一種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于護(hù)膚品領(lǐng)域，具體涉及一種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品及其制備方法。所述的護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成：表皮干細(xì)胞分泌素0.000001?0.0005％、植物提取物2～8％、角鯊?fù)?～2％、EDTA?2Na 0.10～0.25％、甘油5～10％、聚谷氨酸0.05～1％、K350 0.06～0.12％、肉豆蔻酸異丙酯2～6％、鯨蠟硬脂醇0.5～2％、聚二甲基硅氧烷1～2％，余量為水；其中，所述植物提取物由海紅豆、雪麗花、刺五、冬青皮和覆盆子制備而成。本發(fā)明護(hù)膚品顯著改善皮膚老化，延緩衰老，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，且制備方法簡單，性質(zhì)穩(wěn)定。
【專利說明】
一種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于護(hù)膚品領(lǐng)域，具體涉及一種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚衰老是由自然因素或非自然因素造成的皮膚衰老現(xiàn)象，表現(xiàn)為皺紋的出現(xiàn)、 皮膚的松弛、不規(guī)則性色素沉著、血管擴(kuò)張、表皮角化不良、出現(xiàn)異常增殖、真皮彈性纖維變 性及降解產(chǎn)物蓄積等。皮膚衰老與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，尤其與成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞 的衰老緊密聯(lián)系。成纖維細(xì)胞在衰老的過程中膠原的分泌減少，同時(shí)細(xì)胞膠原酶的誘導(dǎo)能 力上調(diào)，引起膠原蛋白分解增強(qiáng)，從而促使皮膚彈性下降，皺紋出現(xiàn)。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞在 皮膚保水、保濕、屏障以及皮膚并形成等多方面具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。角質(zhì)形成細(xì)胞衰 老的過程中與皮膚修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)遲緩，而損傷有關(guān)基因表達(dá)增加，從而促使皮膚老 化。
[0003] 干細(xì)胞是一種尚未分化發(fā)育的種子細(xì)胞，具有無限自我更新復(fù)制能力，且能分化 成特定組織，這是干細(xì)胞用于護(hù)膚美容乃至組織再生的基礎(chǔ)。研究表明，在衰老的動(dòng)物體 內(nèi)，表皮細(xì)胞代謝速度減慢，因此皮膚斑點(diǎn)增加，皺紋增多。表皮干細(xì)胞的主要功能是補(bǔ)充 表皮細(xì)胞維持皮膚細(xì)胞的平衡以及修復(fù)受損組織。促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖分化就能使皮膚 保持旺盛的新陳代謝。此外，干細(xì)胞的自我復(fù)制及多潛能分化還依賴于多種生長因子的協(xié) 同促進(jìn)作用，研究表明，干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中會(huì)分泌一些活性物質(zhì)，包括生長因子、細(xì)胞因 子、活性多肽、蛋白質(zhì)、生長激素、微量元素等物質(zhì)，促進(jìn)自身的擴(kuò)增及分化的子細(xì)胞的增 殖。
[0004] 目前，已有人從干細(xì)胞培養(yǎng)的殘液中提干細(xì)胞分泌因子(又稱干細(xì)胞分泌素）用于 化妝品。邰舉在科技日報(bào)發(fā)表的"全球首支干細(xì)胞化妝品將在韓上市"一文中指出2011年韓 國FCB Pharmicell公司以骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)液為核心原料開發(fā)出了人體干細(xì)胞培養(yǎng)液化妝 品，該公司在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)注入骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)液的皮膚成纖維細(xì)胞中生成的膠原蛋白量是 對照組的5倍以上。中國專利申請201110452259.6公開了一種用于皮膚美容修復(fù)的復(fù)合生 物制劑及制備方法，該復(fù)合生物制劑含有臍帶血干細(xì)胞活性成分和胎盤活性成分，具有促 進(jìn)產(chǎn)婦表皮干細(xì)胞的代謝，從而實(shí)現(xiàn)美容修復(fù)，護(hù)膚祛斑的目的，但所述的復(fù)合生物制劑是 按照常規(guī)的護(hù)膚品生產(chǎn)方法制備而成的，即將臍帶血干細(xì)胞活性物、胎盤活性物按比例與 常規(guī)化妝品的賦形物混合按照常規(guī)的護(hù)膚品生產(chǎn)方法制成霜類化妝品等。眾所周知，干細(xì) 胞美容產(chǎn)品中的活性成分很容易在常溫下失活，要保持它的活性，就必須有特定條件下制 備和保存。因此，此類干細(xì)胞美容產(chǎn)品的效果有待商榷。此外，異源性的干細(xì)胞提取物應(yīng)用 于人容易引起過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能有效地對皮膚進(jìn)行修復(fù)且不會(huì)引起過敏反應(yīng)的含 有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品及其制備方法。所述的抗衰老護(hù)膚品活性成分能較好 地保存，從而充分發(fā)揮其促進(jìn)皮膚增生能力，提高皮膚彈性，改善膚質(zhì)的效果，不存在異源 性等原因引起的過敏反應(yīng)等現(xiàn)象，且制備方法簡單，性質(zhì)穩(wěn)定。
[0006] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案以實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0007] -種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述護(hù)膚品由以下重 量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì)胞分泌素0.000001-0.0005%、植物提取物2~8%、角鯊 烷1~2%401厶-2恥0.10~0.25%、甘油5~10%、聚谷氨酸0.05~1%、6瓜>頓1(350 0.06~ 0.12%、肉豆蔻酸異丙酯2~6%、鯨蠟硬脂醇0.5~2%、聚二甲基硅氧烷1~2%，余量為水。
[0008] 優(yōu)選地，所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組 分組成:表皮干細(xì)胞分泌素0 . 〇〇〇 125 %、植物提取物6 %、角鯊?fù)? %、EDTA-2Na 0.15 %、甘 油8%、聚谷氨酸0.50%、卻、;>4免1(350 0.10%、肉豆蔻酸異丙酯4%、鯨錯(cuò)硬脂醇1%、聚二甲 基硅氧烷2 %，余量為水。
[0009] 進(jìn)一步地，所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合 物。
[0010] 進(jìn)一步地，所述植物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆16~28 %、 雪麗花14~30%、刺五加12~28%、冬青皮14~26%和覆盆子10~22%。
[0011] 優(yōu)選地，所述植物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆22%、雪麗花 22%、刺五加20%、冬青皮20%和覆盆子16%。
[0012] 進(jìn)一步地，所述表皮干細(xì)胞分泌素的制備方法包括以下步驟：
[0013] ⑴人表皮干細(xì)胞的獲取
[0014]取手術(shù)切除或刮取口腔上皮組織，將組織轉(zhuǎn)入含有青霉素、鏈霉素和硫酸慶大霉 素的D-PBSA(磷酸鹽緩沖液）中，干冰或液氮冷凍條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。反復(fù)漂洗2-3次，加入 胰蛋白酶37°C消化30min，將口腔上皮組織剪碎，用70-100um細(xì)胞過濾器過濾上皮細(xì)胞，收 集濾液。1200r/min條件下離心5min，棄上清，用Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基輕柔吹 打，得細(xì)胞懸液，利用膠原快速貼附法分離純化人表皮干細(xì)胞；
[0015] (2)人表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0016]將步驟（1)得到的人表皮干細(xì)胞接種在含有100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素 Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中，37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱孵育12-24h，棄培養(yǎng)基，重新加 入新鮮的含有青霉素和鏈霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)l-3d，棄培養(yǎng)基，加 入Def ined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待人表皮干細(xì)胞接近90 %融合時(shí)，傳代培 養(yǎng)；
[0017] ⑶表皮干細(xì)胞分泌素的制備
[0018] 將人表皮干細(xì)胞擴(kuò)增1-5代，收集培養(yǎng)上清液，將上清液用0.22M1的無菌過濾器過 濾，合并每一代的濾液即得表皮干細(xì)胞分泌素。
[0019] 進(jìn)一步地，所述植物提取物的制備方法包括以下步驟：
[0020] 分別按比例取各味藥材，洗去雜質(zhì)，干燥后粉碎，過50~60目篩，合并粗粉，加入藥 材粗粉總重量8~12倍量體積分?jǐn)?shù)為50~70%的乙醇，微波提取4~6分鐘，微波功率為400 ~500W，提取溫度為40~60°C，將提取液過濾，按同樣條件重復(fù)提取1次，合并提取液，減壓 濃縮至60°C下測相對密度為1.05~1.15的浸膏，制得植物提取物。
[0021] 此外，本發(fā)明還提供所述的抗衰老護(hù)膚品的制備方法，其包括以下步驟：
[0022] 步驟1:將表皮干細(xì)胞分泌素、賦形劑、注射用水混合均勻，進(jìn)行真空冷凍干燥，得 凍干粉備用；
[0023] 步驟2:將EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混勻，加熱至80°C，均質(zhì)6~lOmin，攪拌至溶解 完全，得物料A;
[0024] 步驟3:將甘油、角鯊?fù)?、肉豆蔻酸異丙酯、鯨蠟硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混勻，加 熱至80~90°C，均質(zhì)10~15min，攪拌至溶解完全，得物料B;向物料A中緩慢加入物料B，攪拌 均勻，開始降溫；
[0025] 步驟4:待溫度降至30°C左右時(shí)，向乳化鍋中加入植物提取物、euxyl?K350和步驟1 制得的凍干粉，攪拌均勻，對板出料；
[0026]其中，步驟1所述的賦形劑為甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物；
[0027] 其中，步驟1的真空冷凍干燥步驟為:將表皮干細(xì)胞分泌素、賦形劑、注射用水混合 均勻后置于-70°C凍干機(jī)中，冷卻至-50°C以下，預(yù)凍6h，抽真空8h，緩慢升溫至-20 °C，再以5 °C/h的速度升溫至25°C，保溫干燥2h，即得。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0029] (1)本發(fā)明提供的抗衰老護(hù)膚品的活性成分為表皮干細(xì)胞分泌素和植物提取物， 所述的表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物，因此可避免干 細(xì)胞提取物異源性導(dǎo)致的免疫排斥反應(yīng)，降低過敏反應(yīng)的發(fā)生率;此外，植物提取物中的有 效成分具有促進(jìn)透皮吸收作用，使抗衰老護(hù)膚品的活性成分深入到皮膚真皮層和皮下組織 充分發(fā)揮修復(fù)皮膚，促進(jìn)皮膚增生能力的功效;另外，植物提取物中的有效成分還具有蛋白 水解酶抑制作用，從而延緩表皮干細(xì)胞分泌素中的生物活性成分在真皮細(xì)胞和皮下組織細(xì) 胞內(nèi)被蛋白水解酶降解的速度，提高表皮干細(xì)胞分泌素抗衰老功效。
[0030] (2)本發(fā)明在制備抗衰老護(hù)膚品的過程中，采用真空冷凍干燥技術(shù)把表皮干細(xì)胞 分泌素制成凍干粉，有利于保存表皮干細(xì)胞分泌素中的生物活性成分，從而更好地發(fā)揮抗 衰老功效。
[0031] (3)本發(fā)明提供的抗衰老護(hù)膚品能顯著改善皮膚老化，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，增加 角質(zhì)層含水量和油脂含量，其效果優(yōu)于資生堂悠萊多活力乳液，且制備方法簡單，性質(zhì)穩(wěn) 定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下通過【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅限于以下實(shí)施例。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例1所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鯊?fù)?%40了4-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.50%、euxy_K350 0.10%、肉豆蔻酸異丙酯4%、鯨錯(cuò)硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余 量為水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆22%、雪麗花22%、刺五加20%、冬青 皮20%和覆盆子16%。
[0035]制備方法：
[0036] (1)表皮干細(xì)胞分泌素的制備：
[0037] 人表皮干細(xì)胞的獲取:取手術(shù)切除或刮取口腔上皮組織，將組織轉(zhuǎn)入含有青霉素、 鏈霉素和硫酸慶大霉素的D-PBSA(磷酸鹽緩沖液）中，干冰或液氮冷凍條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。 反復(fù)漂洗3次，加入胰蛋白酶37°C消化30min，將口腔上皮組織剪碎，用lOOum細(xì)胞過濾器過 濾上皮細(xì)胞，收集濾液。1200r/min條件下離心5min，棄上清，用Defined Keratinocyte-SFM 培養(yǎng)基輕柔吹打，得細(xì)胞懸液，利用膠原快速貼附法分離純化人表皮干細(xì)胞；
[0038]人表皮干細(xì)胞的培養(yǎng):將人表皮干細(xì)胞接種在含有100U/ml青霉素和100ug/ml鏈 霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育24h，棄培養(yǎng)基，重新加 入新鮮的含有青霉素和鏈霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d，棄培養(yǎng)基，加入 Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待人表皮干細(xì)胞接近90%融合時(shí)，傳代培養(yǎng)； [0039]表皮干細(xì)胞分泌素的制備:將人表皮干細(xì)胞擴(kuò)增5代，收集培養(yǎng)上清液，將上清液 用0.22mi的無菌過濾器過濾，合并每一代的濾液即得表皮干細(xì)胞分泌素；
[0040] (2)植物提取物的制備：
[0041 ]分別按比例取各味藥材，洗去雜質(zhì)，干燥后粉碎，過60目篩，合并粗粉，加入藥材粗 粉總重量10倍量體積分?jǐn)?shù)為60 %的乙醇，微波提取5分鐘，微波功率為450W，提取溫度為45 °C，將提取液過濾，按同樣條件重復(fù)提取1次，合并提取液，減壓濃縮至60°C下測相對密度為 1.05的浸膏，制得植物提取物；
[0042] (3)抗裝老護(hù)膚品的制備：
[0043] 步驟1:將表皮干細(xì)胞分泌素、賦形劑、注射用水混合均勻后置于-70°C凍干機(jī)中， 冷卻至-50 °C以下，預(yù)凍6h，抽真空8h，緩慢升溫至-20 °C，再以5 °C/h的速度升溫至25 °C，保 溫干燥2h，即得凍干粉備用；
[0044] 步驟2:將EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混勻，加熱至80°C，均質(zhì)6~10min，攪拌至溶解 完全，得物料A;
[0045] 步驟3:將甘油、角鯊?fù)?、肉豆蔻酸異丙酯、鯨蠟硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混勻，加 熱至80~90°C，均質(zhì)10~15min，攪拌至溶解完全，得物料B;向物料A中緩慢加入物料B，攪拌 均勻，開始降溫；
[0046] 步驟4:待溫度降至30 °C左右時(shí)，向乳化鍋中加入植物提取物、euxyl⑧K350和步驟1 制得的凍干粉，攪拌均勻，對板出料；
[0047]其中，步驟1所述的賦形劑為甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物。
[0048] 實(shí)施例2
[0049] 本發(fā)明實(shí)施例2所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.0005%、植物提取物8%、角鯊?fù)?%、EDTA-2Na 0.25%、甘油10%、聚谷氨酸 1%、euxyl?K350 0.12%、肉豆蔻酸異丙酯6%、鯨錯(cuò)硬脂醇2%、聚二甲基硅氧烷2%，余量為 水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述植物提 取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得：海紅豆16%、雪麗花14%、刺五加28%、冬青皮 20 %和覆盆子22 %。
[0050] 制備方法同實(shí)施例1。
[0051 ] 實(shí)施例3
[0052]本發(fā)明實(shí)施例3所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.000001 %、植物提取物2%、角鯊?fù)? %、EDTA-2Na 0.10 %、甘油5 %、聚谷氨酸 0.05%、e.uxyl_?K350 0.06%、肉豆蔻酸異丙酯2%、鯨錯(cuò)硬脂醇0.5%、聚二甲基硅氧烷1%， 余量為水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述 植物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆28%、雪麗花30%、刺五加12%、冬 青皮20 %和覆盆子10 %。
[0053]制備方法同實(shí)施例1。
[0054] 實(shí)施例4
[0055] 本發(fā)明實(shí)施例4所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.00025%、植物提取物6%、角鯊?fù)?%4014-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.25 %、_euxyi?K350 0.10 %、肉豆蔻酸異丙酯4%、鯨錯(cuò)硬脂醇1 %、聚二甲基硅氧烷2%，余 量為水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆20 %、雪麗花20 %、刺五加20 %、冬青 皮26%和覆盆子14%。
[0056]制備方法同實(shí)施例1。
[0057] 實(shí)施例5
[0058]本發(fā)明實(shí)施例5所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.00005 %、植物提取物8%、角鯊?fù)? %、EDTA-2Na 0.25 %、甘油10 %、聚谷氨酸 0.75 %、eu?cyl?K350 0.12 %、肉豆蔻酸異丙酯6 %、鯨蠟硬脂醇2 %、聚二甲基硅氧烷2 %，余 量為水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆28%、雪麗花30%、刺五加12%、冬青 14%和覆盆子16%。
[0059]制備方法同實(shí)施例1。
[0060] 對比例1
[0061] 本發(fā)明對比例1所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.000125%、角鯊?fù)? %、EDTA-2Na 0.15 %、甘油8%、聚谷氨酸0.50%、euxy?K350 0.10%、肉豆蔻酸異丙酯4%、鯨蠟硬脂醇1 %、聚二甲基硅氧烷2%，余量為水;所述表皮干 細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物。（與實(shí)施例1相比缺乏植物提 取物這一組分）
[0062]制備方法參考實(shí)施例1。
[0063] 對比例2
[0064] 本發(fā)明對比例2所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:植物提取 物6%、角鯊?fù)?1 %、EDTA-2Na 0.15%、甘油8%、聚谷氨酸0.50%、euxy靡K350 0.10%、肉豆 蔻酸異丙酯4%、鯨蠟硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余量為水;所述植物提取物由以下重 量百分計(jì)的原料制備而得：海紅豆22%、雪麗花22%、刺五加20%、冬青皮20 %和覆盆子 16%。（與實(shí)施例1相比缺乏表皮干細(xì)胞分泌素這一組分）
[0065]制備方法參考實(shí)施例1。
[0066] 對比例3
[0067] 本發(fā)明對比例3所述的抗衰老護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì) 胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鯊?fù)?%40了4-2他0.15%、甘油8%、聚谷氨酸 0.50%、eu:xy_i?K350 0.10%、肉豆蔻酸異丙酯4%、鯨錯(cuò)硬脂醇1%、聚二甲基硅氧烷2%，余 量為水;所述表皮干細(xì)胞分泌素為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物;所述植 物提取物由以下重量百分計(jì)的原料制備而得:雪麗花30%、刺五加28%、冬青皮20%和覆盆 子22%。（與實(shí)施例1相比所述的植物提取物缺乏海紅豆這一組分）
[0068]制備方法參考實(shí)施例1。
[0069 ]試驗(yàn)例一、本發(fā)明抗衰老護(hù)膚品抗皮膚老化臨床觀察
[0070] 1 ?試驗(yàn)方法
[0071] 篩選540例皮膚出現(xiàn)老化的女性受試志愿者，年齡28-50歲，平均年齡35歲，入選標(biāo) 準(zhǔn):皮膚干燥，彈性降低，出現(xiàn)皺紋、色素沉著、膚色灰暗等皮膚老化現(xiàn)象;在整個(gè)試驗(yàn)期間 愿意避免日曬，或接觸陽光時(shí)面部使用SPF 2 30的防曬產(chǎn)品；在整個(gè)試驗(yàn)期間不使用其他抗 裝老廣品〇
[0072] 540例女性受試志愿者隨機(jī)分為9組，分別為對照組、實(shí)施例1 -5組、對比例1 -3組， 每組60例，其中，對照組受試者使用Shiseido Urara Multy-Vitalizing Emulsion(資生堂 悠萊多活力乳液），早、晚潔面后取適量的乳液涂抹在面部;實(shí)施例1-5組和對比例1-3組受 試者分別使用本發(fā)明實(shí)施例1-5、對比例1-3制得的抗衰老護(hù)膚品，早、晚潔面后取適量的護(hù) 膚品涂抹在面部，各組整個(gè)試驗(yàn)時(shí)間為90d，記錄試驗(yàn)期間發(fā)生的不良反應(yīng)，并對受試者進(jìn) 行效果評價(jià)。
[0073] 皮膚老化評估:通過觀察受試者的5個(gè)受試區(qū)的皺紋來評價(jià)(眉間紋、前額皺紋、魚 尾紋、鼻唇溝、唇周皺紋），評判標(biāo)準(zhǔn):沒有皺紋;輕度:有2-3條淺皺紋，長度< 1.5cm;中度： 有2-6條淺皺紋，長度< 3cm;重度:有數(shù)條主皺紋，長度達(dá)4cm，同時(shí)伴有淺皺紋。
[0074] 安全性評估:主要評價(jià)使用產(chǎn)品后受試者出現(xiàn)輕微不適、紅斑、干燥、瘙癢和刺痛 等不良反應(yīng)的發(fā)生情況。
[0075] 在第90d對受試者采用無創(chuàng)性儀器檢測受試部位的含水量、油脂含量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析。
[0076] 2 ?試驗(yàn)結(jié)果
[0077]表1試驗(yàn)結(jié)束后各組受試者的皮膚老化評估
[0079]~表2試驗(yàn)期間各組受試者的不良反應(yīng)評價(jià)
[0081 ]表3各組受試者的試驗(yàn)期間的角質(zhì)層含水量和油脂含量評價(jià)
[0084] 注：與0d 比較，*P<0 ? 05，林 P<0 ? 01。
[0085] Shiseido Urara Multy-Vitalizing Emulsion為日本資生堂悠萊多活力乳液，是 含有表皮生長因子的新一代抗衰老產(chǎn)品，專為中國女性配制的產(chǎn)品，其包含了三重氨基酸 修復(fù)成分，保濕、亮白、活化肌膚，促進(jìn)膠原蛋白的合成;可有效改善皮膚的干燥、暗啞和皺 紋等問題，同時(shí)保護(hù)皮膚，阻隔外界有害物質(zhì)，使皮膚年輕、亮白、光澤和有彈性;含有的表 皮生長因子活性成分，令肌膚光滑、緊致。
[0086] 本研究以日本資生堂悠萊多活力乳液作為對照組，評價(jià)本發(fā)明抗衰老護(hù)膚品的效 果，結(jié)果表明，使用本發(fā)明實(shí)施例1-5制備的抗衰老護(hù)膚品，沒有受試者皮膚老化達(dá)到嚴(yán)重 程度，而對照組有2例；同時(shí)受試者也沒有出現(xiàn)紅斑、刺痛的不良反應(yīng)，而對照組有2例受試 者出現(xiàn)紅斑，3例受試者出現(xiàn)刺痛;此外，使用本發(fā)明實(shí)施例1-5制備的抗衰老護(hù)膚品均可顯 著增加受試者皮膚角質(zhì)層含水量和油脂含量，其中以實(shí)施例1制備的抗衰老護(hù)膚品效果較 佳，其增加受試者皮膚角質(zhì)層含水量達(dá)到極顯著差異，以上結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例1-5制 備的抗衰老護(hù)膚品可顯著改善皮膚老化，降低不良反應(yīng)的發(fā)生，增加角質(zhì)層含水量和油脂 含量，并以實(shí)施例1的抗衰老護(hù)膚品效果最佳，且優(yōu)于對照組。本發(fā)明抗衰老護(hù)膚品能有效 的增加皮膚角質(zhì)層的含水量，補(bǔ)水保濕，并通過增加皮脂，起到潤滑皮膚的作用。對比例1和 2分別缺乏植物提取物和表皮干細(xì)胞分泌素，其改善皮膚老化的效果明顯減弱，不良反應(yīng)的 發(fā)生率明顯增加，增加受試者皮膚角質(zhì)層含水量和油脂含量效果不顯著，表明本發(fā)明抗衰 老護(hù)膚品中的有效成分植物提取物和表皮干細(xì)胞分泌素兩者具有相互協(xié)調(diào)，相互促進(jìn)的作 用，缺乏其一均會(huì)導(dǎo)致抗衰老的效果降低。植物提取物中的有效成分具有促進(jìn)透皮吸收作 用，使抗衰老護(hù)膚品的活性成分深入到皮膚真皮層和皮下組織充分發(fā)揮修復(fù)皮膚，促進(jìn)皮 膚增生能力的功效;表皮干細(xì)胞分泌素含有多種對皮膚細(xì)胞活性有影響的生長因子、細(xì)胞 因子、活性多肽、微量元素、氨基酸等多種活性物質(zhì)，有利于促進(jìn)皮膚新陳代謝，延緩衰老。 海紅豆具有疏風(fēng)清熱，燥濕止癢，潤膚養(yǎng)顏的功效，并對蛋白水解酶具有較強(qiáng)的抑制作用， 對比例3中的植物提取物缺乏海紅豆這一組分，使其抗衰老的效果稍優(yōu)于對比例1和對比例 2,但與實(shí)施例1-5的效果比較明顯減弱，表明海紅豆中的有效分成分通過抑制蛋白水解酶 的活性延緩表皮干細(xì)胞分泌素在細(xì)胞內(nèi)代謝分解，充分發(fā)揮表皮干細(xì)胞分泌素促進(jìn)皮膚新 陳代謝，延緩衰老的作用。以上結(jié)果表明，本發(fā)明抗衰老護(hù)膚品組方中各成分搭配合理，相 互增益，對改善皮膚老化具有顯著的效果，且不良反應(yīng)低，安全性高。
[0087]以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對 本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改 進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含有表皮干細(xì)胞分泌素的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述護(hù)膚品由以下重量 百分比計(jì)的組分組成:表皮干細(xì)胞分泌素0.000001-0.0005%、植物提取物2~8%、角鯊?fù)? ~2%40了厶-2他0.10~0.25%、甘油5~10%、聚谷氨酸0.05~1%、沈9物1(350 0.06~ 0.12%、肉豆蔻酸異丙酯2~6%、鯨蠟硬脂醇0.5~2%、聚二甲基硅氧烷1~2%，余量為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述護(hù)膚品由以下重量百分比計(jì) 的組分組成：表皮干細(xì)胞分泌素0.000125%、植物提取物6%、角鯊?fù)?%30了4-2此 0.15 %、甘油8 %、聚谷氨酸0.50 %、ei?yl?K350 0.10 %、肉豆蔻酸異丙酯4 %、鯨蠟硬脂醇 1%、聚二甲基硅氧烷2%，余量為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述表皮干細(xì)胞分泌素 為人的表皮干細(xì)胞分泌的多種活性因子的混合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任一所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述植物提取物由以下 重量百分計(jì)的原料制備而得:海紅豆16~28%、雪麗花14~30%、刺五加12~28%、冬青皮 14~26%和覆盆子10~22%。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述植物提取物由以下重量百分 計(jì)的原料制備而得:海紅豆22%、雪麗花22%、刺五加20%、冬青皮20%和覆盆子16%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述表皮干細(xì)胞分泌素的制備方 法包括以下步驟： (1) 人表皮干細(xì)胞的獲取 取手術(shù)切除或刮取口腔上皮組織，將組織轉(zhuǎn)入含有青霉素、鏈霉素和硫酸慶大霉素的 D-PBSA(磷酸鹽緩沖液）中，干冰或液氮冷凍條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。反復(fù)漂洗2-3次，加入胰蛋 白酶37 °C消化30min，將口腔上皮組織剪碎，用70-100um細(xì)胞過濾器過濾上皮細(xì)胞，收集濾 液。1200r/min條件下離心5min，棄上清，用Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基輕柔吹打，得 細(xì)胞懸液，利用膠原快速貼附法分離純化人表皮干細(xì)胞； (2) 人表皮干細(xì)胞的培養(yǎng) 將步驟（1)得到的人表皮干細(xì)胞接種在含有1 〇〇U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素 Def ined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育12-24h，棄培養(yǎng)基，重新加入新鮮的 含有青霉素和鏈霉素 Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基，培養(yǎng)l-3d，棄培養(yǎng)基，加入 Defined Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待人表皮干細(xì)胞接近90%融合時(shí)，傳代培養(yǎng)； (2)表皮干細(xì)胞分泌素的制備 將人表皮干細(xì)胞擴(kuò)增1-5代，收集培養(yǎng)上清液，將上清液用0.22μπι的無菌過濾器過濾， 合并每一代的濾液即得表皮干細(xì)胞分泌素。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗衰老護(hù)膚品，其特征在于，所述植物提取物的制備方法包括 以下步驟： 分別按比例取各味藥材，洗去雜質(zhì)，干燥后粉碎，過50~60目篩，合并粗粉，加入藥材粗 粉總重量8~12倍量體積分?jǐn)?shù)為50~70 %的乙醇，微波提取4~6分鐘，微波功率為400~ 500W，提取溫度為40~60°C，將提取液過濾，按同樣條件重復(fù)提取1次，合并提取液，減壓濃 縮至60°C下測相對密度為1.05~1.15的浸膏，制得植物提取物。8. -種制備如權(quán)利要求1 -7任一所述的抗衰老護(hù)膚品的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟1:將表皮干細(xì)胞分泌素、賦形劑、注射用水混合均勻，進(jìn)行真空冷凍干燥，得凍干 粉備用； 步驟2:將EDTA-2Na、聚谷氨酸和水混勻，加熱至80°C，均質(zhì)6~lOmin，攪拌至溶解完全， 得物料A; 步驟3:將甘油、角鯊?fù)?、肉豆蔻酸異丙酯、鯨蠟硬脂醇和聚二甲基硅氧烷混勻，加熱至 80~90°C，均質(zhì)10~15min，攪拌至溶解完全，得物料B;向物料A中緩慢加入物料B，攪拌均 勻，開始降溫； 步驟4:待溫度降至30°C左右時(shí)，向乳化鍋中加入植物提取物、eiKyl@K350和步驟1制得 的凍干粉，攪拌均勻，對板出料。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗衰老護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟1所述的賦形劑 為甘露醇和L-精氨酸以1:1配比制得的混合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗衰老護(hù)膚品的制備方法，其特征在于，步驟1的真空冷凍干 燥步驟為：將表皮干細(xì)胞分泌素、賦形劑、注射用水混合均勻后置于_70°C凍干機(jī)中，冷卻 至-50°C以下，預(yù)凍6h，抽真空8h，緩慢升溫至-20°C，再以5°C/h的速度升溫至25°C，保溫干 燥2h，即得。
【文檔編號】A61Q19/08GK105853341SQ201610316104
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】陳松彬, 易萍, 張愛萍, 倪彥艷, 劉杰森
【申請人】廣東科瑋生物技術(shù)股份有限公司