專利名稱：一種自體脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的評價體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種自體脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的評價體系，用本發(fā)明的體系能夠準(zhǔn)確、客觀、及時地對脂肪干細(xì)胞的抗衰老的效果進(jìn)行評價。
背景技術(shù)：
人類從胚胎發(fā)育、生命誕生到發(fā)育成熟、衰老直至死亡的整個生命過程中，不可避免地會發(fā)生組織、器官的損傷和功能衰退。在正常生理過程中，人體每天都有大量細(xì)胞死亡，同時伴有大量細(xì)胞的新生，以維持各種組織和器官的完整性，保證功能處于正常狀態(tài)。 如果細(xì)胞的死亡與新生失去平衡，死亡細(xì)胞增多或新生細(xì)胞減少，就會導(dǎo)致組織器官功能的減退、疾病發(fā)生，甚至死亡。衰老是人體隨著年齡增長、環(huán)境影響而發(fā)生的組織、器官、細(xì)胞的功能退行性變化，表現(xiàn)為機(jī)體的功能活動能力進(jìn)行性下降，對環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸降低，體內(nèi)代謝平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致面色蒼老、皮膚松弛、皺紋增多、易疲勞、腦力和體力勞動能力下降、性功能減退等一系列衰老癥狀。由于衰老是全身系統(tǒng)性組織、器官功能退化，因此，抗衰老和整形的策略也應(yīng)考慮從整體水平改善功能。再生醫(yī)學(xué)的興起激發(fā)了人們對各種干細(xì)胞、組織工程支架和細(xì)胞生長因子的研究熱潮。干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能性細(xì)胞。干細(xì)胞可以對多種組織、器官、系統(tǒng)的老化退行性病變進(jìn)行再生性修復(fù)，使其結(jié)構(gòu)和功能正常化、年輕化，從整體上調(diào)控機(jī)體狀態(tài)，是一種全身性、系統(tǒng)性、根本性的保健。脂肪組織通常被認(rèn)為是貯存能量及內(nèi)分泌器官，是軟組織填充和吸脂處理的必要組織，脂肪組織在人體內(nèi)儲量豐富，獲取簡便。脂肪組織含有多種祖細(xì)胞，可分化為多種譜系，主要包含脂肪細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stemcells，ADSCs)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs) 是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，ADSCs在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，在體內(nèi)體外具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)因子作用下可以向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及胰島細(xì)胞分化，而且可以分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子。脂肪干細(xì)胞來源廣泛、取材容易、對機(jī)體損傷小，體內(nèi)儲備量大、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，且適宜自體移植和大規(guī)模培養(yǎng)，因此脂肪干細(xì)胞逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)之一，同時也為一系列疾病的治療提供了新的思路。研究證明，脂肪干細(xì)胞對新陳代謝和抗衰老有重要的調(diào)節(jié)功能，脂肪干細(xì)胞保健和治療能提高機(jī)體對各種脂蛋白的代謝功能，具有例如降低血中總膽固醇濃度，提高機(jī)體糖代謝功能，降低血糖水平，降低體重等功能。因此盡管用于抗衰老的脂肪干細(xì)胞發(fā)展很快，但是由于生物體的內(nèi)外環(huán)境的作用，阻礙了自體脂肪干細(xì)胞抗衰老的評價體系的建立，因此本領(lǐng)域需要開發(fā)和建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的脂肪干細(xì)胞抗衰老的評價方法和體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種簡便和/或高效的一種自體脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的評價體系。本發(fā)明提供了一種脂肪干細(xì)胞抗衰老的評價方法，對回輸了脂肪干細(xì)胞的個體， 在回輸結(jié)束一段時間后進(jìn)行血清學(xué)檢測，所述的血清學(xué)檢測包括檢測選自下組的一個或多個指標(biāo)維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇。(a)當(dāng)Ra彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral為個體回輸后血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結(jié)束前的維生素D濃度；(b)當(dāng)1 彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rb = (Rbl-RbO)+RbOX 100%，式中，Rbl為個體回輸后血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結(jié)束前的高密度脂蛋白濃度；(c)當(dāng)Rc彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結(jié)束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸后血清中的低密度脂蛋白濃度；(d)當(dāng)Rd彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rd = (RdO-Rdl)+RdOX 100%，式中，RdO為回輸結(jié)束前的促甲狀腺激素的濃度，Rdl為個體回輸后血清中促甲狀腺激素的濃度；(e)當(dāng)個體是男性時，且當(dāng)Re彡5 %時，則該指標(biāo)有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸后血清中的睪酮的濃度，ReO為回輸結(jié)束前的睪酮的濃度；(e)當(dāng)個體是女性時，且當(dāng)Rf彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸后血清中的雌二醇的濃度，RfO為回輸結(jié)束前的雌二醇的濃度；并且，當(dāng)所述指標(biāo)中至少一個指標(biāo)為有效時，則表示所述脂肪干細(xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述指標(biāo)中有2、3和4個指標(biāo)為有效時，則所述脂肪干細(xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，所述的回輸結(jié)束前，包括回輸開始之前、回輸過程中以及回輸結(jié)束時。在另一優(yōu)選例中，所述的一段時間為> 1個月。
在另一優(yōu)選例中，所述的一段時間為2-6個月，較佳地為3個月。在另一優(yōu)選例中，所述回輸?shù)闹靖杉?xì)胞為培養(yǎng)0-90天的脂肪干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述回輸?shù)闹靖杉?xì)胞為培養(yǎng)30天的脂肪干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述脂肪干細(xì)胞是自體脂肪干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Ra ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Ra ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rb ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rb ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rc ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rc ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rd ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rd ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Re ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述男性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Re ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述男性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rf ^ 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述女性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)Rf ^ 20%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述女性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。在另一優(yōu)選例中，所述的回輸?shù)闹靖杉?xì)胞的具有以下一個或多個特征(i) 95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶四；(ii) 90%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73 ；(iii) 90%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶49d ；和(iv) 90%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90。在另一優(yōu)選例中，99%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶四。在另一優(yōu)選例中，95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶73。在另一優(yōu)選例中，95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶49d在另一優(yōu)選例中，95%以上的細(xì)胞具有表面抗原⑶90。在另一優(yōu)選例中，所述脂肪干細(xì)胞還具有以下特征(ν) 5%以下的細(xì)胞具有表面抗原CD34 ；和/或
(vi)O. 05%以下的細(xì)胞具有表面抗原CD45。在另一優(yōu)選例中，3%以下的細(xì)胞具有表面抗原⑶34在另一優(yōu)選例中，0%的細(xì)胞具有表面抗原⑶45。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再--累述。


圖1顯示了用流式細(xì)胞儀法對制備的SVF進(jìn)行表面抗原標(biāo)記表達(dá)的分析結(jié)果。圖2顯示了用流式細(xì)胞儀法對經(jīng)培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞群進(jìn)行表面抗原標(biāo)記表達(dá)的分析結(jié)果。圖3顯示了分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為脂肪的能力，其中，圖3A顯示在成脂誘導(dǎo)劑作用下，脂肪干細(xì)胞能夠生成脂質(zhì)，胞漿中可見生產(chǎn)大量的紅色脂滴；圖3B為成脂實(shí)驗(yàn)的陰性對照，在沒有成脂誘導(dǎo)劑的作用下，脂肪干細(xì)胞不能夠自發(fā)生成脂質(zhì)。圖4顯示了分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為骨的能力，其中，圖4A顯示脂肪干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑作用下，經(jīng)茜素紅染色，可見細(xì)胞漿中有紅色的鈣化基質(zhì)沉積；圖4B 顯示成骨實(shí)驗(yàn)的陰性對照，在沒有成骨誘導(dǎo)劑的作用下，脂肪干細(xì)胞不能夠自發(fā)成骨。圖5顯示了回輸脂肪干細(xì)胞的受試者，其血液中維生素D的濃度顯著上升。圖6顯示了回輸脂肪干細(xì)胞的受試者，高密度脂蛋白(HDL)的濃度顯著上升。圖7顯示了回輸脂肪干細(xì)胞的受試者，低密度脂蛋白(LDL)的濃度均顯著下降。圖8顯示進(jìn)行脂肪干細(xì)胞回輸后的男性受試者，其血清中睪酮的濃度顯著上升。圖9顯示進(jìn)行脂肪干細(xì)胞回輸后的女性受試者，其血清中雌二醇的濃度顯著上升。圖10顯示了回輸脂肪干細(xì)胞的受試者，其血清中促甲狀腺激素的濃度均顯著下降。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，在可供檢測的大量的血清學(xué)指標(biāo)中，維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮(男性)、雌二醇(女性)的含量變化可以作為評價自體脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的有效性指標(biāo)，當(dāng)所述指標(biāo)中至少一個指標(biāo)為有效時，則表示所述脂肪干細(xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。與此相反，膽固醇， 血糖，總脂蛋白等的濃度不能作為評估脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的有效性指標(biāo)。用本發(fā)明的評價體系能夠客觀地對脂肪干細(xì)胞的抗衰老的效果進(jìn)行評價，并且具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語
如本文所用，術(shù)語“以上”和“以下”包括本數(shù)，例如“95%以上“指彡95%, "0.2% 以下”指彡0.2%。脂肪自體脂肪是整形和抗衰老治療的優(yōu)良來源，脂肪組織材料可以來源于腰部、臀部、 腹部、大腿、上臂等部位。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用通用的技術(shù)方法獲得自體脂肪組織，包括 (但不限于)抽吸、手術(shù)分離等方法。間質(zhì)血管碎片(SVF)SVF是干細(xì)胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細(xì)胞混合物形成的細(xì)胞團(tuán)就叫做間質(zhì)血管碎片。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)細(xì)胞，可分化為多種譜系的細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)、組織工程等最理想的種子細(xì)胞，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用通用的方法進(jìn)行SVF的純化，在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，分離SVF可以包括以下步驟(但不限于)將吸脂后的脂肪用PBS反復(fù)沖洗兩次，然后在37°C條件下用膠原酶消化30min，用含10%胎牛血清的DMEM終止消化，1200g離心IOmin后即獲得高密度的SVF碎片，其中主要包括間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞。另外，SVF中也包括一些血管來源的細(xì)胞，如白細(xì)胞和紅細(xì)胞等，各種細(xì)胞之間具有協(xié)同效應(yīng)。脂肪干細(xì)胞如本文所用，術(shù)語“脂肪干細(xì)胞”、“本發(fā)明脂肪干細(xì)胞”、或“本發(fā)明的干細(xì)胞”可以互換使用，都是指分離自脂肪組織的干細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。ADSCs能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內(nèi)儲備量大、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對機(jī)體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪的原料沒有特別限制，可以是來源于動物或人的任何部位的脂肪組織，優(yōu)選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。干細(xì)胞抗原檢測脂肪干細(xì)胞群具有多種特異性抗原和受體，主要有D29、⑶73、⑶49d、⑶90、⑶14、 CD45、CD34、CD3、CD13、CD59、CD105 等。⑶34抗原是一種高度糖基化的I型跨膜蛋白，它選擇性的表達(dá)于人類造血干細(xì)胞 (HSC)，祖細(xì)胞(PC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)表面，是脂肪干細(xì)胞的陰性指標(biāo)，帶有CD34的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為< 5%，更佳地，<3%。⑶45存在于所有造血細(xì)胞的表面，包括造血干細(xì)胞和破骨細(xì)胞，是脂肪干細(xì)胞的陰性指標(biāo)，帶有⑶45的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為< 0. 1%，更佳地，為0%。⑶四、⑶73、⑶90、⑶49d等主要存在于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面。帶有⑶四的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 95%，更佳地> 97%，最佳地彡 99%。帶有⑶73的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 80%，更佳地> 85%，最佳地彡 88%。帶有⑶90的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為> 75%，更佳地> 78%，最佳地彡 80%。
帶有⑶49d的脂肪干細(xì)胞在總干細(xì)胞的比例優(yōu)選為彡90%，更佳地彡95%，最佳地彡99%。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法檢測脂肪干細(xì)胞的純度和分化程度，如流式細(xì)胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈； 遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合一定時間，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選。成脂誘導(dǎo)及檢測由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，能夠得到特定功能的已分化的細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。一種優(yōu)選的誘導(dǎo)方法是向培養(yǎng)液中加入地塞米松。含地塞米松的誘導(dǎo)劑主要有3種，1.地塞米松加1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)，2.地塞米松加胰島素，3.地塞米松加茚甲新 (indomethacin,消炎痛)、1_甲基_3_異丁基黃嘌呤及胰島素。低濃度的地塞米松是無血清或低血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的必需成分之一，能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外快速增殖； 較高濃度的地塞米松則可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、蘇丹紅5B和溶劑紅 27等)對脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成脂進(jìn)行檢測。一種優(yōu)選的染料是Oil Red(O)，即油紅0。油紅 0的結(jié)構(gòu)為1-[2，5_ 二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]-2萘酚，是一種紅色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪誘導(dǎo)的過程中，細(xì)胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個細(xì)胞的胞漿中都是油滴。油紅0作為生物染色劑，易與油脂結(jié)合，但與細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)著色力差。在顯微鏡下可以清楚地進(jìn)行成脂染色觀察。成骨誘導(dǎo)及檢測由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，能夠得到成骨細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用通用的方法對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。一種優(yōu)選的化學(xué)成骨誘導(dǎo)液配方為DMEM培養(yǎng)液，甘油磷酸鈉，維生素C和地塞米松。成骨誘導(dǎo)的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，即“鈣結(jié)節(jié)”。一種優(yōu)選的鑒定鈣結(jié)節(jié)的染料未“茜素紅”。茜素紅染色液一般包括以下組分 茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2- 二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。茜素紅為橙黃色或黃棕色粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。茜素紅染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。維生素D (Vitamin D，VD)維生素D(Vitamin D，VD)為固醇類衍生物，脂溶性，由于具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素，VD能夠維持血清鈣磷濃度的穩(wěn)定。在本發(fā)明中，當(dāng)Ra彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，
Ra= (Ral-RaO) ^-RaO X 100%,式中，Ral為個體回輸后血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結(jié)束前的維生素D濃度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，維生素D水平的提高，有助于提高個體的健康水平。當(dāng)個體回輸自體脂肪干細(xì)胞后，其血液中的維生素D的含量有大幅上升，其原因可能是脂肪干細(xì)胞可以分化為骨細(xì)胞，刺激并誘導(dǎo)甲狀旁腺素分泌的分泌，導(dǎo)致血清中的維生素D濃度上升。脂蛋白(Lipoprotein)脂蛋白是一種與脂質(zhì)復(fù)合的水溶性蛋白質(zhì)。通常根據(jù)其密度分為極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極高密度脂蛋白和乳糜微粒。每一種脂蛋白中均含有相應(yīng)的載脂蛋白。高密度脂蛋白(HDL)可將蓄積于末梢組織的游離膽固醇與血液循環(huán)中脂蛋白或與某些大分子結(jié)合而運(yùn)送到各組織細(xì)胞，主要是肝臟。實(shí)際上是膽固醇逆轉(zhuǎn)(RCR)，RCT促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇量的相對衡定，從而限制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，起到抗動脈粥樣硬化作用。LCAT通過轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)完成新生盤狀HDL向HDL3、HDL2 的轉(zhuǎn)化，減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度，構(gòu)成膽固醇從細(xì)胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度，降低組織膽固醇的沉積。低密度脂蛋白(LDL)是富含膽固醇的脂蛋白，主要作用是將膽固醇運(yùn)送到外周血液，是動脈粥樣硬化的危險因素之一，被認(rèn)為是致動脈粥樣硬化的因子。在本發(fā)明中，當(dāng)Rb彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rb= (Rbl-RbO) ^-RbO X 100%,式中，Rbl為個體回輸后血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結(jié)束前的高密度脂蛋白濃度。當(dāng)Rc彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rc = (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結(jié)束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸后血清中的低密度脂蛋白濃度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體回輸脂肪干細(xì)胞，有助于提高血清中高密度脂蛋白的濃度，降低低密度脂蛋白濃度，從而提高個體的健康水平。促甲狀腺激素(Thyrotropin, thyroid stimulating hormone)促甲狀腺激素是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺的生長和機(jī)能的激素。人類的TSH為一種糖蛋白，含211個氨基酸，糖類約占整個分子的15%。整個分子由兩條肽鏈-α鏈和β 鏈組成。TSH全面促進(jìn)甲狀腺的機(jī)能，稍早出現(xiàn)的是促進(jìn)甲狀腺激素的釋放，稍晚出的為促進(jìn)Τ4、Τ3的合成，包括加強(qiáng)碘泵活性，增強(qiáng)過氧化物酶活性，促進(jìn)甲狀腺球蛋白合成及酪氨酸碘化等各個環(huán)節(jié)。TSH促進(jìn)甲狀腺上皮細(xì)胞的代謝及胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞呈高柱狀增生，從而使腺體增大。在本發(fā)明中，當(dāng)Rd彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rd = (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl為個體回輸后血清中促甲狀腺激素的濃度，RdO為回輸結(jié)束前促甲狀腺激素的濃度。TSH和甲狀腺的產(chǎn)生和功能之間是一個反比關(guān)系，高的促甲狀腺激素，標(biāo)志著低甲狀腺的生成和功能。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體脂肪干細(xì)胞回輸治療后，TSH的水平在1個月和3 個月期間內(nèi)顯著下降，表明甲狀腺激素的產(chǎn)生和功能有顯著改善，自體脂肪干細(xì)胞的回輸緩解了年齡相關(guān)疾病。睪酮(Testosterone)睪酮是由雄性睪丸或雌性卵巢分泌的一種類固醇激素。是人體內(nèi)主要的雄激素， 包括增強(qiáng)性欲、力量、免疫功能等功效。睪酮作為一種激素原，還能夠在芳香化酶的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)?7 β-雌二醇。在本發(fā)明中，當(dāng)個體為男性，且Re ^ 5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Re = (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸后血清中的睪酮濃度，ReO為回輸結(jié)束前的睪酮濃度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體脂肪干細(xì)胞可以有助于提高個體的睪酮濃度，原因可能是脂肪干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)骨骼與睪酮間關(guān)聯(lián)的形成， 導(dǎo)致血清中的睪酮濃度上升。雌二醇Estradiol)雌二醇是一種留體雌激素。女性雌二醇是主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。其主要作用為①促使子宮內(nèi)膜增生；②增強(qiáng)子宮平滑肌的收縮；③促使乳腺導(dǎo)管發(fā)育增生；；④抗雄激素作用；⑤降低血中膽固醇，增加鈣在骨中的沉著。在本發(fā)明中，當(dāng)個體為女性時，且Rf > 5%時，則該指標(biāo)有效，其中，Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸后血清中雌二醇濃度，RfO為回輸結(jié)束前雌二醇濃度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體脂肪干細(xì)胞可以有助于提高個體的雌二醇濃度，達(dá)到抗衰老的效果。隨著年齡的衰老，雌二醇呈下降趨勢，而LH作為雌二醇的負(fù)反饋是上升的，如果雌二醇升高，可使LH下降，達(dá)到抗衰老目的.本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(1)安全抽取血清對少量指標(biāo)進(jìn)行檢測，無副作用；(2)便捷在一個小時內(nèi)就可以作出脂肪干細(xì)胞抗衰老的效果的評價；(3)準(zhǔn)確維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、雌二醇、睪酮等可以作為評價脂肪干細(xì)胞抗衰老的重要指標(biāo)，血清檢測學(xué)方法成熟可靠。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例1基質(zhì)血管組分(SVF)的獲得1.獲得脂肪組織
用75%的酒精擦拭裝脂肪組織的容器外壁，無菌針管從人體吸取脂肪組織，Ih內(nèi)將其移至接收容器內(nèi)。2.分裝脂肪組織每一個培養(yǎng)瓶分裝脂肪組織為50ml，用IOml移液管在脂肪采集瓶吸取下層紅色液體，棄掉，剩余的上層脂肪混勻后進(jìn)行分裝。3.洗滌脂肪組織除去血細(xì)胞向培養(yǎng)瓶中加入IOOml氯化鈉注射液，擰緊蓋子，劇烈晃動3分鐘以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3-5分鐘，使不同相分離，吸去下層水相；重復(fù)以上操作三次，直到下層液較為清澈。4.膠原酶I消化加入等量新配制的預(yù)熱(提前半小時于37°C的氣浴搖床預(yù)熱)的膠原酶I溶液， 封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10秒，置于振動氣浴鍋中，370C，70rpm,消化60分鐘，每隔 15分鐘劇烈晃動培養(yǎng)瓶5-10秒，直到看起來較為平滑。5.分離基質(zhì)血管組分(SVF)將消化后的組織用無菌40目濾網(wǎng)分裝到50ml的離心管中，室溫400g離心10分鐘，得到的沉淀即為SVF。6.凈化沉淀離心后，SVF沉積于離心管底部，用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液。需要在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細(xì)胞。用適量的生理鹽水重懸細(xì)胞，吹散，在室溫下400g離心10分鐘。IOml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后將細(xì)胞匯總到50ml 離心管中，過100目篩，再次室溫300g離心10分鐘，得到經(jīng)凈化的SVF沉淀。實(shí)施例2脂肪干細(xì)胞種植和培養(yǎng)1.細(xì)胞種植離心后的SVF加20ml培養(yǎng)基，并充分混勻，根據(jù)培養(yǎng)瓶的面積，用基于組織塊法進(jìn)行細(xì)胞種植，按照每平方厘米接種0. 16ml抽脂得到的脂肪量進(jìn)行接種，每IOOml脂肪組織， 最終可以接種8個T75培養(yǎng)瓶。2.原代細(xì)胞培養(yǎng)將平置的培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37士0.5°C，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5士0.2%。原代培養(yǎng)第M小時，進(jìn)行全量換液。此后每隔3天全量換液，放置二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。3.原代細(xì)胞收獲7天左右，原代培養(yǎng)的細(xì)胞克隆團(tuán)的面積百分比到達(dá)70% _80%，消化收獲。在培養(yǎng)瓶中加入消化酶(消化酶為0. 125% Trypsin-O. 01% EDTA溶液，使用前室溫放置 15min,每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化時間為1. 5min,加入培養(yǎng)基^iil，反復(fù)吹打瓶底至細(xì)胞大部分脫落，移入50ml離心管中，原培養(yǎng)瓶中加入5ml氯化鈉注射液，并沖洗瓶壁， 將洗液加入離心管中定容至50ml，移液管吹打懸浮，100 μ m無菌濾網(wǎng)過濾，將過濾液收集到50ml離心管中，lOOOrpm，IOmin離心。4.原代細(xì)胞傳代
觀察單個離心管內(nèi)余下細(xì)胞沉淀量，適當(dāng)合并數(shù)個離心管中細(xì)胞沉淀至1個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細(xì)胞，定容至30ml，吹打混勻，取樣計數(shù)。計數(shù)后 lOOOrpm，IOmin二次離心。去除上清液，在離心管中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細(xì)胞， 定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代的細(xì)胞密度為5000-6000個/cm2，即(3. 75-4. 5) X IO5 個細(xì)胞/T75，按照4. 5 X IO5個細(xì)胞/T75進(jìn)行傳代，并置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37 士 0. 5 °C，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5 士 0. 2 %，培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)85% -90%。經(jīng)上述方法分離的細(xì)胞得率為5X IO5-I X IO6個/ml脂肪。培養(yǎng)第7天，Pl代細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)可以達(dá)到1-2倍，培養(yǎng)第14天，P2代細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)可以達(dá)到4-6倍，培養(yǎng)第21天，P3代細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)可以達(dá)到10倍。實(shí)施例3抗原標(biāo)記檢測分別將SVF和培養(yǎng)后的脂肪干細(xì)胞收集到離心管中，細(xì)胞懸液調(diào)整密度為 1 X KfmL-1，800rpm(120g)，離心5min，棄上清，用4°C的冷D-Hanks沖洗重懸細(xì)胞，再次將細(xì)胞懸液以800rpm，離心5min，之后棄去上清。然后用D-Hanks將細(xì)胞重懸至lmL，加入抗體 5 μ 1，避光，冰上放置30min。用D-Hanks沖洗，離心，棄上清，重復(fù)該沖洗過程2次，確保將未結(jié)合抗體除凈最后，加入約200 μ 1的D-Hanks制成懸液，用流式細(xì)胞儀檢測。加入的抗體分別為人抗CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD34、CD45、CD34、Actin 和HLA-DR。抗原檢測結(jié)果見表1。表1
原細(xì)胞CD29CD73CD49dCD90CD14CD45CD34ActinHLA-DRSVF36%68. 7%93. 8%69%4. 5%10. 5%77. 8%2. 2%41%培養(yǎng)后的干細(xì)胞99. 1%98. 5%99%97. 6%1. 7%0%2. 9%2. 3%1. 3%表明通過流式細(xì)胞儀對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原標(biāo)記表達(dá)的分析，新鮮分離的SVF中混合細(xì)胞較多(見圖1)，其中含有10. 5%的⑶45 ( —種典型的造血干細(xì)胞表面抗原)，77.8%的(一種已知位于白細(xì)胞表面的典型抗原)。而經(jīng)過培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞(見圖2)純度非常高，基本上都是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，例如99. 具有CD^表面抗原(公認(rèn)的脂肪干細(xì)胞特異性抗原)，98. 5%具有CD73 (公認(rèn)的脂肪干細(xì)胞特異性抗原)，而具有CD14， ⑶4，⑶34抗原的細(xì)胞極少。實(shí)施例4脂肪干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)1.將培養(yǎng)的干細(xì)胞以1.5X IO5每孔的密度接種在六孔板中，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。 具體方法是向基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)中加入終濃度分別為lymol/L地塞米松、10 μ mol/L胰島素、200 μ mol/L吲哚美辛和0. 5mmol/L的異丁基甲基黃嘌呤，配制成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣本為成脂分化實(shí)驗(yàn)陰性對照組。每周換2次液，直到進(jìn)行成脂染色觀察為止，以上組均做平行實(shí)驗(yàn)(n = 3)。2.油紅0染色先小心輕緩倒去培養(yǎng)液，用D-hanks輕緩漂洗，加10 %中性甲醛固定細(xì)胞膜 30min。加入0.5%油紅0(六孔板加1.5ml)，染色I(xiàn)h左右。3.脫色，75%酒精/60%異丙醇漂洗，除去多余的染料。4.復(fù)染，淡蘇木染色lmin，PBS漂洗。5.甘油明膠封片，顯微鏡觀察每組樣本隨機(jī)選取5-10個視野進(jìn)行拍照觀察以考察共培養(yǎng)方法的成脂誘導(dǎo)分化效果。脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無色。6.結(jié)果圖3顯示了分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為脂肪細(xì)胞的能力。圖3A顯示在成脂誘導(dǎo)劑作用下，脂肪干細(xì)胞能夠生成脂質(zhì)。圖;3B為成脂實(shí)驗(yàn)的陰性對照，表明在沒有成脂誘導(dǎo)劑的作用下，脂肪干細(xì)胞不能夠自發(fā)生成脂質(zhì)(大量密集在一起的小脂滴)。實(shí)施例5脂肪的干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)1.成骨細(xì)胞分化胰酶消化培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞后，以IX 105ml密度接種傳代，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Id后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基DMEM/10 % FBS, 0. 1 μ mo/L地塞米松，50 μ mo/L維生素C，IOmmol/β -甘油磷酸鈉，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；每3d更換培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。2.茜素紅染色細(xì)胞以PBS洗滌2次，4%甲醛固定，1 %茜素紅染色I(xiàn)Omin，沖洗，干燥，封片。3.觀察每組樣本隨機(jī)選取5-10個視野進(jìn)行拍照觀察以考察成骨誘導(dǎo)分化效果。利用沉積的鈣于茜素紅可以發(fā)生顯色反應(yīng)，誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色，可見細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。4.結(jié)果圖4顯示了分離和培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有分化為骨的能力.圖4A顯示脂肪干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑作用下，經(jīng)茜素紅染色，可見細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。圖4B顯示成骨實(shí)驗(yàn)的陰性對照，在沒有成骨誘導(dǎo)劑的作用下，脂肪干細(xì)胞不能夠自發(fā)成骨。實(shí)施例6脂肪干細(xì)胞抗衰老評價1.將經(jīng)培養(yǎng)和鑒定的脂肪干細(xì)胞細(xì)胞注入30ml生理鹽水，制備成細(xì)胞懸液，以備回輸使用。2.三次靜脈回輸脂肪干細(xì)胞分離當(dāng)天，進(jìn)行第一次回輸，干細(xì)胞回輸總量為2X107個； 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)至第30天，進(jìn)行第二次回輸，干細(xì)胞回輸總量為2 X IO7個；
脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)至第90天，進(jìn)行第三次回輸，干細(xì)胞回輸總量為2X107個。4.回輸前以及回輸后的第一個月，第三個月分別用常規(guī)方法或市售檢測試劑盒進(jìn)行血清學(xué)檢測。其中部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果見表2。表 權(quán)利要求
1.一種脂肪干細(xì)胞抗衰老的評價體系，其特征在于，對回輸了脂肪干細(xì)胞的個體，在回輸結(jié)束一段時間后進(jìn)行血清學(xué)檢測，所述的血清學(xué)檢測包括檢測選自下組的一個或多個指標(biāo)維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇；(a)當(dāng)Ra彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中， Ra= (Ral-RaO)+RaO X 100%，式中，Ral為個體回輸后血清中的維生素D濃度，RaO為回輸結(jié)束前的維生素D濃度；(b)當(dāng)Rb彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中， Rb= (Rbl-RbO)+RbO X 100%，式中，Rbl為個體回輸后血清中的高密度脂蛋白濃度，RbO為回輸結(jié)束前的高密度脂蛋白濃度；(c)當(dāng)Rc時，則該指標(biāo)有效，其中， Rc= (RcO-Rcl)+RcOX 100%，式中，RcO為回輸結(jié)束前的低密度脂蛋白濃度，Rcl為個體回輸后血清中的低密度脂蛋白濃度；(d)當(dāng)當(dāng)Rd彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中， Rd= (Rdl-RdO)+RdOX 100%，式中，Rdl為個體回輸后血清中促甲狀腺激素的濃度，RdO為回輸結(jié)束前促甲狀腺激素的濃度；(e)當(dāng)個體是男性時，且當(dāng)Re> 5%時，則該指標(biāo)有效，其中， Re= (Rel-ReO)+ReOX 100%，式中，Rel為個體回輸后血清中的睪酮的濃度，ReO為回輸結(jié)束前的睪酮的濃度；(f)當(dāng)個體是女性時，且當(dāng)Rf彡5%時，則該指標(biāo)有效，其中， Rf= (Rfl-RfO) RfO X 100%,式中，Rfl為個體回輸后血清中的雌二醇的濃度，RfO為回輸結(jié)束前的雌二醇的濃度； 并且，當(dāng)所述指標(biāo)中至少一個指標(biāo)為有效時，則表示所述脂肪干細(xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
2.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，所述的回輸結(jié)束前，包括回輸開始之前、回輸過程中以及回輸結(jié)束時。
3.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，所述的一段時間為>1個月。
4.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，所述的回輸?shù)闹靖杉?xì)胞為培養(yǎng)0-90 天的脂肪干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Ra> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
6.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Rb> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
7.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Rc> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
8.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Rd> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
9.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Re> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述男性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
10.如權(quán)利要求1所述的評價體系，其特征在于，當(dāng)Rf> 10%時，提示回輸?shù)闹靖杉?xì)胞在所述女性個體中產(chǎn)生抗衰老效果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種自體脂肪干細(xì)胞抗衰老效果的評價體系，包括對回輸了脂肪干細(xì)胞的個體，在回輸結(jié)束一段時間后進(jìn)行血清學(xué)檢測，其中血清學(xué)檢測包括選自下組的一個或多個指標(biāo)維生素D、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、促甲狀腺激素、睪酮、雌二醇。用本發(fā)明的評價體系能夠客觀地對脂肪干細(xì)胞的抗衰老的效果進(jìn)行評價，并且具有準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/96GK102486475SQ20111030161
公開日2012年6月6日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者呂偉麟, 張麗, 張炳強(qiáng), 張露億, 曹衛(wèi) 申請人:臻景生物技術(shù)(上海)有限公司, 臻景生物技術(shù)(無錫)有限公司