具有治療糖尿病作用的總黃酮及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有治療糖尿病作用的總黃酮及其制備方法與應用。本發(fā)明以苦豆子藥材為原料，通過大量實驗篩選出最佳的分離純化工藝，尤其是利用聚酰胺柱色譜和大孔樹脂柱聯(lián)用，并采用優(yōu)選洗脫溶液洗脫，分離得到的精制總黃酮純度高，雜質含量少，分離得到的苦豆子總黃酮活性強，實驗結果表明本發(fā)明提供的精制總黃酮具有很好的治療糖尿病的作用，對糖尿病及其糖尿病合并肝病等相關性疾病均具有非常好的治療效果，且實驗過程中，未表現(xiàn)出副作用等不良反應，有望開發(fā)成為安全有效，用于防治糖尿病的藥物。
【專利說明】具有治療糖尿病作用的總黃酮及其制備方法和應用 技術領域 本發(fā)明涉及苦豆子總黃酮，尤其涉及從苦豆子中富集總得到黃酮及其在治療2型糖尿 病及2型糖尿病肝病的新藥理用途。 【背景技術】： 糖尿病是世界范圍的最常見的流行性疾病之一，其死亡率在發(fā)達國家僅次于血管疾 病、惡性腫瘤，成為第三位的致死病因疾病。它是一種與遺傳因素有關，同時又與多種環(huán)境 因素相關的慢性全身性疾病，是因胰島素分泌或利用不足而引起的機體糖類、脂肪代謝紊 亂的綜合征，且糖尿病肝病已成為糖尿病慢性并發(fā)癥中除腎臟、心臟、視網膜、神經病變外 另一個日益引起人們重視的慢性并發(fā)癥。我國糖尿病患者近年來數(shù)量呈十分明顯的上升趨 勢，且其中主要類型是2型糖尿病患者，已成為主要威脅我國人民生命健康的問題之一。 盡管有大量的降血糖藥物在臨床應用，但由于其副作用大、使用不便、療效不穩(wěn)定，目 前仍未發(fā)現(xiàn)一種有效的治療藥物。天然抗糖尿病藥物以其毒副作用小和不易產生耐藥性普 遍受到醫(yī)學界的關注?？喽棺又泻悬S酮、黃酮醇、查耳酮等多種類型的黃酮類化合物。近 年來，苦豆子的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、降溫、抗心律失常、抗炎、抗腫瘤、心肌保護、降血脂等藥 理作用的研究逐漸為人們所了解，而針對代謝類疾病的報道較少。 苦豆子別名苦豆根、苦甘草、布亞(維吾爾語)等，是豆科Leguminosae槐屬植物苦豆子 Sophora alopecuroides . L的干燥全草、根及種子，生長于中亞、西亞一帶和我過西北省區(qū) 荒漠內較潮濕的地段。在我國組要分布于新疆、內蒙古、陜西、山西、寧夏、甘肅、西藏等省 區(qū)。全株味寒性苦，具有清熱解毒、祛風燥濕、止痛殺蟲等作用。 苦豆子中主要化學成分除生物堿外，還含有黃酮、有機酸、氨基酸、蛋白質和多糖等。目 前，國內外研究的熱點是生物堿。近年來，有關苦豆子黃酮類成分的藥理活性的報道引起了 人們的興趣?，F(xiàn)代藥理學、藥效學研究表明，苦豆子總黃酮能明顯減弱家兔和大鼠的心率； 且有抗異丙腎上腺素的正性頻率作用，對離體豚鼠心房肌有負性頻率作用，延長有效不應 期，并具有抗脂質過氧化作用。顯然，從苦豆子中提取總黃酮有著較高的經濟效益和社會效 益。 目前苦豆子總黃酮的提取工藝主要有熱回流法、冷浸法和索氏提取法。這些方法總黃 酮提取量低且雜質較多，影響苦豆子總黃酮的綜合利用。
【發(fā)明內容】
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種以苦豆子為原料，經過優(yōu)選 工藝分離得到的精制總黃銅。本發(fā)明另一個目的是提供苦豆子精制總黃銅的制備方法及其 應用。 技術方案:為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術方案為： 一種具有治療糖尿病作用的總黃酮，它是通過以下方法制備得到的： (1)將苦豆子藥材曬干，粉碎為粗粉，粉碎后的藥材用乙醇回流提取1~3次，每次1~2 小時，提取液過濾合并，減壓濃縮至無醇味，得濃縮液； (2) 取步驟(1)制備得到的濃縮液，上色譜柱進行分離，以乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫 液，濃縮； (3) 取步驟(2)乙醇洗脫后的濃縮液，加水稀釋，邊加水邊攪拌進行水沉，然后靜置，離 心，取沉淀； (4) 取步驟(3)制備得到的沉淀，上色譜柱純化，先以水洗脫，再用體積濃度50~60%乙 醇洗脫，收集洗脫液，合并，真空干燥，得到苦豆子總黃酮提取物。 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮，步驟(2)和步驟(4)所述的 色譜柱為聚酰胺色譜柱或大孔樹脂色譜柱。 本發(fā)明提供的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，包括以下步驟： (1) 將苦豆子藥材曬干，粉碎為粗粉，粉碎后的藥材用乙醇回流提取1~3次，每次1~2 小時，提取液過濾合并，減壓濃縮至無醇味，得濃縮液； (2) 取步驟(1)制備得到的濃縮液，上色譜柱進行分離，以乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫 液，濃縮； (3) 取步驟(2)乙醇洗脫后的濃縮液，加水稀釋，邊加水邊攪拌進行水沉，然后靜置，離 心，取沉淀； (4) 取步驟(3)制備得到的沉淀，上色譜柱純化，先以水洗脫，再用體積濃度50~60%乙 醇洗脫，收集洗脫液，合并，真空干燥，得到苦豆子總黃酮提取物。 作為優(yōu)選方案，步驟(2)和步驟(4)所述的色譜柱為聚酰胺色譜柱或大孔樹脂色譜柱。 特別優(yōu)選步驟(2)為聚酰胺色譜柱，步驟(4)為大孔樹脂色譜柱。 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，步驟(2)中采用 體積濃度為30 %和70 %乙醇洗脫。本發(fā)明通過大量實驗優(yōu)選出最佳體積濃度的乙醇洗脫 液，采用該濃度的乙醇洗脫液，可最大程度上將黃酮類化合物洗脫，雜質少。 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，步驟(4)中用體 積濃度50%乙醇洗脫。本發(fā)明通過大量實驗優(yōu)選，才有聚酰胺色譜柱和大孔吸附樹脂柱聯(lián) 用，并篩選出最佳體積濃度的乙醇洗脫液，采用50 %乙醇洗脫，可最大程度上將黃酮類化合 物洗脫，雜質少。 本發(fā)明制備得到具有治療糖尿病作用的總黃酮具有很好的防治糖尿病或糖尿病肝病 的作用，可用于制備防治糖尿病或糖尿病肝病藥物。 作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮在制備治療糖尿病或糖尿病 肝病藥物的作用，將精制總黃酮和藥學上可接受的載體制成膠囊劑、顆粒劑、噴霧劑、注射 劑、微囊、錠劑、栓劑、片劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。 本發(fā)明提供的精制總黃酮制成膠囊劑時，把精制總黃酮和載體乳糖或玉米淀粉混合均 勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。 本發(fā)明提供的精制總黃酮制成片劑時，把精制總黃酮和乳糖或玉米淀粉，需要時加入 潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。 本發(fā)明提供的精制總黃酮制成顆粒劑時，把精制總黃酮和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合 均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。 本發(fā)明提供的精制總黃酮制成注射液時，取精制總黃酮加入生理鹽水溶解然后加入活 性碳，攪拌均勻，80°C加熱30分鐘，過濾，調節(jié)pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它濾器過濾至澄 明，灌裝，在100至115 °C滅菌30分鐘制成注射液。 本發(fā)明提供的精制總黃酮除熱原之后，經無菌過濾，冷凍干燥，得到注射用粉針劑。 有益效果:本發(fā)明提供的具有治療糖尿病作用的精制總黃酮及其制備方法具有以下優(yōu) 占 . 本發(fā)明提供的具有治療糖尿病作用的精制總黃酮，有效成分黃酮含量高，雜質少，防治 糖尿病功效好。 本發(fā)明提供的具有治療糖尿病作用的精制總黃酮的制備方法，工藝設計合理，尤其是 通過大量實驗篩選出最佳的分離工藝，純化效率高，得率高;利用聚酰胺柱色譜和大孔樹脂 柱聯(lián)用，并采用優(yōu)選洗脫溶液洗脫，分離得到的精制總黃酮純度高，雜質含量少，分離得到 的苦豆子總黃酮活性強。 實驗結果表明本發(fā)明提供的具有治療糖尿病作用的精制總黃酮具有很好的治療糖尿 病的作用，對糖尿病及其糖尿病合并肝病等相關性疾病均具有非常好的治療效果，且實驗 過程中，未表現(xiàn)出副作用等不良反應，有望開發(fā)成為新一代安全有效，用于防治糖尿病的藥 物。 【附圖說明】 圖1為各實驗組大鼠肝組織病理切片圖。 【具體實施方式】 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例 所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權 利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。 在以下的實施例中，未詳細描述的過程和方法是本領域中公認的常規(guī)方法。 實驗例1從苦豆子根莖中富集苦豆子總黃酮類化合物 1. 實驗材料 實驗用藥材為豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides·L) 2. 實驗儀器、設備 粉碎機、電熱套、旋轉蒸發(fā)儀、低速大容量多管離心機、超聲儀、真空干燥箱、聚酰胺、 DM-130大孔樹脂 3. 提取與富集 (1) 將采集到的苦豆子藥材進一步曬干，稱重，粉碎過20目，粉碎后的藥材用8倍量，濃 度為70 %乙醇回流提取3次，每次兩小時，提取液過濾合并，65 °C下減壓濃縮至無醇味； (2) 取步驟(1)濃縮物上聚酰胺柱進行分離純化，分別用體積濃度為30%和70%乙醇溶 液洗脫，濃縮洗脫液； (3) 將步驟（2)所得濃縮液加入水稀釋，邊加水邊攪拌進行水沉。然后靜置8h，離心 (3000rpm, 30min)取沉淀。 ⑷取步驟⑶分離得到的沉淀，采用DM-130大孔樹脂分離，濕法裝柱，pH值4~6,上樣 量為藥材與樹脂質量之比為3:1，室溫下以3. OBV/h的體積流量進行吸附飽和;解吸時，先以 4BV的水洗脫(棄去），再用50%乙醇洗脫，收集5BV洗脫液，合并并真空干燥，即得到苦豆子 總黃酮提取物。檢測總黃酮含量為87%，得率為46%。 實驗例2苦豆子總黃酮混合物對2型糖尿病及2型糖尿病肝病的治療作用 1. 動物：純系清潔級Wistar大鼠40只，180-220g。 2. 分組:所有大鼠預飼養(yǎng)lw后，隨機分為兩組:正常組(K組)8只給予正常飲食;其余32 只給予高脂高糖飲食加尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ)進行造模，并于8周后進行空腹血糖 (FBG)測定，F(xiàn)BG 2 16.8mmo 1 /L者為造模成功。將造模成功的24只大鼠隨機分為四組:模型組 (M組）、二甲雙胍組(Y組，150mg/kg，作為陽性藥對照）、實施例1制備得到的高濃度苦豆子總 黃酮組(G1組）、實施例1制備得到的低濃度苦豆子總黃酮組(D1組)均繼續(xù)給予高脂高糖飲 食;正常組仍給予正常飲食。 3. 給藥方案:從第10周起二甲雙胍組給予二甲雙胍水溶液150mg/kg灌胃；本發(fā)明實施 例1制備得到的苦豆子總黃酮組，每日分別給予高濃度總黃酮水溶液、低濃度總黃酮水溶液 灌胃；正常組和模型組則給予等體積蒸餾水灌胃，藥物干預共1周。 4. 實驗試劑:實施例1制備得到的苦豆子總黃酮、鹽酸二甲雙胍片、鏈脲佐菌素、ALT、 AST測定試劑盒、胰島素放射免疫分析試劑盒。 5. 檢測指標：1.血糖、胰島素及肝功的變化;2.采用蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測大鼠 肝組織病理變化情況。 6. 統(tǒng)計學分析:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，以X ± s表示;組間比較采用單因素方 差分析，組間兩兩比較采用q檢驗;指標之間的關系用相關性分析。 7. 實驗結果 7.1血糖、胰島素及肝功的變化 模型組與正常組相比較，空腹血糖值明顯增加，經陽性藥治療后數(shù)值降低，經本發(fā)明實 施例1制備得到的高濃度總黃酮、低劑量總黃酮給藥5天后FBG值較模型組就明顯降低，且有 統(tǒng)計學意義;并且經本發(fā)明實施例1制備得到的苦豆子總黃酮提取物治療后，胰島素含量較 模型組明顯降低，且具有統(tǒng)計學意義;ALT、AST含量較模型組比較也隨之降低，且具有統(tǒng)計 學意義。詳細結果見表1。 表1各組大鼠血糖、胰島素及肝功變化(X土s，n = 6)
[0045] 計量資料以i±s表示。與模型組比較，統(tǒng)計學的顯著性差異為:#p<〇.〇〇i，*p< 0.05〇 以上實驗結果表明，本發(fā)明提供的精制總黃酮能快速降低糖尿病大鼠的血糖值，減弱 胰島素抵抗，并且對糖尿病大鼠的肝臟病理損傷有明顯的改善功效。 7.2各組大鼠肝組織的病理變化 與模型組相比，本發(fā)明實施例1制備得到的總黃酮組，肝細胞胞質內脂滴數(shù)量減少，月旨 肪變性、肝小葉邊界不清、肝索排列紊亂、肝竇和中央靜脈擴張現(xiàn)象均明顯減輕。詳細結果 見圖1。 由以上實驗結果表明，本發(fā)明提供的精制總黃酮不僅具有明顯降血糖作用，能夠有效 糾正糖尿病的糖代謝紊亂，提高糖耐量的作用，并且能夠顯著減輕糖尿病肝病大鼠脂肪變 性、肝小葉邊界不清、肝索排列紊亂、肝竇和中央靜脈擴張現(xiàn)象，且未見有不良反應，安全性 好。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有治療糖尿病作用的總黃酮，其特征在于，它是通過以下方法制備得到的： (1) 將苦豆子植物根莖曬干，粉碎為粗粉，粉碎后的藥材用乙醇回流提取1~3次，每次1 ~2小時，提取液過濾合并，減壓濃縮至無醇味，得濃縮液； (2) 取步驟（1)制備得到的濃縮液，上色譜柱進行分離，以乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫 液，濃縮； (3) 取步驟(2)乙醇洗脫后的濃縮液，加水稀釋，邊加水邊攪拌進行水沉，然后靜置，離 心，取沉淀； (4) 取步驟(3)制備得到的沉淀，上色譜柱純化，先以水洗脫，再用體積濃度50~60%乙 醇洗脫，收集洗脫液，合并，真空干燥，得到苦豆子總黃酮提取物。2. 根據(jù)權利要求1所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮，其特征在于，步驟(2)和步驟 (4)所述的色譜柱為聚酰胺色譜柱或大孔樹脂色譜柱。3. 權利要求1所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 將苦豆子藥材曬干，粉碎為粗粉，粉碎后的藥材用乙醇回流提取1~3次，每次1~2 小時，提取液過濾合并，減壓濃縮至無醇味，得濃縮液； (2) 取步驟（1)制備得到的濃縮液，上色譜柱進行分離，以乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫 液，濃縮； (3) 取步驟(2)乙醇洗脫后的濃縮液，加水稀釋，邊加水邊攪拌進行水沉，然后靜置，離 心，取沉淀； (4) 取步驟(3)制備得到的沉淀，上色譜柱純化，先以水洗脫，再用體積濃度50~60%乙 醇洗脫，收集洗脫液，合并，真空干燥，得到苦豆子總黃酮提取物。4. 根據(jù)權利要求3所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟 (2)和步驟(4)所述的色譜柱為聚酰胺色譜柱或大孔樹脂色譜柱。5. 根據(jù)權利要求3所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟 (2)中采用體積濃度為30 %和70 %乙醇洗脫。6. 根據(jù)權利要求3所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮的制備方法，其特征在于，步驟 (4)中用體積濃度50 %乙醇洗脫。7. 權利要求1或2所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮在制備治療糖尿病或糖尿病肝 病藥物的作用。8. 根據(jù)權利要求7所述的具有治療糖尿病作用的總黃酮在制備治療糖尿病或糖尿病肝 病藥物的作用，其特征在于，將總黃酮和藥學上可接受的載體制成膠囊劑、顆粒劑、噴霧劑、 注射劑、微囊、錠劑、栓劑、片劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
【文檔編號】A61K36/489GK105832814SQ201610266239
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】王漢卿, 陶偉偉, 張立明, 陳麗, 高曉娟, 張霞, 趙建軍, 余建強, 王英華
【申請人】寧夏醫(yī)科大學