘基綴合。33. 權(quán)利要求31或32所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過(guò)共價(jià)酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。34. 權(quán)利要求21至33中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒 樣顆粒與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合。35. 權(quán)利要求34所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合。36. 權(quán)利要求21至35中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約 1000個(gè)光敏分子。37. 權(quán)利要求21至36中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅 外染料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。38. 權(quán)利要求21至37中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過(guò)紅外光、近紅 外光或紫外光來(lái)活化。39. 權(quán)利要求21至38中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維 替泊芬分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。40. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對(duì)象施用權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒。41. 權(quán)利要求40所述的方法，其還包括活化光敏分子。42. 權(quán)利要求40或41所述的方法，其還包括在允許氧的系間跨越從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性分 子或直接能量傳遞以損傷細(xì)胞膜的光波長(zhǎng)下活化所述光敏分子。43. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對(duì)象施用包含與衣殼蛋白綴合的光敏分子的靶向腫瘤的病毒樣顆粒。44. 包括以下的方法： 向患有腫瘤的對(duì)象施用包含約50至約1000個(gè)光敏分子的靶向腫瘤的病毒樣顆粒。45. 權(quán)利要求43或44所述的方法，其還包括在使所述分子可見(jiàn)的波長(zhǎng)下活化光敏分子。46. 權(quán)利要求43至45中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在使光敏分子具有細(xì)胞毒性從而 殺傷腫瘤細(xì)胞的波長(zhǎng)下活化所述分子。47. 權(quán)利要求46所述的方法，其中所述光敏分子是激光活化的。48. 權(quán)利要求47所述的方法，其中所述激光是紅外激光、近紅外激光或紫外激光。49. 權(quán)利要求48所述的方法，其中通過(guò)所述紅外激光遞送的能量為5J至100J。50. 權(quán)利要求49所述的方法，其中通過(guò)所述紅外激光遞送的能量為50J。51. 權(quán)利要求47至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述激光施加約5秒至約5分鐘。52. 權(quán)利要求43至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中在施用所述病毒樣顆粒之后約30分鐘 至約48小時(shí)活化所述光敏分子。53. 權(quán)利要求43至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤是眼腫瘤。54. 權(quán)利要求53所述的方法，其中所述眼腫瘤位于玻璃體、脈絡(luò)膜腔、虹膜、睫狀體、鞏 膜、視網(wǎng)膜中央凹、視網(wǎng)膜、視盤(pán)或視神經(jīng)中。55. 權(quán)利要求43至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤位于肺、胸膜、肝、胰、胃、食 管、結(jié)腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、腦脊膜、睪丸、腎或膀胱中。56. 權(quán)利要求43至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤無(wú)需外科手術(shù)介入即可接近。57. 權(quán)利要求52所述方法，其中所述腫瘤位于頭、頸、子宮頸、喉或皮膚中。58. 權(quán)利要求43至57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤是孤兒病或罕見(jiàn)病。59. 權(quán)利要求43至58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤是癌性或惡性的。60. 權(quán)利要求59所述的方法，其中所述腫瘤是轉(zhuǎn)移性的、癌前期的、發(fā)育不良性的或者 具有指示惡性轉(zhuǎn)化的可疑生長(zhǎng)細(xì)胞。61. 權(quán)利要求43至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒通過(guò)注射來(lái)施用。62. 權(quán)利要求61所述的方法，其中所述病毒樣顆粒用空心針或包被針、微型針或顯微操 作針來(lái)施用。63. 權(quán)利要求43至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒表面、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、 脈絡(luò)膜上施用。64. 權(quán)利要求43至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒通過(guò)植入來(lái)施用。65. 權(quán)利要求43至64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述衣殼蛋白是乳頭瘤病毒衣殼蛋白。66. 權(quán)利要求65所述的方法，其中所述乳頭瘤病毒衣殼蛋白為非人乳頭瘤病毒衣殼蛋 白。67. 權(quán)利要求66所述的方法，其中所述非人乳頭瘤病毒衣殼蛋白是牛乳頭瘤病毒衣殼 蛋白。68. 權(quán)利要求43至64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含人乳頭瘤病毒衣 殼蛋白，不與由人乳頭瘤病毒(HPV)16、HPV 18VLP誘導(dǎo)的抗體或由HPV感染誘導(dǎo)的已有抗體 交叉反應(yīng)。69. 權(quán)利要求43至68中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述光敏分子與所述病毒樣顆粒的衣 殼蛋白綴合。70. 權(quán)利要求69所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含L1衣殼蛋白。71. 權(quán)利要求69或70所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含L1和L2衣殼蛋白的組合。72. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述衣殼蛋白由L1衣殼蛋白組成。73. 權(quán)利要求43至72中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒具有經(jīng)修飾的免疫原 性和/或抗原性。74. 權(quán)利要求43至73中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述光敏分子與衣殼蛋白共價(jià)綴合。75. 權(quán)利要求43至74中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子與所述衣殼蛋白 的賴(lài)氨酸殘基綴合。76. 權(quán)利要求74或75所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子通過(guò)共價(jià)酰胺鍵與所述衣 殼蛋白綴合。77. 權(quán)利要求43至76中任一項(xiàng)所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒 樣顆粒與腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)合。78. 權(quán)利要求77所述的病毒樣顆粒，其中所述光敏分子不破壞所述病毒樣顆粒與腫瘤 細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合。79. 權(quán)利要求43、46至78中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約10至約1000 個(gè)光敏分子。80. 權(quán)利要求43、46至79中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約50至約1000 個(gè)光敏分子。81. 權(quán)利要求43至80中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒樣顆粒包含約100至約1000個(gè) 光敏分子。82. 權(quán)利要求4 3至81中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述光敏分子包含熒光染料、紅外染 料、近紅外染料、撲啉分子、葉綠素分子或前述任意兩種或更多種的組合。83. 權(quán)利要求43至82中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述光敏分子選自酞菁染料、維替泊芬 分子以及酞菁染料和維替泊芬分子的組合。
【文檔編號(hào)】A61K39/42GK105979967SQ201480057289
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年9月18日
【發(fā)明人】伊麗莎白·德洛斯皮諾斯, 約翰·T·席勒, 羅達(dá)·C·基尼斯, 約翰·麥克杜格爾
【申請(qǐng)人】奧拉生物科學(xué)公司, 美國(guó)政府衛(wèi)生與公眾服務(wù)部