金絲桃苷和奧司他韋聯(lián)合在防治h7n9型流感藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】金絲桃苷和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實施的：首先將H7N9野生型或突變型流感病毒神經(jīng)氨酸酶液和金絲桃苷以及奧司他韋得混合液孵育30分鐘，再加入底物進行檢測，實驗結(jié)果表明兩種藥物聯(lián)合使用對H7N9野生型和突變型流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性的均有抑制作用，而后檢測了金絲桃苷與奧司他韋聯(lián)合使用在細胞水平上的抗流感作用，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用能對感染H7N9野生型和突變型流感病毒的細胞起到治療作用，最后，檢測了兩者聯(lián)合使用對小鼠流感模型的影響，發(fā)現(xiàn)加入金絲桃苷與奧司他韋混合物后，可以明顯緩解流感小鼠體重的減輕，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平，并且能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
【專利說明】
金絲桃苷和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及金絲桃苷和奧司他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感 病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（以下簡稱流感)是由正粘病毒科的流感病毒引起的一種急性病毒性 呼吸道傳染病。它傳染性強、流行面廣、發(fā)病率高。在世界范圍內(nèi)，流感每年流行造成約300 萬至500萬人患病嚴重和約25萬至50萬人死亡。目前，甲型流感病毒最常見也最容易引起世 界大流行和地區(qū)流行。現(xiàn)在，只有兩類抗病毒藥物已經(jīng)被美國FDA批準用于流感預(yù)防和治 療，分別是M2離子通道抑制劑和神經(jīng)氨酸酶類抑制劑。然而，據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心報 道，99.6 %的季節(jié)性H1N1病毒對奧司他韋具有耐藥性，100 %的季節(jié)性H3N2病毒對金剛烷有 耐藥性。
[0003] 2013年，在我國爆發(fā)了可以傳染人類的新型甲型禽流感病毒一一H7N9,其神經(jīng)氨 酸酶突變型H7N9突變型病毒株對奧司他韋的耐受性是野生型病毒株的10000多倍。耐藥性 毒株的普遍出現(xiàn)降低了抗流感藥物對流感治療的臨床效果。鑒于對神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥 物具有耐藥性病毒的出現(xiàn)和抗流感藥物的副作用，許多科學(xué)家致力于將多種抗病毒藥物組 合使用，以期能夠降低抗流感藥物的使用量并提高治療流感的效果。
[0004] 在我國，中醫(yī)中藥抗病毒已有數(shù)千年的歷史，在利用中藥防治流感方面積累了大 量寶貴的理論和實踐經(jīng)驗。中藥資源非常豐富，從古至今用中醫(yī)藥治療流感療效顯著。金絲 桃苷是從杜鵑花中分離出的活性化合物，研究表明金絲桃苷具有抗氧化、抗癌、降血糖等作 用。最近，也有研究表明其有抗流感的作用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷與抗流感藥物奧斯他 韋聯(lián)合使用對H7N9野生型和H7N9突變型的神經(jīng)氨酸酶抑制起到協(xié)同效果，并能降低藥物的 使用量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供金絲桃苷和奧司他韋聯(lián)合使用在防治H7N9型流感藥物中 的應(yīng)用。金絲桃苷與羧酸奧斯他韋聯(lián)合使用能夠有效的抑制H7N9野生型和突變型流感病毒 神經(jīng)氨酸酶的活性，從而抑制流感病毒在體內(nèi)的繁殖，進而減輕或治愈流感患者。本發(fā)明對 金絲桃苷和羧酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶進行了體外酶學(xué)抑制性的 檢測，發(fā)現(xiàn)羧酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)分別 為1.75nmol/L和26.52ymol/L;金絲桃苷對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶的IC 5Q分別為 117.4ym/L和127.7ymol/L。而后進行了金絲桃苷與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用體外酶學(xué)抑制性 的檢測，聯(lián)合用藥的作用效果用聯(lián)合指數(shù)值表示:聯(lián)合指數(shù)值小于1表明兩種藥物聯(lián)合使用 起到協(xié)同作用。實驗結(jié)果表明兩種藥物對H7N9野生型神經(jīng)氨酸酶的抑制起到協(xié)同作用，且 對H7N9突變型神經(jīng)氨酸酶抑制的協(xié)同效果更加明顯。我們又對這兩種H7N9流感病毒感染 MDCK細胞并加入金絲桃苷與羧酸奧司他韋混合物進行了細胞存活率的測定，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷 與羧酸奧司他韋混合物均能提高H7N9病毒感染后細胞的存活率。最后，我們對金絲桃苷與 奧司他韋混合物對H7N9野生型和突變型流感病毒對小鼠的體重變化、致死率及肺指數(shù)進行 了測定，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷與奧司他韋混合物能明顯緩解H7N9型流感病毒對小鼠的癥狀。本發(fā) 明為開發(fā)以神經(jīng)氨酸酶為靶點的新藥提供基礎(chǔ)，為金絲桃苷與奧司他韋聯(lián)合使用應(yīng)用于人 類流感的治療提供了參考。
【附圖說明】
[0006] 圖1是不同濃度金絲桃苷與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對H7N9野生型流感病毒神經(jīng)氨 酸酶的抑制作用
[0007] 圖2是不同濃度金絲桃苷與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對H7N9突變型流感病毒神經(jīng)氨 酸酶的抑制作用
[0008] 圖3是不同濃度金絲桃苷與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型流感病毒的 MDCK細胞的治療作用
[0009] 圖4是不同濃度金絲桃苷與羧酸奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9突變型流感病毒的 MDCK細胞的治療作用
[0010] 圖5是金絲桃苷與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型流感病毒的小鼠體重的影 響
[0011] 圖6是金絲桃苷與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9突變型流感病毒的小鼠體重的影 響
[0012] 圖7是金絲桃苷與奧司他韋聯(lián)合使用對感染H7N9野生型或突變型流感病毒小鼠肺 中病毒載量的影響
【具體實施方式】
[0013] 以下通過實例形式的【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0014] 實施例1
[0015]將不同濃度的1〇此金絲桃苷或羧酸奧斯他韋分別加入40yL的H7N9野生型或突變 型神經(jīng)氨酸酶溶液中，在37°C孵箱中放置30min，然后加入50yL 20μΜ MU-ΝΑΝΑ底物緩沖液， 在酶標儀上進行檢測，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為450nm，檢測時長8min。檢測結(jié)果為:羧 酸奧斯他韋對H7N9野生型以及突變型神經(jīng)氨酸酶的IC 5Q分別為1.75nmol/L和26.52ymol/L; 金絲桃苷對H7N9野生型以及突變型的IC5Q分別為117.4ym/L和127.7μπιο 1 /L。
[0016] 實施例2
[0017]根據(jù)測定的金絲桃苷與羧酸奧司他韋對Η7Ν9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的1(：50來 確定金絲桃苷與羧酸奧司他韋的加入濃度。金絲桃苷與羧酸奧司他韋的濃度選擇為各自相 對于Η7Ν9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC 5Q濃度。并且所加入的金絲 桃苷的濃度與羧酸奧司他韋的濃度的比例是維持一致的，為其IC5Q值的比值。我們首先在96 孔酶標板中加入30μ1的稀釋后的H7N9野生型或突變型神經(jīng)氨酸酶液，然后在每個孔中加入 10μ1不同濃度的金絲桃苷和10μ1對應(yīng)濃度的羧酸奧司他韋，每個濃度做4次重復(fù)。在37°C下 孵育30min后，再加入50μ1 20μΜ的NA特異性底物MU-NANA，檢測H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨 酸酶的熒光強度。記錄數(shù)據(jù)，然后運用CalcuSyn軟件計算這兩種藥物的聯(lián)合指數(shù)(CI值），結(jié) 果如下：
[0019] 〈注>:ED50、ED75和ED90分別表示酶活性被抑制50%、75%和90%。
[0020] CI值小于1說明兩種藥物聯(lián)合起到協(xié)同作用，且CI值越小協(xié)同效果越好。由表中數(shù) 據(jù)可知兩種藥物聯(lián)合使用對H7N9神經(jīng)氨酸酶的抑制起到協(xié)同作用。
[0021] 實施例3
[0022]為了檢測金絲桃苷與羧酸奧司他韋混合物是否在MDCK細胞上具有抗H7N9野生型 與突變型流感病毒的作用，我們選取了在對數(shù)期的MDCK細胞進行鋪板，每孔10000個，在37 °C 5 % C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后將DMEM培養(yǎng)基棄掉，然后用DMEM清洗2~3次。 再用1〇〇μ1的H7N9野生型或突變型流感病毒尿囊液(濃度為100倍的TCID 5Q濃度)和不同濃度 下的金絲桃苷與羧酸奧司他韋混合物1〇〇μ1 37°C下混合2h，金絲桃苷與羧酸奧司他韋的濃 度選擇為各自相對于H7N9野生型與突變型神經(jīng)氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC 5Q濃度，所 加入的金絲桃苷的濃度與羧酸奧司他韋的濃度的比例維持一致，為其IC5Q值的比值。然后將 混合液加入MDCK細胞中在細胞培養(yǎng)箱里孵育，2h后將混合液吸出，用DMEM清洗2~3次，然后 加入含有bg/ml胰酶和2%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2411。2411以后，用同樣的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天， 將培養(yǎng)液吸出，用DEME清洗2~3次，然后在加入100μΙ DMEM以及15μ1 MTT(5mg/ml)，輕微震 蕩混勻，然后在細胞培養(yǎng)箱中靜置4h。然后棄掉含有MTT的DMEM，用PBS清洗至清洗液無色， 再加入1〇〇μ1 DMS0,輕微震蕩混勻。在30min時檢測其在570nm處的紫外吸光度。通過OD57〇計 算細胞的存活率。
[0023]結(jié)果如圖3和圖4所示，在不同處理條件下，加入金絲桃苷與羧酸奧司他韋混合液 與H7N9野生型或突變型流感病毒時，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率也隨著增加。說明金 絲桃苷與奧司他韋混合液可以抑制H7N9野生型與突變型流感病毒，保護MDCK細胞免受病毒 破壞，而且保護效應(yīng)也隨著金絲桃苷與羧酸奧司他韋混合物濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性。 [0024] 實施例4
[0025]為了檢測金絲桃苷與奧司他韋混合物對感染了 H7N9野生型流感病毒的小鼠是否 有治療作用，我們選取了約20g的雌性ICR小鼠50只，然后用乙醚將其麻醉，再通過滴鼻的方 式將10倍LD5Q濃度的H7N9野生型流感病毒稀釋液滴入小鼠鼻腔內(nèi)建立小鼠流感模型，以滴 入50μ1 PBS緩沖液的小鼠作為對照組。我們將50只小鼠隨機分為5組，這5組分別為:對照組 (PBS組）；病毒組（10倍LD5QH7N9野生型流感病毒）；金絲桃苷組（10倍LD 5QH7N9野生型流感病 毒+25mg/kg金絲桃苷）；奧司他韋組（10倍LD5QH7N9野生型流感病毒+25mg/kg奧司他韋）；金 絲桃苷與奧司他韋混合物組（10倍LD 5Q H7N9野生型流感病毒+25mg/kg金絲桃苷與25mg/kg 奧司他韋混合物）。對小鼠接種病毒2天前開始給藥，每天2次，連續(xù)灌胃10天，每只小鼠一次 給藥0.2ml。每天記錄每組小鼠的體重及死亡情況。在第15天時，對小鼠斷食斷水8h后，進行 脫臼處死，取出小鼠的肺臟并進行稱重。按照公式進行計算：
[0027]結(jié)果如圖7所示，說明金絲桃苷與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9野生型流感病 毒感染小鼠的肺指數(shù)，可以緩解H7N9野生型流感病毒感染小鼠體重的減輕，改善小鼠的生 存狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0028]結(jié)果如下表所示，說明金絲桃苷與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9野生型流感小 鼠的肺指數(shù)。
[0030] 以上結(jié)果均說明，金絲桃苷與奧司他韋混合液能對感染H7N9野生型流感的小鼠起 到治療的作用，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0031] 實施例5
[0032]為了檢測金絲桃苷與奧司他韋混合物對感染了 H7N9突變型流感病毒的小鼠是否 有治療作用，我們選取了約20g的雌性ICR小鼠50只，然后用乙醚將其麻醉，再通過滴鼻的方 式將10倍LD5Q濃度的H7N9突變型流感病毒稀釋液滴入小鼠鼻腔內(nèi)建立小鼠流感模型，以滴 入50μ1 PBS緩沖液的小鼠作為對照組。我們將50只小鼠隨機分為5組，這5組分別為:對照組 (PBS組）；病毒組（10倍LD5QH7N9突變型流感病毒）；金絲桃苷組（10倍LD 5QH7N9突變型流感病 毒+25mg/kg金絲桃苷）；奧司他韋組（10倍LD5QH7N9突變型流感病毒+25mg/kg奧司他韋）；金 絲桃苷與奧司他韋混合物組（10倍LD 5QH7N9突變型流感病毒+25mg/kg金絲桃苷與25mg/kg奧 司他韋混合物）。對小鼠接種病毒2天前開始給藥，每天2次，連續(xù)灌胃10天，每只小鼠一次給 藥0.2ml。每天記錄每組小鼠的體重及死亡情況。在第15天時，對小鼠斷食斷水8h后，進行脫 臼處死，取出小鼠的肺臟并進行稱重。按照實施例4所示公式進行計算。
[0033]結(jié)果圖7所示，說明金絲桃苷與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9突變型流感病毒 感染小鼠的肺指數(shù)，可以緩解H7N9突變型流感病毒感染小鼠體重的減輕，改善小鼠的生存 狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0034]結(jié)果如下表所示，說明金絲桃苷與奧司他韋混合液能顯著降低H7N9突變型流感小 鼠的肺指數(shù)。
[0036]以上結(jié)果均說明，金絲桃苷與奧司他韋混合液能對感染H7N9突變型流感的小鼠起 到治療的作用，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
【主權(quán)項】
1. 金絲桃苷和奧斯他韋聯(lián)合在防治H7N9型流感藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1中金絲桃苷和奧斯他韋聯(lián)合以口服給藥方式的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1中金絲桃苷和奧斯他韋聯(lián)合以注射給藥方式的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/7048GK105832755SQ201610348142
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】房學(xué)迅, 于淼, 王燁, 李源博, 張金瑞, 李響, 于大海
【申請人】吉林大學(xué)